專利名稱：：阿耳茨海默病特異性的erk1/erk2磷酸化比率改變-阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在受試者中診斷阿耳茨海默病或證實(shí)阿耳茨海默病存在與否的方法。本發(fā)明還涉及篩選適用于開(kāi)發(fā)能夠治療或預(yù)防阿耳茨海默病的治療劑的先導(dǎo)化合物的方法。本發(fā)明還涉及在受試者中診斷阿耳茨海默病的方法，該方法包括用蛋白激酶C活化劑刺激后檢測(cè)細(xì)胞中特定磷酸化MAP激酶蛋白比率的改變。本文所述的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記(ADSMB)可用于診斷阿耳茨海默病、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)程以及篩選鑒別先導(dǎo)化合物的方法。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞內(nèi)鈣平衡的破壞，氧化應(yīng)激水平的提高，以及導(dǎo)致興奮性毒性和神經(jīng)元死亡的炎癥機(jī)制，被認(rèn)為是阿耳茨海默病(AD)的病理學(xué)原因(Ito等，1994，Putney，2000;Yoo等，2000;Sheehan等，1997;DeLuigi等，2001;Anderson等，2001;Remarque等，2001)。采用緩激肽作為刺激劑，研究了細(xì)胞內(nèi)Ca^水平和其它細(xì)胞過(guò)程的許多AD-相關(guān)的異常。一種有效的炎癥介質(zhì)一緩激肽在病理生理?xiàng)l件如創(chuàng)傷、中風(fēng)、疼痛、缺血和哮喘時(shí)由腦和外周細(xì)胞產(chǎn)生(Regoli等，1993;Bockmann&Paegelow，2000;Ellis等，1989;Kamiya等，1993)。通過(guò)作用于B2緩激肽受體(BK2bR)，--種G-蛋白偶聯(lián)受體，BK通過(guò)影響磷脂酶C(PLC)的活性啟動(dòng)磷脂酰肌醇(P:)的轉(zhuǎn)化，從而形成三磷酸1,4,5-肌醇(IP3)，提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+從IP3-敏感儲(chǔ)庫(kù)釋放(Noda等，1996;Venema等，1998;Wassdal等，1999;Cruzblanca等，1998;Ricupero等，1997;Pascale等，1999)。經(jīng)相同的通路，BK還通過(guò)活化有絲分裂原激活蛋白(MAP)激酶啟動(dòng)其它致炎因子的產(chǎn)生(Hayashi等，2000;Schwaninger等，1999;Phagoo等，2001)。AD腦以及AD外周細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca^水平響應(yīng)緩激肽的刺激和K+通道的失活而顯著升高(Etcheberrigaray等，1993，1998;Hirashima等，1996;Gibson等，1996(a))。BK2bR活化后剌激PLC也可導(dǎo)致甘油二酯的產(chǎn)生，伴隨著細(xì)胞內(nèi)CaK平升高，激活蛋白激酶C(PKC)亞型。BK-活化的PLC/磷脂-CaPKC級(jí)聯(lián)反應(yīng)與:Ras/Raf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相互作用，激活細(xì)胞外信號(hào)-調(diào)節(jié)激酶1/2(Erk1和Erk2，統(tǒng)稱為"Erkl/2")，MAP激酶家族的亞型(Berridge,1984;BAssa等，1999;Hayashi等，2000;Blaukat等，2000，Zhao等，NeurobiologyofDisease11，166-183，2002)。Erkl/2接受來(lái)自多重信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的信號(hào)，通過(guò)許多轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)，引起細(xì)胞增殖和分化，這些轉(zhuǎn)錄因子包括AP-1、NF-kB和壞磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)。作為主要激酶之一，Erk2磷酸化tau蛋白的多個(gè)絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)，包括絲氨酸-262和絲氨酸-356(Reynolds等，1993;Lu等，1993)。此外，不同的實(shí)驗(yàn)室都發(fā)現(xiàn)，PKC-活化的MAP激酶和BK受體相關(guān)通路能夠調(diào)節(jié)淀粉樣前體蛋白(sAPP)可溶形式的形成與分泌(Desdouits-Magnen等，1998;Gasparini等，2001;Nitsch等，1994，1995，1996，1998)。這些發(fā)現(xiàn)提示，BK-相關(guān)的sAPP加工可能與PKC-MAP激酶通路有關(guān)。另一方面，病理學(xué)狀態(tài)如病毒感染、氧化應(yīng)激升高、APP異常表達(dá)以及暴露亍AP卩可導(dǎo)致MAP激酶活化(Rodems&Spector，1998;McDonald等，1998;Ekinci等，1999;Grant等，1999)且tau磷酸化提高(Greenberg等，1994;Ekinci&Shea，1999;Knowles等，1999)。這些結(jié)果暗示AD發(fā)病機(jī)制中MAP激酶仏—''丄轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的紊亂。有絲分裂原活化蛋白激酶(例如Erkl和Erk2)調(diào)節(jié)微管相關(guān)蛋白tau的磷酸化以及淀粉樣蛋白卩的加工過(guò)程，兩者都是阿耳茨海默病病理生理學(xué)的關(guān)鍵事件。在家族性和散發(fā)性阿耳茨海默病的成纖維細(xì)胞中都檢測(cè)到響應(yīng)緩激肽的Erkl/2磷酸化水平升高和延長(zhǎng)，只是沒(méi)有年齡匹配的對(duì)照(Zhao等，NeurobiologyofDiseasell，166-183，2002)。過(guò)去已在阿耳茨海默病成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)緩激肽誘導(dǎo)的持續(xù)的Erkl/2磷酸化，如WO02/067764中所述，該專利的內(nèi)容以整體參見(jiàn)的方式引入本說(shuō)明書(shū)中。需要高度靈敏且高度特異性的試驗(yàn)來(lái)診斷阿耳茨海默病和篩選適用于治療和預(yù)防阿耳茨海默病的化合物。本發(fā)明首次鑒定了獨(dú)特的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記，與過(guò)去已知的診斷試驗(yàn)相比，該物質(zhì)能夠以高度靈敏和高度特異性的方式用于阿耳茨海默病的診斷。因此，本文所述獨(dú)特的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記成為檢測(cè)和診斷阿耳茨海默病的高靈敏度和高特異性的診斷方法的基礎(chǔ)。本發(fā)明獨(dú)特的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記在鑒定適合用作治療和預(yù)防阿耳茨海默病的治療劑的化合物的篩選方法中也是有用的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及確定或證實(shí)受試者中阿耳茨海默病存在與否的方法。在某些實(shí)施方式中，該方法包括使來(lái)自受試者的細(xì)胞與淀粉樣I3肽接觸并測(cè)定所述接觸步驟是否在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)阿耳茨海默病表型；如果所述接觸步驟在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)了阿耳茨海默病表型，則表明或預(yù)示所述受試者不存在阿耳茨海默病。在某些實(shí)施方式中，如果與所述淀粉樣卩肽孵育導(dǎo)致所述細(xì)胞中阿耳茨海默病表型無(wú)顯著改變或變化，則表明或預(yù)示所述受試者中存在阿耳茨海默病。阿耳茨海默病表型無(wú)顯著改變或變化，是指阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值與細(xì)胞接觸所述淀粉樣卩肽之前的值相比沒(méi)有變化，或者所述阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值與細(xì)胞接觸所述淀粉樣卩肽之前的值相比，改變或變化小于約15%,或小于約14%,或小于約13%，或小于約12%，或小于約11%，或小于約10%,或小亍約9%，或小亍約8%，或小亍約7%，或小于約6%，或小于約5%，或小于約4%，或小于約3%，或小于約2%，或小于約1%或小于約0.5%，或小于約0.25%。在某些實(shí)施方式中，淀粉樣p肽是Ap(l-42)，雖然也可使用其它淀粉樣卩肽。在另一些實(shí)施方式中，所述方法包括使所述細(xì)胞與蛋白激酶C活化劑相接觸。在又一些實(shí)施方式中，所述蛋白激酶C活化劑選自緩激肽、苔蘚抑素、鈴蟾肽、膽囊收縮素、凝血酶、前列腺素F2(X和加壓素。在又-'些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是外周細(xì)胞。在又一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞選自成纖維細(xì)胞、唾液、血液、尿液、皮膚細(xì)胞、頰粘膜細(xì)胞和腦脊液。本文所述的所有方法可以體內(nèi)或體外進(jìn)行。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明方法體外進(jìn)行。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，如果阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值是大亍零的正值，則在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)阿耳茨海默病表型。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式涉及確定或證實(shí)受試者中不存在阿耳茨海默病的方法，所述方法包括使來(lái)自受試者的細(xì)胞與A(3(l-42)接觸；使所述細(xì)胞與緩激肽接觸；測(cè)定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值；如果所述阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值是大于零的正值，則表明或預(yù)示所述受試者中不存在阿耳茨海默病。在某些實(shí)施方式中，如果與所述淀粉樣(3肽孵育沒(méi)有導(dǎo)致所述細(xì)胞阿耳茨海默病表型顯著改變或變化，則表明或預(yù)示所述受試者中存在阿耳茨海默病。阿耳茨海默病表型無(wú)顯著改變或變化，是指阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值與細(xì)胞接觸所述淀粉樣卩肽之前的值相比沒(méi)有變化，或者所述阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值與細(xì)胞接觸所述淀粉樣P肽之前的值相比，改變或變化小于約15%，或小于約14%，或小于約13%，或小于約12%，或小于約11%，或小亍約10%，或小于約9%，或小于約8%，或小于約7%，或小亍約6%，或小于約5%，或小亍約4%，或小于約3%或小于約2%，或小亍約1%或小于約0.5%，或小亍約0.25%。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是外周細(xì)胞。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞選自成纖維細(xì)胞、唾液、血液、尿液、皮膚細(xì)胞、頰粘膜細(xì)胞和腦脊液。本發(fā)明還涉及鑒別適用亍治療阿耳茨海默病的先導(dǎo)化合物的方法，所述方法包括使非阿耳茨海默細(xì)胞與淀粉樣|3肽接觸，使同一細(xì)胞與蛋白激酶C活化劑接觸，再使細(xì)胞與試驗(yàn)化合物相接觸，測(cè)定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，淀粉樣P肽是A(3(l-42)，雖然也可使用其它淀粉樣卩肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，非阿耳茨海默細(xì)胞選自成纖維細(xì)胞、唾液、血液、尿液、皮膚細(xì)胞、頰粘膜細(xì)胞和腦脊液。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白激酶C活化劑選自緩激肽、苔蘚抑素、鈴蟾肽、膽囊收縮素、凝血酶、前列腺素F2cx和加壓素。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，如果阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記值小于未與試驗(yàn)化合物接觸的來(lái)自對(duì)照細(xì)胞的類似分子生物標(biāo)記的值，則阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值指示了該化合物適用于治療阿耳茨海默病。在優(yōu)選實(shí)施方式中，對(duì)照細(xì)胞與淀粉樣(3肽相接觸。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，淀粉樣卩肽是A卩(l-42)，雖然也可使用其它淀粉樣(3肽。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)照細(xì)胞與蛋白激酶C活化劑接觸。在某些實(shí)施方式中，提供了鑒別適用于治療阿耳茨海默病的先導(dǎo)化合物的方法，該方法還包括對(duì)已鑒別適用于治療阿耳茨海默病的化合物進(jìn)行修飾，與未經(jīng)修飾的化合物的安全性和有效性相比，優(yōu)化或改善其安全性和有效性的步驟。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所鑒別的修飾的化合物適用于治療阿耳茨海默病。本發(fā)明還描述了治療阿耳茨海默病的方法，該方法包括給予需要的受試者療有效量修飾的化合物。本發(fā)明還涉及鑒別適用于治療阿耳茨海默病的化合物的方法，該方法包括使非阿耳茨海默對(duì)照細(xì)胞與AP(l-42)相接觸，雖然也可使用其它淀粉樣(3肽，使同一對(duì)照細(xì)胞與緩激肽接觸，再使對(duì)照細(xì)胞匈試驗(yàn)化合物相接觸，確定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值以鑒別適用于治療阿耳茨海默病的化合物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在受試者中診斷阿耳茨海默病的方法，該方法包括以下步驟使來(lái)自受試者的細(xì)胞與蛋白激酶C活化劑相接觸并測(cè)定細(xì)胞中特定磷酸化MAP激酶蛋白的比率，從而在受試者中診斷阿耳茨海默病。在優(yōu)選實(shí)施方式中，特定磷酸化MAP激酶蛋白的比率是兩種磷酸化MAP激酶蛋白間的比率。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的診斷方法包括體外試驗(yàn)。在診斷方法另一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，特定磷酸化MAP激酶蛋白互為序列變異體，且屬于同一蛋白質(zhì)家族。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，特定磷酸化MAP激酶蛋白的比率是磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比率，將標(biāo)準(zhǔn)化后的磷酸化Erkl量除以標(biāo)準(zhǔn)化后的磷酸化Erk2量計(jì)算得到。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白激酶C活化劑選自緩激肽，苔蘚抑素，鈴蟾肽，膽囊收縮素，凝血酶，前列腺素F2a和加壓素。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，診斷分析中所用細(xì)胞是外周細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方式「I、細(xì)胞是皮膚細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、血液細(xì)胞或頰粘膜細(xì)胞。在某些實(shí)施方式|::K細(xì)胞不是從腦脊液分離的。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞不包括腦脊液。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞不是腰椎穿刺得到的。在診斷方法的某些實(shí)施方式中，蛋白激酶C活化劑與細(xì)胞在包含血清的培養(yǎng)基中接觸。在本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白激酶C活化劑與所述細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中接觸。在本發(fā)明診斷方法的某些實(shí)施方式中，免疫分析法檢測(cè)磷酸化MAP激酶蛋白。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，免疫分析可以是放射免疫分析、蛋白質(zhì)印跡分析、免疫熒光分析、酶免疫分析、免疫沉淀分析、化學(xué)發(fā)光分析、免疫組織化學(xué)分析、免疫電泳分析、斑點(diǎn)印跡分析、或狹縫印跡分析。在本發(fā)明診斷方法其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，診斷方法采用蛋白芯片或肽芯片或蛋白微陣列芯片。在某些實(shí)施方式中，如果用本文所述的任意診斷方法表明阿耳茨海默病的陰性診斷結(jié)果(即沒(méi)有或缺乏預(yù)示存在阿耳茨海默病的結(jié)果)，可采用本文所述旨在確定不存在阿耳茨海默病的診斷方法進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證診斷方法。這種驗(yàn)證診斷方法可與本文所述的任意診斷方法平行進(jìn)行或隨后進(jìn)行。同樣地，如果采用本文所述的任意診斷方法指示阿耳茨海默病陽(yáng)性診斷結(jié)果(即結(jié)果表明存在阿耳茨海默病)，則采用本文所述的旨在確定存在阿耳茨海默病的診斷方法進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證診斷方法。這種驗(yàn)證診斷方法可與本文所述的任意診斷方法平行進(jìn)行或隨后進(jìn)行。在本發(fā)明診斷方法的某些實(shí)施方式中，通過(guò)以下過(guò)程診斷受試者的阿耳茨海默病使來(lái)自受試者的細(xì)胞與蛋白激酶C活化劑接觸，然后測(cè)定磷酸化第一MAP激酶蛋白與磷酸化第二MAP激酶蛋白的比率，其中磷酸化第一和磷酸化第二MAP激酶蛋白是由細(xì)胞與蛋白激酶c活化劑接觸之后獲得的。在本發(fā)明診斷方法的另一些實(shí)施方式中，測(cè)定了未與蛋白激酶c活化劑接觸的受試者的細(xì)胞中磷酸化第--MAP激酶蛋白與磷酸化第二MAP激酶蛋白的比率，從與蛋白激酶C活化劑接觸之后細(xì)胞中磷酸化第一和第二MAP激酶蛋白的比率中減去上述比率，基于比率差值診斷受試者中阿耳茨海默病的存在。在本發(fā)明診斷方法優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果比率差值為正值，則該差值可用于診斷受試者的阿耳茨海默病。在本發(fā)明診斷方法的其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果差值為負(fù)值或零，則所述差值可用于診斷受試者中不存在阿耳茨海默病。本發(fā)明的某些實(shí)施方式涉及用于診斷受試者的阿耳茨海默病的試劑盒。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，試劑盒包含蛋白激酶C活化劑；在本發(fā)明的另^些實(shí)施方式中，試劑盒包含磷酸化第一MAP激酶遺白特異性抗體。在本發(fā)明的又一些實(shí)施方式中，試劑盒可包含磷酸化第二MAP激酶蛋白特異性抗體。在優(yōu)選實(shí)施方式中，試劑盒可包含.一.ll述物質(zhì)的任意組合。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，用于診斷受試者的阿耳茨海默病的試劑盒可包含一種或多種選自'F組的蛋白激酶C活化劑緩激肽、苔蘚抑素、鈴蟾肽、膽囊收縮素、凝血酶、前列腺素F2cc和加壓素。在優(yōu)選實(shí)施方式中，試劑盒可包含......t二述物質(zhì)的組合。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，用于診斷受試者的阿耳茨海默病的試劑盒可包含磷酸化Erkl或磷酸化Erlc2或兩者的特異性抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，試劑盒可包含抗磷酸-Erkl抗體。在本發(fā)明另--些優(yōu)選的實(shí)施方式中，試劑盒可包含抗磷酸-Erk2抗體。在優(yōu)選實(shí)施方式中，試劑盒可包含上述物質(zhì)的任意組合。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，用于診斷阿耳茨海默病的試劑盒還可包含淀粉樣P肽。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，淀粉樣卩肽是A(3(l-42)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，用亍診斷受試者中阿耳茨海默病存在與否的試劑盒包含淀粉樣P肽；磷酸化第一MAP激酶蛋白特異性抗體；和磷酸化第二MAP激酶蛋白特異性抗體。在優(yōu)選實(shí)施方式中，淀粉樣(3肽是A|3(l-42)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，試劑盒可包含.....匕述物質(zhì)的任意組合。本發(fā)明的某些實(shí)施方式涉及篩選適用于治療或預(yù)防阿耳茨海默病的試驗(yàn)化合物(或先導(dǎo)化合物)的方法，該方法包括使從診斷患有阿耳茨海默病的受試者分離的細(xì)胞與蛋白激酶c活化劑相接觸，其中，所述接觸步驟在試驗(yàn)化合物(或先導(dǎo)化合物)的存在下進(jìn)行；測(cè)定磷酸化第一MAP激酶蛋白與磷酸化第二MAP激酶蛋白的比率，其中，磷酸化第一和磷酸化第二MAP激酶蛋白是在接觸后從細(xì)胞獲得的；測(cè)定未與試驗(yàn)化合物(或先導(dǎo)化合物)接觸的受試者的細(xì)胞中磷酸化第一MAP激酶蛋白與磷酸化第二MAP激酶蛋白的比率；將在試驗(yàn)化合物的存在下進(jìn)行接觸步驟所得比率減去試驗(yàn)化合物(或先導(dǎo)化合物)不存在時(shí)進(jìn)行接觸步驟得到的比率；以及基亍比率差值鑒別適用于治療阿耳茨海默病的試驗(yàn)化合物(或先導(dǎo)化合物)。在篩選適用于治療或預(yù)防阿耳茨海默病的試驗(yàn)化合物(或先導(dǎo)化合物)的方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，如果差值為負(fù)值或零，則計(jì)算的比率差值指示了適用于治療阿耳茨海默病的試驗(yàn)化合物(或先導(dǎo)化合物)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及篩選適用于治療或預(yù)防阿耳茨海默病的試驗(yàn)化合物(或先導(dǎo)化合物)的方法，其中，所述方法包括體外試驗(yàn)。在篩選適用亍治療或預(yù)防阿耳茨海默病的試驗(yàn)化合物(或先導(dǎo)化合物)的方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，第-MAP激酶蛋白是Erkl，第二MAP激酶H白是Erk2。在本發(fā)明另一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，將標(biāo)準(zhǔn)化后的磷酸化Erkl量除以標(biāo)準(zhǔn)化后的磷酸化Erk2量來(lái)計(jì)算比率。在本發(fā)明另一些實(shí)施方式中，蛋白激酶C活化劑選自緩激肽，苔蘚抑素，鈴蟾肽，膽囊收縮素，凝血酶，前列腺素F2a和加壓素。在本發(fā)明另些實(shí)施方式中，細(xì)胞是外周細(xì)胞。在本發(fā)明的又-些實(shí)施方式中，外周細(xì)胞選自皮膚細(xì)胞，皮膚成纖維細(xì)胞、血液細(xì)胞和頰粘膜細(xì)胞。在本發(fā)明又--些實(shí)施方式中，細(xì)胞不是從腦脊液分離的。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞不包括腦脊液。在另-些優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞不是腰椎穿刺得到的。在本發(fā)明又一些實(shí)施方式中，蛋白激酶C活化劑與所述細(xì)胞在包含血清的培養(yǎng)基中接觸。在本發(fā)明另-些實(shí)施方式中，蛋白激酶C活化劑與所述細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中接觸。在本發(fā)明的又一些實(shí)施方式中，用免疫分析測(cè)定磷酸化MAP激酶蛋白。在本發(fā)明的又一些實(shí)施方式中，免疫分析是放射免疫分析、蛋白質(zhì)印跡分析、免疫熒光分析、酶免疫分析、免疫沉淀分析、化學(xué)發(fā)光分析、免疫組織化學(xué)分析、免疫電泳分析、斑點(diǎn)印跡分析或狹縫印跡分析。在本發(fā)明的又-些實(shí)施方式中，檢測(cè)采用S白芯片、肽芯片或蛋白微陣列芯片進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及監(jiān)測(cè)受試者阿耳茨海默疾病進(jìn)程的方法，該方法包括測(cè)定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法包括在--個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在間隔至少六個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)，更優(yōu)選間隔至少12個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記數(shù)值降低(即正值減小)指示了所述受試者的阿耳茨海默病的發(fā)展。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及適用于治療阿耳茨海默病的組合物，其包含通過(guò)本文所述任一化合物篩選方法鑒別的化合物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物包括適合在需要的受試者中治療阿耳茨海默病的藥物組合物，其包含治療有效量的通過(guò)本文所述任一化合物篩選方法鑒別的化合物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及治療阿耳茨海默病的方法，該方法包括給予需要的受試者治療有效量本文所述的任一藥物組合物。圖1顯示了在來(lái)自Coriell細(xì)胞庫(kù)的建庫(kù)的皮膚成纖維細(xì)胞以及立即置亍組織培養(yǎng)基中解剖驗(yàn)證對(duì)象的皮膚穿刺活檢樣品中檢測(cè)阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記(ADSMB)的結(jié)果。AD指阿耳茨海默病細(xì)胞；混合的AD/PD/LBD指從同時(shí)患有阿耳茨海默病、帕金森病和/或Loewi軀千病的患者獲取的細(xì)胞；AC指非-癡呆的年齡匹配的對(duì)照細(xì)胞；非-ADD指從診斷為非-阿耳茨海默病癡呆(如亨廷頓病(Huntington)或帕金森病或臨床型精祌分裂癥)的受試者獲取的細(xì)胞。檢測(cè)的AD細(xì)胞中阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記是落在約0.02-0.4范圍內(nèi)的正值?；旌螦D/PD/LBD組中阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值聚集在非常低的;i]::::值范圍內(nèi)，即約為0.02-0.03。非-癡呆的年齡匹配的對(duì)照細(xì)胞中阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記為負(fù)值或非常低的正值，即小于約0.01。非-ADD細(xì)胞中阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記為負(fù)值。將用緩激肽刺激的細(xì)胞中磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比率減去用沒(méi)有緩激肽的培養(yǎng)基刺激的細(xì)胞中磷酸化EA1與磷酸化Erk2的比例的差值來(lái)確定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記。表示如下阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記=KpErkl/pErk2)緩激勝)-((pErld/pErk2)運(yùn)載體)。在Coriell細(xì)胞庫(kù)和解剖驗(yàn)證的細(xì)胞株中，對(duì)四類患者的ADSMB(在圖中以"區(qū)分因子"(D.F.)表示)作圖阿耳茨海默病(AD),混合的AD/PD/DLV(解剖驗(yàn)證診斷為同時(shí)患有阿耳茨海默病、帕金森病和Lew軀干病)，年齡匹配的對(duì)照(AC)以及非-AD癡呆(:帕金森病和亨廷頓病)圖2顯示了阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記隨癡呆年數(shù)的線性回歸分析。線性回歸顯示約-0.01的負(fù)斜率，表明癡呆年數(shù)與阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的正值負(fù)相關(guān)。隨著癡呆年數(shù)的增長(zhǎng)(即，阿耳茨海默病加重)，阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的正值降低。阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的測(cè)定實(shí)現(xiàn)了阿耳茨海默病的早期診斷，因?yàn)檎翟礁弑砻骷膊√庁≡缙?。將用緩激肽刺激的?xì)胞中磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比率減去用沒(méi)有緩激肽的培養(yǎng)基剌激的細(xì)胞中磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比例的差值來(lái)確定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記。表示如下阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記={(PErkl/pErk2)tt}-{(PErkl/pErk2)運(yùn)載休}。阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記(ADSMB)與解剖驗(yàn)證病例中疾病持續(xù)時(shí)間成線性回歸。阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記在疾病早期更有效。這就表明，本發(fā)明能更有效地實(shí)現(xiàn)阿耳茨海默病的早期診斷。圖3顯示了AD和對(duì)照細(xì)胞株用緩激肽(BK+)處理和運(yùn)載體(DMSO，不含緩激肽，BK-)處理后，p-Erld/2(磷酸化Erkl和Erk2)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。對(duì)于緩激肽處理(BK+)，37°C下用10nM緩激肽處理無(wú)血清(24小時(shí))細(xì)胞10分鐘。相應(yīng)地，對(duì)于運(yùn)載體處理(BK-),37。C下用相同量的DMSO(不含BK)處理無(wú)血清(24小時(shí))細(xì)胞10分鐘。10分鐘后，對(duì)亍AD細(xì)胞株，BK+的P-Erkl/2帶比BK-處理的要深，但在對(duì)照細(xì)胞株中相反。這就表明，在AD細(xì)胞株中BK誘導(dǎo)Erk的活化較高。圖4A和4B顯示了如本文所述計(jì)算的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記(ADSMB)(在圖中以"區(qū)分因子"(D.F.)表示)。在Coriell細(xì)胞庫(kù)(A)(Coriell醫(yī)學(xué)研究中心，Camden，新澤西州)和Neurologic公司提供的細(xì)胞株(解剖驗(yàn)證)(B)中，對(duì)AD(阿耳茨海默病)，AC(年齡匹配的對(duì)照)和非-ADD(非AD癡呆，如帕金森病，Lewy軀干病)細(xì)胞株的ADSMB作圖。結(jié)果表明，AD病例的ADSMB--貫地高于AC和非-ADD病例。圖5A和5B顯示，可溶性Ap誘導(dǎo)和苔蘚抑素處理逆轉(zhuǎn)人成纖維細(xì)胞的阿耳茨海默病表型。(A)如本文所述測(cè)定對(duì)照(非-AD)細(xì)胞株(AG07723，AG11363,AG09977,AG09555和AG09878)的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記(在圖中以"區(qū)分因子"(D.F.)表示)，數(shù)值較小或?yàn)樨?fù)值。1.0piMA|3-42處理后，再次測(cè)定ADSMB，發(fā)現(xiàn)數(shù)值變大且為正值。這就表明，1.0jiMAp(l-42)處理后，緩激肽誘導(dǎo)，活化的Erkl/Erk2比率變大。A(3(l-42)處理后AC細(xì)胞株的行為類似于AD表型。(B)在AC細(xì)胞株中，測(cè)定1.0^MA(3(l-42)處理24小時(shí)后的ADSMB("區(qū)分因子"(D.F.))。發(fā)現(xiàn)越早ADSMB的值越高且為正值。相同的細(xì)胞株先用1.0pMA卩(l-42)處理24小時(shí)再用0.1nM苔蘚抑素處理20分鐘。再次測(cè)定ADSMB(D.F.)值，數(shù)值較小且為負(fù)值。這就表明，可溶性A(3-誘導(dǎo)的變化被苔蘚抑素處理所逆轉(zhuǎn)。圖6A和6B顯示了ADSMB的決策矩陣分析。對(duì)生物標(biāo)記的靈敏度和特異性作圖，顯示在Coridl細(xì)胞庫(kù)(A)和解剖驗(yàn)證的細(xì)胞(B)中能有效檢測(cè)疾病。發(fā)明詳述在某些方面，本發(fā)明涉及在從經(jīng)鑒別用于試驗(yàn)和診斷的受試者獲取的人細(xì)胞中診斷阿耳茨海默病的方法。診斷是基于發(fā)現(xiàn)獨(dú)特的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記。在某些方面，本發(fā)明涉及監(jiān)測(cè)阿耳茨海默疾病進(jìn)程和篩選適用亍治療或預(yù)防阿耳茨海默病的先導(dǎo)化合物的方法。在某些方面，本發(fā)明涉及確定或證實(shí)受試者或從受試者獲取的樣品中阿耳茨海默病存在與否的方法。因?yàn)橹苯舆M(jìn)入人活體腦神經(jīng)元是不可能的，所以阿耳茨海默病的早期診斷極其困難。通過(guò)測(cè)定本文所述的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記，本發(fā)明提供高度實(shí)用、高特異性且高選擇性的阿耳茨海默病早期診斷試驗(yàn)。此外，本文所述的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記提供了監(jiān)測(cè)疾疾病進(jìn)程和鑒別旨在治療和預(yù)防阿耳茨海默病的藥物開(kāi)發(fā)的治療性藥劑的基礎(chǔ)。本發(fā)明采用外周(非-CNS)組織發(fā)現(xiàn)了阿耳茨海默病獨(dú)特的分子生物標(biāo)記，該分子生物標(biāo)記適用于阿耳茨海默病的高靈敏度和高特異性診斷的診斷分析。本發(fā)明的巨大優(yōu)點(diǎn)在于，本文所述試驗(yàn)和方法中所用組織可釆用最小侵入性方法從受試者獲取，即不使用腰椎穿刺。因此，本發(fā)明的一方面涉及用亍受試者阿耳茨海默病早期檢測(cè)的分析或測(cè)試，其中，在人細(xì)胞(例如皮膚成纖維細(xì)胞)或其它外周細(xì)胞(如血液細(xì)胞)中，用特異性抗體測(cè)定細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基產(chǎn)生應(yīng)答導(dǎo)致的蛋白激酶C活化劑(例如緩激肽)誘導(dǎo)的內(nèi)部控制的Erlcl磷酸化與Erk2磷酸化的比率，結(jié)果對(duì)基線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在本發(fā)明的方法中，從受試者或患者獲取的細(xì)胞可以是任何活細(xì)胞。優(yōu)選地，它們是皮膚成纖維細(xì)胞，本發(fā)明的試驗(yàn)中也可使用任何其它外周組織細(xì)胞(即中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的組織細(xì)胞)，如果這些細(xì)胞更容易獲取或加工。其它合適的細(xì)胞包括但不限亍血液細(xì)胞，例如紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，頰粘膜細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞如嗅神經(jīng)元，腦脊液，尿液及任何其它外周細(xì)胞類型。此外，用于比較目的的細(xì)胞不---定來(lái)自健康供體。細(xì)胞可以是新鮮獲取或培養(yǎng)的(參見(jiàn)美國(guó)專利6,107,050，其內(nèi)容以整體參見(jiàn)的方式引入本說(shuō)明書(shū)中)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，可采用皮膚穿刺活檢來(lái)獲取受試者的皮膚成纖維細(xì)胞。這些成纖維細(xì)胞可以用本文所述的技術(shù)直接進(jìn)行分析或者用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。然后如實(shí)施例和通篇說(shuō)明書(shū)中所述分析所得培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞。可能需要其它步驟來(lái)制備用于分析的其它類型的細(xì)胞，例如頰粘膜細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞如嗅細(xì)胞、血液細(xì)胞如紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等。例如，從外周靜脈取血可容易地獲得血液細(xì)胞。然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)操作(例如使用細(xì)胞分選儀、離心機(jī)等)進(jìn)行分離然后再測(cè)定。因此，在某些方面，本發(fā)明涉及用于診斷和治療受試者阿耳茨海默病的方法。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的診斷方法是基于測(cè)定來(lái)自用蛋白激酶C活化劑刺激的受試者的細(xì)胞中兩種具體特定磷酸化MAP激酶蛋白的比率。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及包含適用于檢測(cè)或診斷阿耳茨海默病的試劑的試劑盒。在某些方面，本發(fā)明涉及篩選用于鑒別適用于治療阿耳茨海默病的先導(dǎo)化合物的方法，以及以藥物制劑的形式使用這些化合物或先導(dǎo)化合物的化學(xué)衍生物在需要的受試者中治療或預(yù)防阿耳茨海默病的方法。I.定義如本文所用，在醫(yī)藥篩選和診斷內(nèi)容中使用的術(shù)語(yǔ)"靈敏度"是指，對(duì)亍要檢測(cè)的疾病產(chǎn)生陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果的患者的比例，即真實(shí)陽(yáng)性結(jié)果除以真實(shí)陽(yáng)性和假陰性結(jié)果之和，通常以百分比表示。如本文所用，在醫(yī)藥篩選和診斷內(nèi)容中使用的術(shù)語(yǔ)"特異性"是指，對(duì)于要檢測(cè)的疾病產(chǎn)生陰性試驗(yàn)結(jié)果的患者的比例，即真實(shí)陰性結(jié)果除以真實(shí)陰性和假陽(yáng)性結(jié)果之和，通常以百分比表示。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"高靈敏度"是指診斷方法的靈敏度大于或等于約50%,或約55%，或約60%，或約65%，或約70%，或約75%，或約80%，或約85%，或約90%，或約95%，或約96%，或約97%，或約98%，或約99%或約100%。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"高特異性"是指診斷方法的特異性大亍或等于約50%,或約55%，或約60%，或約65%，或約70%，或約75%，或約80%，或約85%，或約90%,或約95%，或約96%,或約97%，或約98%,或約99%或約100%。如本文所用，"先導(dǎo)化合物"是指采用本文所述化合物篩選方法鑒定的化合物。先導(dǎo)化合物具有將本文所述阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)于在本文所述試驗(yàn)中用標(biāo)準(zhǔn)健康細(xì)胞測(cè)定的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的計(jì)算值的活性?？梢噪S后對(duì)先導(dǎo)化合物經(jīng)化學(xué)修飾，以優(yōu)化或提高其在用亍治療或預(yù)防阿耳茨海默病的藥物組合物中的活性。如本文所用，"序列變體"是指結(jié)構(gòu)和功能上相互關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，序列變體是指氨基酸序列結(jié)構(gòu)類似且酶活性功能相同的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，序列變體是催化其它蛋白質(zhì)磷酸化的MAP激酶蛋白。如本文所用，"不存在阿耳茨海默病"是指受試者或來(lái)自受試者的細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)或測(cè)定到阿耳茨海默病表型。如本文所用，受試者或細(xì)胞樣品中的"阿耳茨海默病表型"包括但不限于具有大于零的正值的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記。如本文所用，"淀粉樣(3肽"是指任意淀粉樣卩肽的片段或全長(zhǎng)淀粉樣(3肽。II.診斷阿耳茨海默病的方法在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及診斷阿耳茨海默病的方法。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，診斷方法包括以下步驟從受試者獲取細(xì)胞樣品，使細(xì)胞樣品與蛋白激酶C活化劑接觸，和測(cè)定所述細(xì)胞樣品中特定磷酸化MAP激酶蛋白的比率，以診斷所述受試者的阿耳茨海默病。在某些具體的實(shí)施方式中，本文所述的診斷分析可體外或體內(nèi)進(jìn)行。在一具體的實(shí)施方式中，蛋白激酶c活化劑是緩激肽。在另一具體的實(shí)施方式中，特定磷酸化MAP激酶蛋白的比率是磷酸化Erld與磷酸化Erk2的比率，由相對(duì)的或標(biāo)準(zhǔn)化的磷酸化Erkl量除以標(biāo)準(zhǔn)化的磷酸化Erk2量計(jì)算得到。阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記本文所述診斷方法和篩選適用于治療阿耳茨海默病的化合物的方法是基于阿耳茨海默病獨(dú)特的分子生物標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)。阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的數(shù)值取決于一些變量，例如試驗(yàn)所用細(xì)胞、試驗(yàn)所用蛋白激酶C活化劑以及用于測(cè)定磷酸化比率的特定MAP激酶蛋白。在一具體的實(shí)施方式中，通過(guò)測(cè)定用蛋白激酶C活化劑刺激的細(xì)胞中磷酸化Erid與磷酸化Erk2的比率，并減去用沒(méi)有蛋白激酶C活化劑的對(duì)照溶液(運(yùn)載體)刺激的細(xì)胞中磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比率，確定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值。在某些實(shí)施方式中，如果差值大亍零，即為正值，則診斷為阿耳茨海默病。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果差值小于或等于零，則表示沒(méi)有阿耳茨海默病。在其它實(shí)施方式中，通過(guò)測(cè)定用蛋白激酶C活化劑刺激后兩種磷酸化MAP激酶蛋白的比率來(lái)確定本發(fā)明阿耳茨海默病特異性分于生物標(biāo)記的值。通過(guò)測(cè)定用蛋白激酶C活化劑剌激的細(xì)胞中第-磷酸化MAP激酶蛋白與第二磷酸化MAP激酶蛋白的比率，并減去用沒(méi)有蛋白激酶C活化劑的對(duì)照溶液(運(yùn)載體)剌激的細(xì)胞中第一磷酸化MAP激酶蛋白與第二磷酸化MAP激酶蛋白的比率，確定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，如果差值大于零，即為正值，則診斷為阿耳茨海默病。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果差值小于或等亍零，則表示沒(méi)有阿耳茨海默病。在某些實(shí)施方式中，從診斷為阿耳茨海默病的患者獲取的細(xì)胞樣品(AD細(xì)胞)中阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的數(shù)值為正。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，當(dāng)通過(guò)測(cè)定用緩激肽刺激的AD細(xì)胞中磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比率來(lái)確定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記時(shí)，AD細(xì)胞中阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的正值為約0-0.5。在某些實(shí)施方式中，從診斷為非阿耳茨海默病癡呆(例如帕金森病或亨廷頓病或臨床型精神分裂癥)的受試者獲取的細(xì)胞樣品(非ADD細(xì)胞)中測(cè)定，阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的數(shù)值為負(fù)。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，當(dāng)通過(guò)測(cè)定用緩激肽刺激的非ADD細(xì)胞中磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比率來(lái)確定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記時(shí)，負(fù)值為約0到-0.2或-0.3。在某些實(shí)施方式中，從不患有阿耳茨海默病的受試者提取的年齡匹配的對(duì)照細(xì)胞(AC細(xì)胞)細(xì)胞樣品中測(cè)定，阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的數(shù)值為負(fù)值、0或非常低的正值。當(dāng)通過(guò)測(cè)定用緩激肽刺激的AC細(xì)胞中磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比率來(lái)確定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記時(shí)，AC細(xì)胞中的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記為小于約0.05到約-0.2。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，通過(guò)計(jì)算用緩激肽刺激的細(xì)胞中磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比率減去用沒(méi)有緩激肽的溶液刺激的細(xì)胞中磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比率來(lái)確定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值。表示如下阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記=KpErkl/pErk2)緩測(cè)^-((pErkl/pErk2)運(yùn)載體〉。蛋白激酶C活化劑本發(fā)明診斷方法、試劑盒和鑒別化合物的篩選方法中具體考慮使用的蛋白激酶C活化劑包括但不限于緩激肽；a-APP調(diào)節(jié)劑；苔蘚抑素1;苔蘚抑素2;DHI;1，2-二辛酰基-sn-甘油；FTT;格尼迪木靈，瑞香狼毒(&e〃erac/2ama々^meL.);(-)-IndolactamV;脂氧素A4;鞘絲藻毒素A，單孢絲菌屬(M/crawo"m/orasp.);油酸；l-油酰基-2-乙?；?sn-甘油；4a-佛波醇；佛波醇-12，13-二丁酸酯；佛波醇-12,13-二癸酸酯；4a-佛波醇-12,13-二癸酸酯；佛波醇-12-肉豆蔻酰-13-乙酸酉旨；L-a-磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸酯，二棕櫚酰-，五銨鹽；L,a-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸酯，二棕櫚酰-，五銨鹽；ka-磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯，二棕櫚酰-，七銨鹽；1-硬脂酰-2-花生四烯酰-訓(xùn)-甘油；Thymeleatoxin，瑞香木藍(lán)(772;;we/eaWrwto胰島素，佛波酯，溶血磷脂膽堿，脂多糖，蒽環(huán)類抗生素和硫酸氧釩。還包括稱為"bryologues"的化合物。Bryologues的描述參見(jiàn)Wender等，Organicletters(美國(guó))，2005年5月12日，7(10)第1995-8頁(yè)；Wender等；Organicletters(美國(guó))2005年5月17日，7(6)第1177-80頁(yè)；Wender寧，JournalofMedicinalChemistry(美國(guó))2004年12月16日，47(26)第6638-44頁(yè)。本發(fā)明診斷方法、試劑盒及化合物篩選方法中蛋白激酶C活化劑可單獨(dú)使用或與任何其它蛋白激酶C活化劑組合使用。緩激肽是在各種炎癥發(fā)病過(guò)程中產(chǎn)生的具有高血管作用活性的九肽。緩激肽可結(jié)合并活化特定的細(xì)胞膜緩激肽受體，從而激活細(xì)胞內(nèi)事件的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致被稱為"有絲分裂原活化蛋白激酶"(MAPK)的磷酸化。蛋白質(zhì)的磷酸化是在絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上添加磷酸基，是由被總稱為蛋白激酶的各種酶所介導(dǎo)的。磷酸化般可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能，通?？苫罨鞍踪|(zhì)。內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)定要求磷酸化應(yīng)該是瞬時(shí)的過(guò)程，這'過(guò)程可被使底物去磷酸化的磷酸酶逆轉(zhuǎn)。磷酸化或去磷酸化的任何異常都可能會(huì)中斷生化通路和細(xì)胞功能。這種中斷可能是某些腦疾病的基礎(chǔ)。測(cè)量或檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)水平本文所述診斷阿耳茨海默病的方法以及篩選適用于治療或預(yù)防阿耳茨海默病的化合物的方法是基于測(cè)量本發(fā)明阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記。在優(yōu)選實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定細(xì)胞中磷酸化蛋白質(zhì)的水平?？刹捎每?Erkl、抗-Erk2、抗-磷酸-Erkl和抗-磷酸-Erk2抗體測(cè)定成纖維細(xì)胞中磷酸化Erkl或磷酸化Erk2的蛋白質(zhì)水平(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司)。也可在同--樣品中測(cè)定不同的蛋白質(zhì)的水平作為參比蛋白，用于標(biāo)準(zhǔn)化?？赡艿膮⒈鹊鞍椎睦影ǖ幌挢∧ぢ?lián)蛋白-n或肌動(dòng)蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，按照如F過(guò)程進(jìn)行ELISA:l)將處理后的成纖維細(xì)胞裂解物以雙復(fù)孔或三復(fù)孔的形式加到預(yù)先包被抗Erk抗體的96孔微板上。2)微板孔內(nèi)的樣品在室溫下孵育約2小時(shí)。3)吸去樣品并用以磷酸緩沖鹽水(PBS)為基礎(chǔ)的洗滌緩沖劑洗滌孔。4)在每個(gè)孔中加入工作稀釋濃度的抗磷酸-Erk1/2或抗常規(guī)Erkl/2抗體，并在室溫下孵育約1小時(shí)。5)吸去液體并用洗滌緩沖劑洗滌孔。6)在每個(gè)孔中加入工作稀釋濃度的連接有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗，并在室溫下孵育約30分鐘。7)吸去液體并用洗滌緩沖劑洗滌孔。8)加入經(jīng)過(guò)穩(wěn)定的色原體如二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，并在室溫下孵育約30分鐘。9)加入終止液，然后在450nm處測(cè)定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)化后分析ErKl/2的磷酸化NR=AP/AR。其中NR-標(biāo)準(zhǔn)化后的比率；Ap是磷酸-Erkl/2的吸光度值；AR是總(常規(guī))Erk1/2的吸光度值。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，使用抗磷酸-Erk1/2抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析Erkl/2的磷酸化。磷酸化的Erkl/2的免疫反應(yīng)信號(hào)水平通過(guò)密度測(cè)定儀掃描來(lái)定量。磷酸-Erld/2信號(hào)的平均密度用總Erkl/2信號(hào)的平均密度來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化，后者是通過(guò)另一個(gè)蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)利用抗常規(guī)Erid/2抗體從同一細(xì)胞裂解樣品中得到的。標(biāo)準(zhǔn)化的公式為NR=DP/DR。其中NR(標(biāo)準(zhǔn)化的比率)代表Erkl/2的磷酸化程度；Dp是磷酸-Erk1/2的平均密度；Dr是從同一祥品的蛋白廣印跡.t檢測(cè)到的Erkl/2總量的平均密度。用于檢測(cè)蛋白的本發(fā)明的免疫分析可以是免疫熒光分析、放射免疫分析、蛋白質(zhì)印跡分析、酶免疫分析、免疫沉淀、化學(xué)發(fā)光分析、免疫組織化學(xué)分析、斑點(diǎn)印跡或狹縫印跡分析等(參見(jiàn)《免疫分析的原理和實(shí)踐》(PrinciplesandPracticeofImmunoassay)(1991)，ChristopherP.Price禾卩DavidJ.Neoman.(編輯)，StocktonPress,NewYork,NewYork,Ausubel等(編輯)(1987)，《當(dāng)代分子生物學(xué)手冊(cè)》("Current■ProtocolsinMolecularBiology")JohnWiley禾QSons,NewYork,NewYork)。檢測(cè)可通過(guò)比色法或放射活性法或本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他任何常規(guī)方法進(jìn)行。本領(lǐng)域熟知的用于ELISA的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)描述亍《免疫診斷方法》(MethodsinImmunodiagnosis)，第二二版，Rose禾卩Bigazzi編輯，JohnWiley禾卩Sons,NewYork1980以及Campbell等，《免疫學(xué)方法》(Methodsoflmmunology)，W.A.Benjamin,Inc.,1964，二者都已納入本文作為參考。這些分析方法可以是如本領(lǐng)域所描述的直接的、間接的、競(jìng)爭(zhēng)性的或非競(jìng)爭(zhēng)性的免疫分析方法(參見(jiàn)《免疫分析的原理和實(shí)踐》("PrinciplesandPracticeofImmunoassay)(1991),ChristopherP.Price禾口DavidJ.Neoman(編輯)，StocktonPress,NY，NY;Oellirich,M.1984.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.22:895-904;Ausubel等(編輯)(1987)，《當(dāng)代分子生物學(xué)手冊(cè)》("CurrentProtocolsinMolecularBiology")JohnWiley禾卩Sons,NewYork,NewYork)。細(xì)胞類型，蛋白質(zhì)分離及抗體如.i:文所描述的，來(lái)自被診斷的患者的細(xì)胞可以是任何細(xì)胞。可使用的細(xì)胞的例亍包括而不限于皮膚細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、頰粘膜細(xì)胞、血細(xì)胞如紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞、以及神經(jīng)細(xì)胞以及表達(dá)Erkl/2的其他任何細(xì)胞。解剖樣品和病理樣品也可以使用。包含這些細(xì)胞的組織也可以使用，包括腦組織或腦細(xì)胞。細(xì)胞可以是新鮮的、培養(yǎng)的或冷凍的。從細(xì)胞或組織分離的蛋白樣品可立即用亍診斷分析或篩選化合物的方法，也可以冷凍起來(lái)在以后使用。在-個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中使用的是成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞通過(guò)皮膚穿刺活檢來(lái)獲取。蛋白可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法從細(xì)胞分離。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，對(duì)分離自患者的細(xì)胞進(jìn)行洗滌并在磷酸緩沖鹽水(PBS)中使其結(jié)塊。然后用"勻漿緩沖劑"洗滌團(tuán)塊，勻漿緩沖劑包含50nMNaF、1mMEDTA、1mMEGTA、20i!g/ml亮肽素、50pg/ml抑肽素、10mMTRIS-HCl，pH=7.4，并離心結(jié)塊。棄去-t清，加入"勻漿緩沖劑"，然后超聲破碎團(tuán)塊。所得到的蛋白提取物可馬上使用，或者儲(chǔ)存在-80"C用于以后的分析。在本發(fā)明的方法中，所述免疫分析中使用的抗體可以是單克隆或多克隆來(lái)源的抗體。制備抗體所用的磷酸化的或非磷酸化的Erkl/2蛋白或其片段可以是天然的，也可以是重組來(lái)源，或者通過(guò)化學(xué)合成方法制備。天然的Erkl/2蛋白可通過(guò)常規(guī)方法從生物樣品中分離?？捎糜诜蛛xErkl/2蛋白的生物樣品的例子包括而不限于皮膚細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、成纖維細(xì)胞系如阿耳茨海默病成纖維細(xì)胞系以及對(duì)照成纖維細(xì)胞系，b.述細(xì)胞可從CoriellCellRepositories(Camden，NJ.)購(gòu)買(mǎi)并列于國(guó)立衰老研究所(Nation.alInstituteofAging)1991細(xì)胞系目錄和國(guó)立普通醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所(NationalInstituteofGenerlaMedicalSciences)1992/1993細(xì)胞系目錄[(NIHPublication92-2011(1992))。III.診斷阿耳茨海默病的試劑盒還應(yīng)了解的是，本發(fā)明涉及可用亍實(shí)現(xiàn)上文所述各種診斷試驗(yàn)的試劑盒。試劑盒可包含單次診斷試驗(yàn)或本文所描述的試驗(yàn)的任意組合。試劑盒可包含能夠識(shí)別常規(guī)Erkl/2(未磷酸化Erkl或未磷酸化Erk2)或磷酸化Erkl/2(磷酸化Erkl或磷酸化Erk2)的抗體。試劑盒可包含能夠識(shí)別常規(guī)MAP激酶蛋白以及磷酸化MAP激酶蛋白的抗體。試劑盒還可包含本文所述蛋白激酶C活化劑中的任一種或多種(例如，緩激肽或苔蘚抑素)?？贵w可以是多克隆的，也可以是單克隆的。試劑盒可包含完成一次或多次活檢(例如皮膚穿刺活檢)所需的器械、緩沖劑和儲(chǔ)存容器。試劑盒還可包含與用亍識(shí)別本發(fā)明阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的比率測(cè)定有關(guān)以及與診斷試驗(yàn)中抗體或其它成分的使用有關(guān)的說(shuō)明書(shū)。說(shuō)明書(shū)還可描述活檢過(guò)程，例如皮膚穿刺活檢。試劑盒還可以包含實(shí)現(xiàn)診斷試驗(yàn)的其它試劑，例如檢測(cè)用于標(biāo)準(zhǔn)化的參比蛋白的抗體。識(shí)別可能的參比蛋白的抗體的例子包括但不限于識(shí)別膜聯(lián)蛋白-II或肌動(dòng)蛋白的抗體。試劑盒還可以包含緩沖劑、二抗、對(duì)照細(xì)胞等。IV.篩選適用亍治療或預(yù)防阿耳茨海默病的化合物的方法本發(fā)明還涉及篩選和鑒別適用于治療或預(yù)防阿耳茨海默病的物質(zhì)的方法。根據(jù)該實(shí)施方式，鑒別和選擇能夠逆轉(zhuǎn)或改善本文所述阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記(即回到正常細(xì)胞的水平)的物質(zhì)作為潛在地適用于治療或預(yù)防阿耳茨海默病的物質(zhì)。例如，一種篩選治療性物質(zhì)的方法包括以下步驟在本文所述任意蛋白激酶C活化劑的存在下使來(lái)自阿耳茨海默病患者的樣品細(xì)胞與待篩選物質(zhì)接觸，然后測(cè)定本文所述的任意阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記。鑒別和選擇能夠逆轉(zhuǎn)或改善阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記使其回到正常細(xì)胞(即從不患有阿耳茨海默病的受試者提取的細(xì)胞)水平的試劑作為潛在地適用于治療或預(yù)防阿耳茨海默病的物質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，能夠逆轉(zhuǎn)或改善阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的試劑是指能使阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的正值減小和/或向更負(fù)的值轉(zhuǎn)變的試劑。V.檢測(cè)阿耳茨海默疾病進(jìn)程的方法本發(fā)明還涉及檢測(cè)受試者中阿耳茨海默疾病進(jìn)程的方法。圖2提供了阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記相對(duì)于癡呆持續(xù)時(shí)間(年)的線性回歸分析。線性回歸顯示約-0.01的負(fù)斜率，表明癡呆年數(shù)與阿耳茨海默病特異性分亍生物標(biāo)記的正值大小逆相關(guān)。隨著癡呆年數(shù)的增長(zhǎng)(即阿耳茨海默病的發(fā)展)，阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的正值減小。測(cè)定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記能夠?qū)崿F(xiàn)阿耳茨海默病的早期診斷，因?yàn)樵谀承?shí)施方式中，正值較高指示疾病早期。在某些實(shí)施方式中，隨著受試者阿耳茨海默病的發(fā)展，阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的正值變小。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)測(cè)定用緩激肽刺激的細(xì)胞中磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比率減去用沒(méi)有緩激肽的培養(yǎng)基刺激的細(xì)胞中磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比率來(lái)確定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值。表示如F:阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記=((pErkl/pErk2)緩激肽〉-KpErkl/pErk2)運(yùn)載體〉。VI.淀粉樣p肽術(shù)語(yǔ)"淀粉樣卩肽"、"卩淀粉樣蛋白"、"卩淀粉樣肽"、"卩淀粉樣"、"A.(3"和"A.p肽"可互換使用。在一些形式中，淀粉樣P肽(例如，A.卩39，A.卩40，A.P41，A.卩42和A.卩43)是稱為淀粉樣前體蛋白(APP)的較大跨膜糖蛋白中39-43氨基酸的約4-kDa的內(nèi)部片段。存在多種APP亞型，例如APP695、APP751和APP"o。目前已知人體中存在的App特定同種型的具體例子包括Kang等Q987)Nature325:733-736中所述695個(gè)氨基酸的多肽，稱為"正常"APP;Ponte等,(1988)Nature331:525-527(1988)和Tanzi等，(1988)Nature331:528-530中所述751個(gè)氨基酸的多肽；以及Kitaguchi等(1988)Nature331:530-532中所述770個(gè)氨基酸的多肽。由不同的分泌酶對(duì)APP在體內(nèi)或原位進(jìn)行酶解加工之后，A.p形成40個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的"短形式"和42-43個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的"長(zhǎng)形式"。APP疏水區(qū)域部分位于A.(3的羧基端，與A.p聚集能力有關(guān)，尤其是對(duì)于長(zhǎng)形式。A.p.肽位亍人和其它哺乳動(dòng)物的體液中，或可以從中純化出來(lái)，例如腦脊液，包括正常個(gè)體和患有淀粉樣蛋白源性病癥的個(gè)體。術(shù)語(yǔ)"淀粉樣P肽"、"P淀粉樣蛋白"、"(3淀粉樣肽"、"P淀粉樣"、"A.p"和"A.p肽"包括分泌酶裂解APP產(chǎn)生的肽以及與裂解產(chǎn)物具有相同或基本相同序列的合成肽。本發(fā)明A.P.肽可以是多種來(lái)源，例如組織、細(xì)胞株或體液(例如血淸或腦脊液)。例如A.卩可來(lái)自表達(dá)APP的細(xì)胞，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，例如參見(jiàn)Walsh等，(2002)，Nature,416，第535-539頁(yè)所述?？刹捎靡阎椒◤慕M織制備A.卩.(例如參見(jiàn)Johnson-Wood等，(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:1550)?；蛘撸珹.卩.肽可采用本領(lǐng)域公知的方法合成。例如參見(jiàn)Fields等，《合成肽使用指南》(SyntheticPeptides:AUser'sGuide)，Grant編，W.II.Freeman&Co.，紐約，N.Y.，1992，第77頁(yè))。因此，在應(yīng)用生物系統(tǒng)肽合成儀型號(hào)430A或431.....1::，根據(jù)側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸化學(xué)方法，用t-Boc或F-moc保護(hù)a-氨基，通過(guò)固相合成的自動(dòng)化Merrifidd技術(shù)來(lái)合成肽。采用公知的重組DNA技術(shù)來(lái)合成較長(zhǎng)的肽抗原。例如，編碼肽或融合肽的多核苷酸可通過(guò)合成制得或經(jīng)分子克隆并插入合適的表達(dá)載體，在合適的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)染和異源表達(dá)。A.p.肽也指正常基因A.p.區(qū)域突變形成的相關(guān)A.(3序列。A.卩-誘導(dǎo)的Erk1/2指數(shù)(阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記)異?？捎秘◎?yàn)證是否存在阿耳茨海默病。就是說(shuō)，淀粉樣P-指數(shù)負(fù)響應(yīng)表明疾病存在，而正響應(yīng)表明疾病不存在。即，如果與淀粉樣(3肽孵育或接觸后在細(xì)胞中誘導(dǎo)了阿耳茨海默病表型，則表明該試驗(yàn)細(xì)胞或受試者不存在疾病。相反，如果與淀粉樣P肽孵育或接觸后細(xì)胞中的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記沒(méi)有或幾乎沒(méi)有變化，則表明該試驗(yàn)細(xì)胞或受試者中存在阿耳茨海默病。雖然優(yōu)選淀粉樣P(l-42)(即Ap(l-42))進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，本文所述的任何方法或試劑盒中也可使用任何其它淀粉樣卩片段，例如(1-39)、(1-40)、(1-41)、(1-43)、(25-35)、(16-22)、(16-35)、(10-35)、(8-25)、(28-38)、(15-39)、(15-40)、(15-41)、(15-42)、(15-43)或任何其它淀粉樣p片段。VII.適用于治療阿耳茨海默病的組合物本發(fā)明還涉及適用于治療或預(yù)防阿耳茨海默病的組合物。用本文所述篩選方法鑒定的化合物可配制成藥物組合物的形式，給予需耍的受試者。本發(fā)明藥物組合物或用本文所述篩選方法鑒定的化合物(或先導(dǎo)化合物的化學(xué)衍生物)根據(jù)已知方法與藥學(xué)上可接受的載體混合形成藥物組合物后安全地給予，例如片劑(包括糖衣片和薄膜衣片)、粉末劑、顆粒劑、膠囊(包括軟膠囊)、液體制劑、注射劑、栓劑、緩釋制劑等，用亍口服、皮—F、經(jīng)皮、經(jīng)皮膚或胃腸外(例如局部、直腸或靜脈內(nèi))給予。本發(fā)明組合物中使用的藥學(xué)上可接受的載體例子包括但不限于各種常規(guī)有機(jī)或無(wú)機(jī)載體，包括固體制劑的賦形劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑和崩解劑，對(duì)于液體制劑是溶劑、增溶劑、助懸劑、等張劑、緩沖劑、安撫劑等。需要時(shí)，也可使用適量的常規(guī)添加劑，如防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑、吸收劑、潤(rùn)濕劑等。本發(fā)明藥物組合物中使用的賦形劑的例子包括但不限于乳糖、蔗糖、D-甘露醇、淀粉、玉米淀粉、微晶纖維素、輕質(zhì)無(wú)水硅酸、多糖、二糖、糖、海藻糖等。本發(fā)明藥物組合物中使用的潤(rùn)滑劑的例子包括但不限于硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石粉、膠體硅等。本發(fā)明藥物組合物中使用的粘合劑的例子包括但不限于微晶纖維素、蔗糖、D-甘露醇、糊精、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯垸酮、淀粉、蔗糖、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉等。本發(fā)明藥物組合物中使用的崩解劑的例子包括但不限于淀粉、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素轉(zhuǎn)、羧甲基淀粉鈉、L-羥丙基纖維素等。本發(fā)明藥物組合物中使用的溶劑的例亍包括但不限于注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油、橄欖油等。本發(fā)明藥物組合物中使用的增溶劑的例子包括但不限于聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、苯甲酸芐基酯、乙醇、三氨基甲垸、膽固醇、三乙醇胺、碳酸鈉、檸檬酸鈉等。本發(fā)明藥物組合物中使用的助懸劑的例子包括但不限于表面活性劑如硬酯酰三乙醇胺、月桂硫酸鈉、氨基丙酸I-二烷基酯、卵磷脂、苯扎氯銨、芐索氯銨、單硬脂酸甘油酯等；親水聚合物如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素等。本發(fā)明藥物組合物中使用的等張劑的例子包括但不限于葡萄糖、D-山梨糖醇、氯化鈉、甘油、D-甘露醇等。本發(fā)明藥物組合物中使用的緩沖劑的例子包括但不限于磷酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽等。本發(fā)明藥物組合物中使用的安撫劑的例子包括但不限亍節(jié)醇等。本發(fā)明藥物組合物中使用的防腐劑的例亍包括但不限于p-氧代苯甲酸酯、氯:]'醇、芐醇、苯乙醇、脫氫乙酸、山梨酸等。本發(fā)明藥物組合物中使用的抗氧化劑的例子包括但不限于亞硫酸鹽、抗壞血酸、(X-生育酚等。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明藥物組合物用于注射，所使用的注射用載體包括以—F任一種或所有物質(zhì)溶劑、增溶劑、助懸劑、等張劑、緩沖劑、安撫劑等。溶劑的例子包括但不限亍注射用水、生理鹽水、林格溶液等。增溶劑的例子包括但不限于聚乙二醇、丙」==:醇、D-甘露醇、苯甲酸芐基酯、三氨基甲垸、膽固醇、三乙醇胺、碳酸鈉、檸檬酸鈉等。等張劑的例子包括但不限于葡萄糖、D-山梨糖醇、氯化鈉、甘油、D-甘露醇等。緩沖劑的例子包括但不限于緩沖劑如磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液等。安撫劑的例子包括但不限于芐醇等。pH調(diào)節(jié)劑的例子包括但不限亍鹽酸、磷酸、檸檬酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉等。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明注射用組合物可在無(wú)菌處理的凍千機(jī)中凍千并以粉末狀態(tài)儲(chǔ)存，或者密封在注射用容器中(例如安瓿)并保存。此外，使用時(shí)可用.匕述注射用載體稀釋本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明藥物組合物中活性化合物的含量可根據(jù)劑型而變化，但通常約為整個(gè)制劑質(zhì)量百分比的0.01-99%，優(yōu)選約0.1-50%，更優(yōu)選約0.5-20%。本發(fā)明藥物組合物中非離子表面活性劑的含量可根據(jù)劑型而變化，但通常約為整個(gè)制劑質(zhì)量百分比的1-99.99%，優(yōu)選約10-90%，更優(yōu)選約10-70%。本發(fā)明藥物組合物中乙醇、芐醇或二甲基乙酰胺的含量可根據(jù)劑型而變化，但通常約為整個(gè)制劑質(zhì)量百分比的1-99.99%，優(yōu)選約10-90%，更優(yōu)選約30-90%。本發(fā)明藥物組合物中非離子表面活性劑與乙醇的混合比(重量比)并不具體限制，例如，非離子表面活性劑:乙醇=約0.01-99.99:99.99-0.01，優(yōu)選約1-99:99-1，更優(yōu)選約10-90:90-10等。更優(yōu)選地，非離子表面活性劑:乙醇=約10-80:90-20，約50-80:50-20等，更優(yōu)選為約20:80，約65:35等。本發(fā)明藥物組合物中易溶于水的環(huán)糊精衍生物的含量可根據(jù)劑型而變化，但通常約為整個(gè)制劑質(zhì)量百分比的1-99.99%，優(yōu)選約10-99.99%，更優(yōu)選約20-97%,尤其優(yōu)選約50-97%。本發(fā)明藥物組合物中其它添加劑的含量可根據(jù)劑型而變化，但通常約為整個(gè)制劑質(zhì)量百分比的1-99.99%，優(yōu)選約10-90%，更優(yōu)選約10-70%。本發(fā)明藥物組合物可以是包含活性化合物、非離子表面活性劑和易溶于水的環(huán)糊精衍生物的藥物組合物。在這種情況下，各成分的含量，即活性化合物、非離子表面活性劑和易溶于水的環(huán)糊精衍生物的含量與匕述范圍相同。VIII.治療阿耳茨海默病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還涉及使用本文所述的藥物組合物來(lái)治療或預(yù)防阿耳茨海默病的方法。本發(fā)明的化合物可通過(guò)口服、胃腸外(例如肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、ICV、腦池內(nèi)注射或輸注、皮下注射、或植入體)給予，通過(guò)吸入噴霧，鼻腔，陰道，直腸，舌下，或局部給藥途徑給予，根據(jù)各種給藥途徑，本發(fā)明化合物可單獨(dú)給予或與適用各種給藥途徑的常規(guī)非毒性藥學(xué).....h可接受的載體、輔助試劑和運(yùn)載體一起以合適的劑量單位制劑形式給予。本發(fā)明的藥物組合物和方法還可包含阿耳茨海默病的治療中常用的其它治療活性化合物。在阿耳茨海默病的治療或預(yù)防過(guò)程中，合適的劑量水平通常為約0.001-100毫克/公斤患者體重/天，可以單劑量或多劑量形式給予。優(yōu)選地，劑量水平為約0.01-25毫克/公斤/天；更優(yōu)選約0.05-10毫克/公斤/天。合適的劑量水平為約0.01-25毫克/公斤/天，約0.05-10毫克/公斤/天，或約0.1-5毫克/公斤/天。在該范圍內(nèi)，劑量為約0.005-0.05，0.05-0.5或0.5-5毫克/公斤/天。對(duì)于口服給藥，組合物優(yōu)選是片劑的形式，包含約1-1000毫克活性成分，具體根據(jù)待治療患者的癥狀調(diào)節(jié)劑量，包含約1、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、750、800、900或1000毫克活性成分?；衔锟梢?-4次/天的方案給予，優(yōu)選每天1或2次。然而，應(yīng)理解，任何具體患者的特定劑量水平或給藥頻率可變化，取決于多種因素，包括所采用的特定化合物的活性、該化合物的代謝穩(wěn)定性或作用時(shí)間、年齡、體重、健康狀況、性別、飲食、給藥模式或給藥時(shí)間、排泄速率、藥物組合、特定疾病的嚴(yán)重性以及進(jìn)行治療的宿主。本申請(qǐng)所提及的所有參考文獻(xiàn)、專利和出版的出版物都已完整納入本申請(qǐng)作為參考。F面的實(shí)施例可用于進(jìn)一步闡釋本發(fā)明某些優(yōu)選的實(shí)施方式，并非構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。實(shí)施例實(shí)施例1:阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記(ADSMB)發(fā)現(xiàn)緩激肽(10nM，37。C下IO分鐘)在阿耳茨海默(AD)成纖維細(xì)胞中比在非-AD癡呆和非-癡呆對(duì)照成纖維細(xì)胞中能誘導(dǎo)更多Erkl/2的磷酸化。雖然這種AD成纖維細(xì)胞中Erk1./2磷酸化的增加也可在其它Coriell細(xì)胞株中觀察到，這些測(cè)量中發(fā)現(xiàn)的固有差異性表明需要改善定量、可靠性和重現(xiàn)性。因此，為了控制成纖維細(xì)胞株生長(zhǎng)速率的固有差異以及應(yīng)用于凝膠的蛋白提取物的準(zhǔn)確量的差異，我們引入了一種新的磷酸化測(cè)定方法，該方法采用Erld/2比率比較了BK+剌激前后每個(gè)患者樣品中Erkl與Erk2的磷酸化。Erkl/Erk2磷酸化比率，即阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記(ADSMB)的測(cè)定能夠完全區(qū)分所有非癡呆對(duì)照成纖維細(xì)胞與所有AD成纖維細(xì)胞(圖1和4A)。對(duì)照組(BK-)p-Erkl的表觀較高水平并非在所有患者中一致。沒(méi)能區(qū)分一些非-AD癡呆患者，雖然這可能是沒(méi)有進(jìn)行臨床診斷解剖驗(yàn)證的結(jié)果。這一解釋得到了從解剖驗(yàn)證診斷患者獲取的成纖維細(xì)胞ADSMB測(cè)量結(jié)果的支持(圖1和4B)，其中，ADSMB準(zhǔn)確區(qū)分所有AD病例與所有非-AD癡呆，甚至是AD和其它非-AD病因如帕金森病導(dǎo)致的"混合"型癡呆病例。這種區(qū)分AD與非-AD癡呆和非癡呆對(duì)照患者的高準(zhǔn)確率體現(xiàn)在Coriell細(xì)胞樣品和解剖驗(yàn)證樣品中ADSMB顯著的靈敏度和特異性上(圖6)。只考慮解剖驗(yàn)證診斷的話，靈敏度和特異性為100%。阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記(ADSMB)隨疾病持續(xù)時(shí)間而變化對(duì)于己知疾病持續(xù)時(shí)間的患者樣品(即ADSMB的測(cè)量時(shí)間從出現(xiàn)癥狀時(shí)開(kāi)始)，我們測(cè)定ADSMB大小與疾病持續(xù)時(shí)間的關(guān)系。如圖所示(圖2)，(采用線性回歸分析)ADSMB大小與疾病持續(xù)時(shí)間之間明顯負(fù)相關(guān)。該結(jié)果提示，MAP激酶磷酸化ADSMB越顯著，測(cè)定疾病過(guò)程的時(shí)間越早。AB(l-42)誘導(dǎo)阿耳茨海默表型因?yàn)锳)3(l-42)水平對(duì)于早期AD來(lái)說(shuō)很可能是關(guān)鍵，并且數(shù)據(jù)表明ADSMB觀察值具有早期AD診斷作用，所以我們檢測(cè)了升高的A卩(l-42)可能誘導(dǎo)MAP激酶D.F.異常的可能性。因此，使來(lái)自正常對(duì)照者的成纖維細(xì)胞接觸1.0pMAp(l-42)24小時(shí)。如圖5A所示，如所預(yù)測(cè)的那樣，預(yù)先與A(3(l-42)孵育能夠?qū)⒄?負(fù)值)ADSMB表型轉(zhuǎn)化為所有AD表型中觀察到的異常正值A(chǔ)DSMB表型。這些結(jié)果提示AD患者中ADSMB表型事實(shí)上源于升高的A(3(l-42)水平。PKC活化劑、苔蘚抑素逆轉(zhuǎn)阿耳茨海默表型如...h所述，MAP激酶磷酸化(ADSMB測(cè)定)由PKC活化調(diào)節(jié)，這種調(diào)節(jié)又易受到Aj3水平升高的影響。而且，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)效PKC活化劑大環(huán)內(nèi)酯(macrolactone)苔蘚抑素能夠升高人成纖維細(xì)胞株中PKC的活化以及降低用人AD基因轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因小鼠腦中的A(3(l-42)水平。基于這些發(fā)現(xiàn)，我們檢測(cè)了苔蘚抑素(O.lnM)對(duì)Ap(l-42卜處理的人成纖維細(xì)胞的作用。如圖所示(圖5B和表1)，苔蘚抑素能夠完全逆轉(zhuǎn)正常成纖維細(xì)胞中A(3(l-42)誘導(dǎo)的MAP激酶磷酸化。苔蘚抑素能使經(jīng)Ap-處理的成纖維細(xì)胞的異常正值轉(zhuǎn)變?yōu)榉茿D成纖維細(xì)胞中觀察到的正常負(fù)值A(chǔ)DSMB。這種苔蘚抑素的"治療"效果與長(zhǎng)期接觸苔蘚抑素處理的AD轉(zhuǎn)基因小鼠中存活率的顯著提高相一致。表1對(duì)AC(對(duì)照細(xì)胞株)(對(duì)照)，淀粉樣p(Ap)誘導(dǎo)細(xì)胞和淀粉樣卩(A(3)誘導(dǎo)細(xì)胞加苔蘚抑素處理(A(3+BY)，測(cè)定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記(ADSMB)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>'根據(jù)該試驗(yàn)所采用的方法計(jì)算ADSMB對(duì)照與和Ap處理細(xì)胞的T-檢驗(yàn)'AJ3處理細(xì)胞與A(3加苔蘚抑素處理細(xì)胞間的T-檢驗(yàn)診斷AD過(guò)程中MAP激酶磷酸化ADSMB測(cè)量結(jié)果的高靈敏度和特異性預(yù)示一種重要的AD實(shí)驗(yàn)室測(cè)定方法，以助于癡呆的臨床評(píng)估。到目前為止，通常只對(duì)長(zhǎng)期患病的患者進(jìn)行臨床診斷癡呆的解剖驗(yàn)證?？紤]到AD可能持續(xù)8-15年，發(fā)現(xiàn)與疾病進(jìn)程中后期進(jìn)行臨床診斷然后進(jìn)行解剖驗(yàn)證相比，主要持續(xù)時(shí)間的AD臨床診斷高度不準(zhǔn)確。因此，外周生物標(biāo)記，這里是人成纖維細(xì)胞的MAP激酶磷酸化比率，具有實(shí)現(xiàn)癡呆治療方案的實(shí)際用途。雖然不希望受到理論的限制，還有興趣考慮為什么Erld與Erk2磷酸化比率對(duì)AP代謝AD特異性差異導(dǎo)致的異常敏感。對(duì)本研究及過(guò)去AD外周生物標(biāo)記的研究結(jié)果的一種解釋是，AD的病理生理學(xué)不僅涉及腦，而且涉及許多其它器官系統(tǒng)。這種AD系統(tǒng)性病理生理觀點(diǎn)與以下觀察結(jié)果相-一致淀粉樣蛋白和tau代謝途徑是人體中普遍存在的，體現(xiàn)在血液、唾液、皮膚和腦外組織中。這里顯示的Erid/Erlc2比率與AD的緊密相關(guān)性還關(guān)注那些作為AD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)"讀數(shù)"的物質(zhì)。例如，PKC同工酶調(diào)節(jié)集中在MAP激酶上的一些分子耙點(diǎn)。PKC激活以下過(guò)程(l)s-APP的a-分泌酶增加，因而間接地降低p-淀粉樣蛋白；(2)(3-淀粉樣蛋白活化糖原合成酶激酶-3卩(GSK-3卩)，增加MAP激酶磷酸化；(3)PKC抑制GSK-3p;(4)PKC本身磷酸化GSK-3p;和(5)PKC活化響應(yīng)BK或其它AD-啟動(dòng)的事件的細(xì)胞因子炎癥信號(hào)；(6)毒性膽固醇代謝物(如17-0H膽固醇)抑制PKCa，均衡地降低A卩和磷酸化tau。PKC同工酶本身功能紊亂可能導(dǎo)致AD進(jìn)程最早啟動(dòng)，從而通過(guò)......匕述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件而反映在Erkl/2磷酸化比率異常中。最后，AD磷酸化異常的特異性如何通過(guò)人成纖維細(xì)胞株連續(xù)傳代維持仍然是個(gè)謎。這種現(xiàn)象可能是PKC/MAP激酶水平與成纖維細(xì)胞基因組相互作用的結(jié)果。已知，PKC和MAP激酶調(diào)節(jié)基因表達(dá)。因此，可能是PKC/MAP激酶刺激其自身合成循環(huán)的進(jìn)行，使PKC水平和MAP激酶磷酸化異常在人成纖維細(xì)胞中一代代傳承。實(shí)施例2:AP處理制備A(3(l-42)的溶液首先將1毫克Ap(l-42)以3mM的濃度溶解在六氟異丙醇(Sigma，St.Louis，MO)中，并分裝成無(wú)菌微型離心管的等分試樣。真空除去六氟異丙醇并凍千。將A卩(l-42)薄膜以千燥狀態(tài)儲(chǔ)存在-20。C備用。試驗(yàn)之前將儲(chǔ)存的Ap(l-42)溶解在DMSO中制備5mMAp(l-42)儲(chǔ)備液。溶解來(lái)自DMSO儲(chǔ)備液的Ap(l-42)，制備l.OpM在DMEM培養(yǎng)液(補(bǔ)充有10%血清和青霉素/鏈霉素)中的儲(chǔ)備液。在25毫升培養(yǎng)瓶中，將包含1.0nMA(3(l-42)的DMEM培養(yǎng)液加入90-100。/。融合的非-AD對(duì)照(AC)細(xì)胞中并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)(37七，5%C02)。在無(wú)血清培養(yǎng)液(DMEM)中饑餓處理細(xì)胞16小時(shí)。在含10。/。血清的DMEM培養(yǎng)液中制備10nM緩激肽(在DMSO中)溶液。將7毫升10nM的BK溶液加入到25毫升培養(yǎng)瓶中，37°C.F孵育10分鐘。對(duì)于對(duì)照，則將相同量的DMSO加入到含10%血清的DMEM培養(yǎng)液中。將7毫升該含DMSO(<0.01%)的培養(yǎng)液加入到25毫升培養(yǎng)瓶中，37。C孵育10分鐘。用冷(4。C)1XPBS洗滌四次后，將培養(yǎng)瓶保存在千冰/乙醇混合液中15分鐘。從干冰/乙醇混合液中取出培養(yǎng)瓶，然后每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入100(iL細(xì)胞裂解緩沖劑(l.OmMTris，pH7.4，150mMNaCl，1m.MEDTA，lmMEGTA，0.5%NP-40，1%TritonX-100，1%蛋白酶抑制劑混合物，1%絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸磷酸酶抑制劑混合物)。將培養(yǎng)瓶保存在冷室(4。C)中的端對(duì)端振蕩儀上30分鐘，用細(xì)胞刮收集各個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞。超聲處理細(xì)胞，然后在14000rpm下離心15分鐘，上清液在總蛋白定量后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。用特異性抗體抗常規(guī)Erkl/2和抗-磷酸化ERK1/2測(cè)定總的Erkl、Erk2及Erkl和Erk2磷酸化形式(p-Erkl，p-Erk2)。每個(gè)細(xì)胞株包括至少三個(gè)緩激肽處理的培養(yǎng)瓶(BK+)和相應(yīng)地三個(gè)對(duì)照培養(yǎng)瓶(BK-)以盡可能減小測(cè)量誤差。苔蘚抑素處理從DMSO儲(chǔ)備液制備在常規(guī)DMEM培養(yǎng)液(補(bǔ)充有10%血清和靑霉素/鏈霉素)中的O.lnM的苔蘚抑素溶液。AI3處理后，用常規(guī)培養(yǎng)液(補(bǔ)充有10%血清和青霉素/鏈霉素)洗滌細(xì)胞四次。細(xì)胞中加入O.lnM苔蘚抑素并將培養(yǎng)瓶置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37"C，5%(302)中孵育20分鐘。用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌5次后，將培養(yǎng)瓶以無(wú)血澝狀態(tài)置于培養(yǎng)箱中(37"C，5%<:02)孵育16分鐘。如上所述進(jìn)行緩激肽誘導(dǎo)的MAPK試驗(yàn)。數(shù)據(jù)分析采用FujifilmLAS-1000Plus型掃描儀，對(duì)蛋白質(zhì)印跡蛋白帶的信號(hào)進(jìn)行掃描。通過(guò)本公司(BlanchetteRockefellerNeurosciencesInstitute,Rockville，MD)Dr.Nelson開(kāi)發(fā)的特殊設(shè)計(jì)的軟件，測(cè)定掃描的蛋白質(zhì)帶中Erkl、Erk2、p-Erkl和p-Erk2的強(qiáng)度。由條帶光密度測(cè)定法測(cè)量強(qiáng)度。軟件通過(guò)條帶選擇蛋白質(zhì)帶并在減去背景后計(jì)算各個(gè)像素密度。分別從樣品(BK+)和對(duì)照(BK-)計(jì)算p-Erkl/p-Erk2的比率。用以F公式來(lái)區(qū)分AD禾口非-AD病例ADSMB=[p-Erkl/p-Erk2]BK+-[p-Erkl/p-Erk2]BK-ADSMB=阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記實(shí)施例3:皮膚成纖維細(xì)胞體外試驗(yàn)來(lái)測(cè)定磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比率將來(lái)自Coriell醫(yī)學(xué)研究中心的建庫(kù)的皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞(阿耳茨海默病(AD)，非AD癡呆(非-ADD)(如亨廷頓病和帕金森病及臨床型精神分裂癥)及年齡匹配的對(duì)照細(xì)胞(AC)培養(yǎng)至90-100%融合率。在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM)中培養(yǎng)16小時(shí)使細(xì)胞饑餓。37^下將10nM緩激肽(BK)的DMSO溶液加入到在常規(guī)培養(yǎng)液中，持續(xù)0和10分鐘。對(duì)于對(duì)照，加入相同量的I)MSO。用冷(40c)lXPBS洗滌四次后，將培養(yǎng)瓶保存在千冰/乙醇混合液中15分鐘。從干冰/乙醇混合液中取出培養(yǎng)瓶，然后在各個(gè)培養(yǎng)瓶中加入80pL細(xì)胞裂解緩沖齊U(10mMTris，pH7.4，150mMNaCl，lmMEDTA，lmMEGTA，0.5%NP-40，1%TritonX-IOO，1%蛋白酶抑制劑混合物，1%絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸磷酸酶抑制劑混合物)。將培養(yǎng)瓶保存在冷室(4。C)中的端對(duì)端震搖儀上30分鐘，用細(xì)胞刮收集各個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞。超聲處理細(xì)胞，然后在14000rpm下離心15分鐘，上清液在總蛋白定量后用于蛋白質(zhì)印跡。用特異性抗體抗常規(guī)Erkl/2和抗-磷酸化ERK1/2測(cè)定總的Erkl、Erk2及Erkl和Erk2磷酸化形式(p-Erkl，p-Erk2)。實(shí)施例4:皮膚成纖維細(xì)胞建庫(kù)的AD患者皮膚成纖維細(xì)胞和年齡匹配的對(duì)照細(xì)胞從Coriell醫(yī)學(xué)研究中心購(gòu)得。獨(dú)立獲取解剖驗(yàn)證的皮膚成纖維細(xì)胞?；颊呖赡芘R床患有嚴(yán)重癡呆，進(jìn)行性記憶衰退和其它認(rèn)知功能損傷。這些患者的腦部顯示異常EEG，并在CAT或CT掃描中顯示不同程度的腦萎縮。來(lái)自年齡相近的正常個(gè)體的細(xì)胞用作對(duì)照。新鮮獲取的皮膚成纖維細(xì)胞。從新鮮皮膚組織獲取的成纖維細(xì)胞的收集與培養(yǎng)如下所述由專業(yè)人員對(duì)非-FAD(nFAD)患者和年齡匹配的對(duì)照進(jìn)行皮膚穿刺活檢。所有患者(或代表)簽署知情同意書(shū)。建庫(kù)的患有亨廷頓病的成纖維細(xì)胞。這些成纖維細(xì)胞來(lái)自亨廷頓病(Huntington'sdisease,HD)患者，伴有癡呆的典型亨廷頓病的癡呆癥狀。來(lái)自年齡、性別匹配的正常個(gè)體的成纖維細(xì)胞用作對(duì)照。實(shí)施例5:材料DMEM購(gòu)自GibcoBRL公司。胎牛血清購(gòu)自BioFluids公司。緩激肽、2-氨基乙基二苯基硼酸酯(2ABP)、蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物購(gòu)自Sigma公司；二吲哚基馬來(lái)酰亞胺-1和LY294002購(gòu)自Alexis;PD98059購(gòu)自細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司(CellSignalingTechnology)?？?磷酸-Erk1/2抗體購(gòu)自細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司?？钩Ｒ?guī)Erkl/2購(gòu)自北方生物技術(shù)公司(UpstateBiotechnology)。SDS微型膠(4-20%)購(gòu)自Invertrogene-Novex。硝基纖維素膜購(gòu)自Schleicher&Schuell公司(Keene，NH)。所有SDS電泳試劑購(gòu)自Bio-Rad。超級(jí)信號(hào)(SuperSignal)化學(xué)發(fā)光物質(zhì)試劑盒購(gòu)自八二—:'lPierce公口J?；蛘?，緩激肽(分子量1060.2)購(gòu)自Calbiochem公司(SanDiego，CA)。兔抗磷酸-p44/p42MAPK購(gòu)自細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司(Danvers，MA)?？钩Ｒ?guī)Erkl/2購(gòu)自北方生物技術(shù)公司(UpstateBiotechnology,Charlottesville,VA)，抗兔二抗購(gòu)自JacksonLab(BarHarbor,ME)。卩淀粉樣蛋白(1-42)(分子量4514.1)購(gòu)自美國(guó)肽制劑公司(AmericanPeptide,Sunnyvale,CA)。苔蘚抑素購(gòu)自Biomol公司(Plymouth實(shí)施例6:AC和AD成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)將來(lái)自阿耳茨海默病患者(包括FAD和nFAD型)及年齡匹配的對(duì)照(AC)的建庫(kù)的成纖維細(xì)胞維持在包含10M胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液的T25/T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代數(shù)在6-17代的范圍內(nèi)。實(shí)施例7:來(lái)自新鮮活檢組織或建庫(kù)樣品的成纖維細(xì)胞的加工和培養(yǎng)將樣品置于1XPBS中并在轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行增殖。除去轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液后，用PBS沖洗皮膚組織并精細(xì)剁碎成1毫米大小的外植體。將外植體---個(gè)個(gè)轉(zhuǎn)移至含3毫升活檢培養(yǎng)液的通氣的T25培養(yǎng)瓶的生長(zhǎng)表面，所述活檢培養(yǎng)液包含45%FBS、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素(Pen/Strep)。在加入2毫升含10%FBS的活檢培養(yǎng)液前，將組織在37。C下培養(yǎng)24小時(shí)。48小時(shí)后用5毫升含10%FBS和100U/mlPen/Strep的常規(guī)培養(yǎng)液換液。然后將細(xì)胞傳代并根據(jù)上文所述的常規(guī)方法進(jìn)行維持。還使用人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行研究。將來(lái)自Coriell醫(yī)學(xué)研究中心(Camden,新澤西州)的阿耳茨海默病(AD)、非AD癡呆(如亨廷頓病、帕金森病和臨床精神分裂癥且年齡匹配的對(duì)照，AC)的建庫(kù)的皮膚成纖維細(xì)胞在25毫升細(xì)胞培養(yǎng)瓶l::f，培養(yǎng)(補(bǔ)充10%血清和靑霉素/鏈霉素，37°C，5%C02)至90-100%融合率。細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)液(DMEM)中饑餓處理16小時(shí)。用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液制備10nM緩激肽(在DMSO中)溶液。將7毫升10nMBK溶液加入到25毫升培養(yǎng)瓶中并在37°C下培養(yǎng)10分鐘。對(duì)照則將相同量的DMSO加入到含10%血清的DMEM培養(yǎng)液中。將7亳升該含DMSO(<0.01%)的培養(yǎng)液加入到25毫升培養(yǎng)瓶中，37。C孵育10分鐘。用冷(4"C)1XPBS洗滌4次后，將培養(yǎng)瓶置于干冰/乙醇混合物15分鐘。從千冰/乙醇混合物中取出培養(yǎng)瓶，然后每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入100nL細(xì)胞裂解緩沖劑(10mMTris，pH7.4，150mMNaCl，1mMEDTA，1mMEGTA，0.5%NP-40，1%TritonX-100，1%蛋白酶抑制劑混合物，1%絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸磷酸酶抑制劑混合物)。將培養(yǎng)瓶置于冷室(4。C)的端對(duì)端振蕩儀上30分鐘，然后用細(xì)胞刮收集每個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞。將細(xì)胞進(jìn)行超聲處理然后在14000rpm—卩離心15分鐘，上清液在總蛋白定量后用亍蛋白質(zhì)印跡。實(shí)施例8:用不同的蛋白激酶C活化劑處理成纖維細(xì)胞使用緩激肽或其它特定的蛋白激酶C活化劑來(lái)處理成纖維細(xì)胞。將建庫(kù)的AC和AD皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至80-100%融合率，然后在無(wú)血清DMEM中饑餓處理過(guò)夜。用10nM蛋白激酶C活化劑在37。C下處理細(xì)胞不同的時(shí)間長(zhǎng)度，建立蛋白激酶C活化劑-誘導(dǎo)事件的時(shí)間變化過(guò)程。施加蛋白激酶C活化劑后立即中止反應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)定義為蛋白激酶C活化劑處理后的"O時(shí)間點(diǎn)"。各個(gè)細(xì)胞株的對(duì)照細(xì)胞則在各個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)加入相同體積的PBS。除去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS，pH7.4快速淋洗細(xì)胞，并將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至干冰/乙醇上以終止反應(yīng)。對(duì)于從新鮮活檢組織獲取和培養(yǎng)的細(xì)胞，使用濃度O.lnM的蛋白激酶C活化劑。37"下處理時(shí)間約10分鐘。為制備處理后細(xì)胞的細(xì)胞裂解液，將培養(yǎng)瓶從千冰/乙醇轉(zhuǎn)移到冰水.匕。在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入1毫升含lOmMTris，pH7.4，150mMNaCl，1mMEDTA，1mMEGTA，pH8，0.5%NP-40，1%TritonX-100，1。/o蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)，1%絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸磷酸酶抑制劑混合物(Sigma)的的細(xì)胞裂解緩沖劑。在冷室中的端對(duì)端振蕩儀上震搖30分鐘后，用細(xì)胞刮從各個(gè)培養(yǎng)瓶收集細(xì)胞。將細(xì)胞進(jìn)行超聲并在5000rpm下離心5分鐘，上清液用于蛋白質(zhì)印跡分析。實(shí)施例9:蛋白質(zhì)印跡方案h用等體積的2XSDS-上樣緩沖劑處理細(xì)胞裂解產(chǎn)物并煮沸10分鐘。來(lái)自各個(gè)樣品的蛋白質(zhì)在4-20%微梯度凝膠.....t:進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)移至硝基纖維素薄膜。采用SuperSignalECL檢測(cè)試劑盒，用抗-磷酸Erk1/2抗體檢測(cè)磷酸化Erkl/2。為按照Erkl/2的總量對(duì)磷酸化Erkl/2的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，用抗-磷酸-Erk1/2抗體染色后，將同一薄膜用包含62.5mMTris-HCI，pH6.7，2%SDS和100mM2-巰基乙醇的洗脫再生緩沖劑在60°CF洗脫再生45分鐘，然后用抗-常規(guī)Erkl/2抗體染色?；蛘?，將兩份在SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)移至硝基纖維素薄膜的樣品分別用抗-磷酸-Erk抗體和抗-常規(guī)Erk抗體印跡染色。用包含0.01%吐溫20的10mMPBS(pH7.4)洗滌后(3次，每次10分鐘)，用抗-常規(guī)Erk1/2抗體進(jìn)行印跡染色，測(cè)定SDS凝膠上承載的Erkl/2的總量。方案2:將等體積的2xSDS上樣緩沖劑添加到各個(gè)細(xì)胞裂解產(chǎn)物中，在沸水浴中煮沸10分鐘。在8-16%微梯度凝膠上進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移至硝基纖維素薄膜。用特異性抗體檢測(cè)Erkl、Erk2以及Erkl和Erk2的磷酸化形式(p-Erkl，p-Erk2)的總實(shí)施例10:數(shù)據(jù)分析采用FujifilmLAS-1000Plus型的掃描儀，對(duì)來(lái)自磷酸化形式和常規(guī)形式的Erkl/2的各種信號(hào)進(jìn)行掃描。利用NIH圖像軟件檢測(cè)每-條蛋白質(zhì)條帶的平均光密度值。對(duì)來(lái)自磷酸化Erkl/2信號(hào)的數(shù)值分別按Erkl/2的總信號(hào)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理之后，將各項(xiàng)經(jīng)處理的細(xì)胞株的數(shù)據(jù)換算成對(duì)基礎(chǔ)對(duì)照組的百分率，以供進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)施例11:免疫細(xì)胞化學(xué)成纖維細(xì)胞在涂覆有0.02毫克聚賴氨酸的直徑2.5厘米的蓋玻片上生長(zhǎng)。對(duì)細(xì)胞樣本按上述方法用緩激肽或其它蛋白激酶C活化劑進(jìn)行處理之后，再迅速用冷PBS(pH7.4)液進(jìn)行淋洗，并在室溫下用4%甲醛的PBS溶液固定處理15分鐘。再分別用PBS(pH7.4)洗滌3次，每次5分鐘，在室溫下用0.1%TritonX-lOO的PBS溶液進(jìn)行通透處理30分鐘。再在室溫下加入10%正常馬血清的PBS(pH7.4)溶液培育30分鐘，細(xì)胞再與抗-磷酸-Erk1/2的抗體(1:200)—起置于4°C下孵育過(guò)夜。用PBS(pH7.4)洗滌蓋玻片上的細(xì)胞3次，然后加入熒光素標(biāo)記的抗-小鼠IgG(l:200)(VectorLab)，置于室溫下孵育60分鐘。用PBS洗滌3次之后，再用Vectashield封膠(VectorLab)密封，置于尼康熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中的免疫染色信號(hào)。采用BioRadQuantityOne軟件(BioRad公司)和Tnimage測(cè)定細(xì)胞圖像中免疫細(xì)胞化學(xué)信號(hào)的強(qiáng)度。對(duì)于皮膚成纖維細(xì)胞中的BK或蛋白激酶C活化劑受體的定位方法，將單克隆抗BKB2抗體或抗蛋白激酶C活化劑抗體應(yīng)用于正常成纖維細(xì)胞，再加入Cy5-結(jié)合的抗小鼠IgG進(jìn)行孵育。用熒光顯微鏡觀察所得免疫反應(yīng)信號(hào)。權(quán)利要求1.一種測(cè)定受試者中不存在阿耳茨海默病的方法，所述方法包括a)使來(lái)自受試者的細(xì)胞與淀粉樣β肽相接觸；b)測(cè)定所述接觸步驟是否在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)了阿耳茨海默病表型；其中，如果通過(guò)所述接觸步驟誘導(dǎo)了阿耳茨海默病表型則表明所述受試者不存在阿耳茨海默病。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，如果與所述淀粉狀(3肽孵育導(dǎo)致所述細(xì)胞中阿耳茨海默病表型無(wú)顯著改變或變化，則表明所述受試者中存在阿耳茨海默病。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述淀粉樣(3肽是Ap(l-42)。4.如權(quán)利要求l所述的方法，所述方法還包括使所述細(xì)胞與蛋白激酶C活化劑相接觸。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述蛋白激酶C活化劑選自緩激肽、苔蘚抑素、鈴蟾肽、膽囊收縮素、凝血酶、前列腺素F2ot和加壓素。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在亍，所述細(xì)胞是外周細(xì)胞。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞選自成纖維細(xì)胞、唾液、血液、尿液、皮膚細(xì)胞、頰粘膜細(xì)胞或腦脊液。8.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法包括體外試驗(yàn)。9.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，如果阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值是大于零的正值，則在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)了阿耳茨海默病表型。10.—種測(cè)定受試者中不存在阿耳茨海默病的方法，所述方法包括a:i使來(lái)自受試者的細(xì)胞與Ap(l-42)相接觸；b)使所述細(xì)胞與緩激肽相接觸；C)測(cè)定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值；如果所述阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值是大于零的正值，則表明所述受試者中不存在阿耳茨海默病。11.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，如果與所述A卩(l-42)孵育沒(méi)有導(dǎo)致所述細(xì)胞阿耳茨海默病表型顯著改變或變化，則表明所述受試者中存在阿耳茨海默病。12.如權(quán)利耍求IO所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是外周細(xì)胞。13.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞選自成纖維細(xì)胞、唾液、血液、尿液、皮膚細(xì)胞、頰粘膜細(xì)胞或腦脊液。14.一種鑒別適用于治療阿耳茨海默病的先導(dǎo)化合物的方法，所述方法包括a)使非阿耳茨海默細(xì)胞與淀粉樣p肽相接觸；b)使來(lái)自步驟(a)的所述細(xì)胞與蛋白激酶C活化劑相接觸；C)使來(lái)自步驟(b)的所述細(xì)胞與試驗(yàn)化合物相接觸；和d)測(cè)定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值，以鑒別適用于治療阿耳茨海默病的先導(dǎo)化合物。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述淀粉樣p肽是A(3(l-42)。16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述非阿耳茨海默細(xì)胞選自成纖維細(xì)胞、唾液、血液、尿液、皮膚細(xì)胞、頰粘膜細(xì)胞或腦脊液。17.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述蛋白激酶C活化劑選自緩激肽、苔蘚抑素、鈴蟾肽、膽囊收縮素、凝血酶、前列腺素F2ct或加壓素。18.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，如果所述阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值小于從未與試驗(yàn)化合物接觸的對(duì)照細(xì)胞測(cè)得的所述阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值，則所述值指示了適用于治療阿耳茨海默病的化合物。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述對(duì)照細(xì)胞與淀粉樣卩肽相接觸。20.如權(quán)利要求19所述的方法，所述淀粉樣(3肽是Ap(l-42)。21.如權(quán)利要求18或19所述的方法，其特征在亍，所述對(duì)照細(xì)胞與蛋白激酶C活化劑相接觸。22.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述接觸步驟(c)在所述接觸步驟(b)之后進(jìn)行。23.如權(quán)利要求14所述的方法，所述方法還包括以下步驟對(duì)鑒別的適用亍治療阿耳茨海默病的化合物進(jìn)行修飾，從而與未修飾的化合物的安全性和有效性相比，優(yōu)化或改善修飾化合物的安全性和有效性。24.適用亍治療阿耳茨海默病的如權(quán)利耍求23所述方法鑒別的修飾化合物。25.—種在需要的受試者中治療阿耳茨海默病的方法，所述方法包括給予所述受試者治療有效量的如權(quán)利要求24所述的化合物。26.—種鑒別適用于治療阿耳茨海默病的化合物的方法，所述方法包括a)使非阿耳茨海默對(duì)照細(xì)胞與A卩(l-42)相接觸；b)使來(lái)自步驟(a)的所述細(xì)胞與緩激肽相接觸；C)使來(lái)自步驟(b)的所述細(xì)胞與試驗(yàn)化合物相接觸；d)確定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值，以鑒別適用于治療阿耳茨海默病的化合物。27.-種在受試者中診斷阿耳茨海默病的方法，所述方法包括以下步驟使來(lái)自受試者的細(xì)胞與蛋白激酶C活化劑相接觸，并測(cè)定所述細(xì)胞中特定磷酸化MAP激酶蛋白的比率，以在所述受試者中診斷阿耳茨海默病。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述步驟包括體外試驗(yàn)。29.如權(quán)利要求27所述的方法，所述特定磷酸化MAP激酶蛋白互為序列變體，并且屬亍同一蛋白質(zhì)家族。30.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在亍，所述特定磷酸化MAP激酶蛋白的比率是磷酸化Erkl與磷酸化Erk2的比率，由標(biāo)準(zhǔn)化后的磷酸化Erk2量除以標(biāo)準(zhǔn)化后的磷酸化Erkl量計(jì)算而得。31.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述蛋白激酶C活化劑選自緩激肽、苔蘚抑素、鈴蟾肽、膽囊收縮素、凝血酶、前列腺素F2ct或加壓素。32.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是外周細(xì)胞。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在亍，所述外周細(xì)胞選自皮膚細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、血液細(xì)胞或頰粘膜細(xì)胞。34.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在亍，所述細(xì)胞不是從腦脊液分離的。35.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞不包含腦脊液。36.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞不是通過(guò)腰椎穿剌得到的。37.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述蛋白激酶C活化劑在含血清培養(yǎng)液中與所述細(xì)胞接觸。38.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在亍，所述蛋白激酶C活化劑在無(wú)血清培養(yǎng)基中與所述細(xì)胞接觸。39.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述磷酸化MAP激酶蛋白通過(guò)免疫分析法檢測(cè)。40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述免疫分析是放射免疫分析、蛋白質(zhì)印跡分析、免疫熒光分析、酶免疫分析、免疫沉淀分析、化學(xué)發(fā)光分析、免疫組織化學(xué)分析、免疫電泳分析、斑點(diǎn)印跡分析、或狹縫印跡分析。41.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述測(cè)量采用蛋白芯片、肽芯片或蛋白微陣列芯片進(jìn)行。42.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述方法還包括驗(yàn)證用權(quán)利要求1或IO所述方法得到的阿耳茨海默病的陰性診斷。43.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述方法還包括驗(yàn)證用權(quán)利要求2或11所述方法得到的阿耳茨海默病的陽(yáng)性診斷。44.-4中在受試者中診斷阿耳茨海默病的方法，所述方法包括以下步驟a)使來(lái)自所述受試者的細(xì)胞與蛋白激酶C活化劑相接觸；b)測(cè)定磷酸化第一MAP激酶蛋白與磷酸化第二MAP激酶蛋白的比率，其中所述磷酸化第一和磷酸化第二MAP激酶蛋白是由所述細(xì)胞經(jīng)過(guò)所述接觸步驟之后獲得的；c)測(cè)定未與步驟(a)的試劑接觸的受試者的細(xì)胞中磷酸化第一MAP激酶蛋白與磷酸化第二MAP激酶蛋白的比率，d)從步驟(b)所得比率中減去步驟(c)所得比率；e)基于步驟(d)中計(jì)算的差值診斷所述受試者中是否存在阿耳茨海默病。45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，如果所述步驟(d)得到的差值為正值，則診斷所述受試者患有阿耳茨海默病。46.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，如果所述步驟(d)得到的差值為負(fù)值或零，則表明所述受試者中不存在阿耳茨海默病。47.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述步驟包括體外試驗(yàn)。48.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述第一和第二MAP激酶蛋白互為序列變體。49.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述第一MAP激酶蛋白是Erkl，所述第二MAP激酶蛋白是Erk2。50.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在亍，所述比率是由標(biāo)準(zhǔn)化后的磷酸化Erkl的量除以標(biāo)準(zhǔn)化后的磷酸化Ei"k2的量計(jì)算得到的。51.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述蛋白激酶C活化劑選自緩激肽、苔蘚抑素、鈴蟾肽、膽囊收縮素、凝血酶、前列腺素F2a或加壓素。52.如權(quán)利要求44所述的方法，所述細(xì)胞是外周細(xì)胞。53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述外周細(xì)胞選自皮膚細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、血液細(xì)胞或頰粘膜細(xì)胞。54.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在亍，所述細(xì)胞不是從腦脊液分離的。55.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞不包括腦脊液。56.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞不是通過(guò)腰椎穿刺獲得的。57.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述蛋白激酶C活化劑在含血清培養(yǎng)基中與所述細(xì)胞接觸。58.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述蛋白激酶C活化劑在無(wú)血清培養(yǎng)基中與所述細(xì)胞接觸。59.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述磷酸化MAP激酶蛋白通過(guò)免疫分析法檢測(cè)。60.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述免疫分析是放射免疫分析、蛋白質(zhì)印跡分析、免疫熒光分析、酶免疫分析、免疫沉淀分析、化學(xué)發(fā)光分析、免疫組織化學(xué)分析、免疫電泳分析、斑點(diǎn)印跡分析、或狹縫印跡分析。61.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述測(cè)量采用蛋白芯片、肽芯片或蛋白微陣列芯片進(jìn)行。62.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述方法還包括驗(yàn)證用權(quán)利要求1或IO所述方法得到的阿耳茨海默病的陰性診斷。63.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述方法還包括驗(yàn)證用權(quán)利要求2或11所述方法得到的阿耳茨海默病的陽(yáng)性診斷。64.—種用亍診斷受試者中是否存在阿耳茨海默病的試劑盒，所述試劑盒包括a)蛋白激酶C活化劑；b)磷酸化第MAP激酶蛋白特異性抗體；和c)磷酸化第二MAP激酶蛋白特異性抗體。65.如權(quán)利要求64所述的試劑盒，其特征在于，所述蛋白激酶C活化劑選自緩激肽、苔蘚抑素、鈴蟾肽、膽囊收縮素、凝血酶、前列腺素F2a或加壓素。66.如權(quán)利要求64所述的試劑盒，其特征在亍，所述第-MAP激酶蛋白和所述第二MAP激酶蛋白互為序列變體。67.如權(quán)利要求64所述的試劑盒，其特征在亍，所述第一MAP激酶蛋白是Erld，所述第二MAP激酶蛋白是Erk2。68.如權(quán)利耍求64所述的試劑盒，其特征在于，所述磷酸化第一MAP激酶蛋白特異性抗體是抗-磷酸-Erkl抗體。69.如權(quán)利要求64所述的試劑盒，其特征在亍，所述磷酸化第二MAP激酶蛋白特異性抗體是抗-磷酸-Erk2抗體。70.如權(quán)利要求64所述的試劑盒，所述試劑盒還包含淀粉樣p肽。71.如權(quán)利要求70所述的試劑盒，其特征在于，所述淀粉樣卩肽是Ap(l-42)。72.--種用于診斷在受試者中是否存在阿耳茨海默病的試劑盒，所述試劑盒包含a)淀粉樣p肽；b)磷酸化第一MAP激酶蛋白特異性抗體；和c)磷酸化第二MAP激酶蛋白特異性抗體。73.如權(quán)利要求72所述的試劑盒，其特征在于，所述淀粉樣(3肽是Ap(l-42)。74.—種篩選適用于治療阿耳茨海默病的試驗(yàn)化合物的方法，所述方法包括a)使從診斷患有阿耳茨海默病的受試者分離的細(xì)胞與蛋白激酶C活化劑相接觸，其中，所述接觸步驟在試驗(yàn)化合物的存在下進(jìn)行；b)測(cè)定磷酸化第-MAP激酶蛋白與磷酸化第二MAP激酶蛋白的比率，其中，所述磷酸化第--和第二MAP激酶蛋白是由所述細(xì)胞經(jīng)過(guò)所述步驟(a)的接觸步驟之后獲得的；c)測(cè)定來(lái)自未與步驟(a)的試驗(yàn)化合物相接觸的受試者的細(xì)胞中磷酸化第--MAP激酶蛋白與磷酸化第二MAP激酶蛋白的比率；d)從步驟(b)的比率中減去步驟(c)的比率；e)基于步驟(d)計(jì)算的差值鑒別適用于治療阿耳茨海默病的試驗(yàn)化合物。75.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，如果步驟(d)計(jì)算的差值為負(fù)值或零，則所述差值指示了適用于治療阿耳茨海默病的試驗(yàn)化合物。76.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在亍，所述步驟包括體外試驗(yàn)。77.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述齊--和第::::::::MAP激酶蛋白互為序列變體。78.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在亍，所述第-MAP激酶蛋白是Erkl，所述第二MAP激酶蛋白是Erk2。79.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在亍，所述比率是由標(biāo)準(zhǔn)化后的磷酸化Erkl的量除以標(biāo)準(zhǔn)化后的磷酸化Erk2的量計(jì)算得到的。80.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述蛋白激酶C活化劑選自緩激肽、苔蘚抑素、鈴蟾肽、膽囊收縮素、凝血酶、前列腺素F2a或加壓素。81.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是外周細(xì)胞。82.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述外周細(xì)胞選自皮膚細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、血.液細(xì)胞或頰粘膜細(xì)胞。83.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞不是從腦脊液分離的。84.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞不包括腦脊液。85.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞不是通過(guò)腰椎穿刺獲取的。86.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述蛋白激酶C活化劑在含血清培養(yǎng)基中與所述細(xì)胞接觸。87.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述蛋白激酶C活化劑在無(wú)血清培養(yǎng)基中與所述細(xì)胞接觸。88.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述磷酸化MAP激酶蛋白通89.如權(quán)利要求88所述的方法，其特征在于，所述免疫分析是放射免疫分析、蛋白質(zhì)印跡分析、免疫熒光分析、酶免疫分析、免疫沉淀分析、化學(xué)發(fā)光分析、免疫組織化學(xué)分析、免疫電泳分析、斑點(diǎn)印跡分析或狹縫印跡分析。90.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)采用蛋白芯片、肽芯片或蛋白微陣列芯片進(jìn)行。91.一種在受試者中監(jiān)測(cè)阿耳茨海默疾病進(jìn)程的方法，所述方法包括測(cè)定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記。92.如權(quán)利要求91所述的方法，所述方法還包括在一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)定所述阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記。93.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記數(shù)值降低表明所述受試者中阿耳茨海默病的發(fā)展。94.一種適用于治療阿耳茨海默病的組合物，所述組合物包含如權(quán)利要求74所述方法鑒別的化合物。95.—種適合在需要的受試者中治療阿耳茨海默病的藥物組合物，所述組合物包含治療有效量的如權(quán)利要求74所述方法鑒別的化合物。96.—種治療阿耳茨海默病的方法，所述方法包括給予需要的受試者治療有效量的如權(quán)利要求95所述的藥物組合物。全文摘要本發(fā)明涉及阿耳茨海默病的診斷方法以及驗(yàn)證受試者中是否存在阿耳茨海默病的方法。本發(fā)明還涉及鑒別適用于治療阿耳茨海默病的先導(dǎo)化合物的方法，該方法包括使非-阿耳茨海默病細(xì)胞與淀粉樣β肽相接觸，用蛋白激酶C活化劑刺激細(xì)胞，使細(xì)胞與試驗(yàn)化合物相接觸，以及測(cè)定阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記的值。本發(fā)明還涉及在受試者中診斷阿耳茨海默病的方法，該方法包括檢測(cè)用蛋白激酶C活化劑刺激后細(xì)胞中特定磷酸化MAP激酶蛋白的比率變化。本文所述阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記適用于在受試者中診斷阿耳茨海默病，監(jiān)測(cè)阿耳茨海默病的進(jìn)程以及鑒別能夠治療或預(yù)防阿耳茨海默病的化合物的篩選方法。本發(fā)明還涉及試劑盒，其包含采用本文所述的阿耳茨海默病特異性分子生物標(biāo)記來(lái)檢測(cè)和診斷阿耳茨海默病存在與否的反應(yīng)試劑。文檔編號(hào)G01N33/68GK101322032SQ200680045410公開(kāi)日2008年12月10日申請(qǐng)日期2006年9月25日優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日發(fā)明者D·L·阿爾康,T·K·卡恩申請(qǐng)人:布朗歇特洛克菲勒神經(jīng)科學(xué)研究所