專利名稱：具有提高的信-噪比和提高的精度的傳感器的制作方法
具有提高的信-噪比和提高的精度的傳感器
本發(fā)明涉及發(fā)光傳感器，諸如是發(fā)光生物傳感器或發(fā)光化學(xué)傳感器， 其包括用于調(diào)制激發(fā)束的調(diào)制裝置，利用該激發(fā)束照明傳感器。本發(fā)明還 涉及用于探測分析物分子的方法，此探測通過光學(xué)地可變的分子，例如通 過樣品中總是發(fā)光或僅當(dāng)連接到基底時才發(fā)光的例如熒光團(tuán)的發(fā)光團(tuán)，或 通過連接到基底的當(dāng)分析物分子與它們結(jié)合時發(fā)光的發(fā)光團(tuán)，此探測使用 根據(jù)本發(fā)明的傳感器。
傳感器廣泛用于測量物理屬性或物理事件(physical event)。它們作為 電、光或數(shù)字信號輸出測量的功能性讀數(shù)。該信號是能夠由其它設(shè)備轉(zhuǎn)換 成信息的數(shù)據(jù)。傳感器的特別的范例是生物傳感器。生物傳感器是探測目 標(biāo)分子的存在(即定性的)或測量一定量(即定量的)目標(biāo)分子的設(shè)備， 該目標(biāo)分子諸如例如是，但不限于，諸如例如血液、血清、血漿、唾液等 的流體中的蛋白質(zhì)、病毒、細(xì)菌、細(xì)胞成分、細(xì)胞膜、孢子、DNA、 RNA 等。目標(biāo)分子也稱作"分析物"。在幾乎所有情況下，生物傳感器使用包括 用于捕獲分析物的特定識別元件的表面。因此，可以通過連接特定的分子 到傳感器設(shè)備的表面來更改它，該特定分子適于結(jié)合流體中存在的目標(biāo)分 子。
為了分析物與特定分子的最佳結(jié)合效率，大的表面區(qū)域和短的擴(kuò)散長 度是很有利的。因此，已經(jīng)提出將微或納可滲透基底(膜)作為生物傳感 器基底，其以迅速的結(jié)合動力學(xué)結(jié)合大的區(qū)域。尤其是當(dāng)分析物濃度低時 (例如lnM以下或lpM以下)，擴(kuò)散動力學(xué)在生物傳感器化驗的整個執(zhí)行 中起重要作用。
可以通過例如熒光的發(fā)光來探測結(jié)合的分析物的量。在此情況下，分 析物本身可以攜帶例如熒光的發(fā)光標(biāo)簽(labd)，或可選地可以執(zhí)行具有例 如熒光地標(biāo)注的發(fā)光地標(biāo)注的第二識別元件的附加的潛伏。
探測結(jié)合的分析物的量能夠受到數(shù)個因素的阻礙，諸如光的散射、發(fā)光團(tuán)的褪色、基底的背景發(fā)光及未完全去除的激發(fā)光。此外，為了能夠辨 別結(jié)合的標(biāo)簽和溶液中的標(biāo)簽，有必要執(zhí)行一個或多個沖洗步驟以去除未 結(jié)合的標(biāo)簽。
然而，當(dāng)試圖探測單個珠子的例如熒光的發(fā)光時，測量的例如熒光信 號的發(fā)光信號中的噪聲變得重要。由于此噪聲，在探測例如熒光團(tuán)的發(fā)光 團(tuán)時，可能會給出假陽性或假陰性。假陽性指測量錯誤地表示了例如熒光 團(tuán)的發(fā)光團(tuán)的存在的事件，這里實際上是測量背景。假陰性指測量漏看了 例如熒光團(tuán)的發(fā)光團(tuán)的存在的事件。這些假陽性或假陰性的出現(xiàn)使得難于 以嘈雜的信號/背景比探測單個例如熒光團(tuán)的發(fā)光團(tuán)。
此外，當(dāng)單個例如熒光團(tuán)的發(fā)光團(tuán)的直徑小于激發(fā)斑點的大小時，則 例如熒光信號的發(fā)光信號中的背景噪聲依賴于利用激發(fā)束照明的總的區(qū) 域，因為斑點不僅照明例如熒光團(tuán)的發(fā)光團(tuán)，而且還照明其環(huán)境。此環(huán)境 引起背景信號，其導(dǎo)致差的信-噪比或信號-背景比，因為信號-背景比受限 于斑點的有限大小(衍射限定)。
本發(fā)明的目的是提供具有提高的信號-背景比和/或提高的精度的傳感 器和用于使用該傳感器探測樣品中發(fā)光團(tuán)的方法。 上述目的通過根據(jù)本發(fā)明的方法和設(shè)備實現(xiàn)。
本發(fā)明的細(xì)節(jié)的和優(yōu)選的方面在所附的獨立和從屬權(quán)利要求中提出。 從屬權(quán)利要求的特征可以與獨立權(quán)利要求的特征和與其它從屬權(quán)利要求的 特征結(jié)合，如合適的而不僅是在權(quán)利要求中清楚地提出的。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種方法，用于探測樣品中或樣品上的 光學(xué)地可變的分子，該方法包括
-在第一方向上相對于激發(fā)輻射束移動該樣品，據(jù)此激發(fā)該光學(xué)地可變 的分子并且從而生成發(fā)光信號，以及
-探測該生成的發(fā)光信號，
其中，該方法還包括在探測該發(fā)光信號時空間地調(diào)制該激發(fā)輻射束相 對于該樣品的相對位置，該調(diào)制在不同于該第一方向的第二方向上提供該 樣品相對于該激發(fā)輻射束的相對移動。
相對移動能夠包括在第一方向和第二方向上相對于該樣品移動該激發(fā)輻射束，或在兩個方向上相對于該激發(fā)輻射束移動該樣品，或能夠包括該 兩個移動的一個，即該激發(fā)束相對于該樣品的移動，和該兩個移動的第二 個，即相對于該激發(fā)輻射束移動該樣品。
該激發(fā)輻射束可以例如是單個激發(fā)輻射束。
光學(xué)地可變的分子可以是用于發(fā)光分析的任何合適的分子，例如用于 標(biāo)注分析物分子的分子，并且在由照明束輻照時其總是發(fā)光。結(jié)合的光學(xué) 地可變的分子是可看見的，而未結(jié)合的光學(xué)地可變的分子被沖洗掉?？蛇x 地，光學(xué)地可變的分子可以是用于標(biāo)注分析物分子的標(biāo)記分子，并且它們 僅在結(jié)合到連接到基底的分子時才發(fā)光。這造成施主-受主對。沖洗用于獲 得嚴(yán)格。輕微結(jié)合的分子被沖洗掉。在另一實施例中，連接到基底的分子 在與分析物分子結(jié)合時發(fā)光。沖洗用于獲得嚴(yán)格。輕微結(jié)合的分子被沖洗 掉。
在根據(jù)本發(fā)明的第一方面的優(yōu)選實施例中，第二方向可以基本垂直于 第一方向。
根據(jù)本發(fā)明的方法給出具有提高的信-噪比(SNR)和提高的精度的例 如熒光的發(fā)光信號。通過使用減小電噪聲并至少部分地去除背景信號的調(diào) 制方案獲得提高的SNR。獲得提高的精度的一個原因是由假陽性引起的信 號能夠由使用根據(jù)本發(fā)明的方法最小化。假陽性指測量錯誤地表示了存在 光學(xué)地可變的分子的事件，這里實際上是測量背景。這些假陽性的出現(xiàn)使 得難于以嘈雜的信號/背景比探測單個光學(xué)地可變的分子，例如熒光團(tuán)。因 此，通過最小化來自假陽性的信號，根據(jù)本發(fā)明的方法給出具有提高精度 的信號。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法還可以包括解調(diào)探測的發(fā)光信號，從而 生成解調(diào)的信號。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，該解調(diào)的信號的符號和/或幅度可以用作針對該 光學(xué)地可變的分子(9)的位置的誤差信號。
可以利用第一頻率執(zhí)行調(diào)制，并且用于解調(diào)的解調(diào)信號可以具有第二 頻率，該第一和第二頻率不同。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第二頻率或用于解 調(diào)探測的發(fā)光信號的頻率可以是調(diào)制頻率的兩倍或任何其它因子。在此情 況下，根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于從探測的發(fā)光信號去除背景信號，如通過根據(jù)這些實施例解調(diào)探測的信號，可以獲得解調(diào)的信號，其中，背景信 號被最小化或甚至完全去除。
在根據(jù)本發(fā)明的另外的實施例中，第二頻率，即用于解調(diào)探測的發(fā)光 信號的頻率可與第一或調(diào)制頻率相同。通過使用根據(jù)此另外的實施例的方 法，能夠定位光學(xué)地可變的分子。
在根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的實施例中，激發(fā)輻射束的斑點具有大小并且 該方法進(jìn)一步包括
-從該探測的發(fā)光信號確定該光學(xué)地可變的分子相對于該激發(fā)輻射束的 相對位置，
-相對該光學(xué)地可變的分子使該激發(fā)輻射束居中， -減小該斑點的大小，以及 -確定進(jìn)一步生成的發(fā)光信號。
為了居中，或者束能夠相對于樣品移動，或者樣品能夠相對于束移動。
在另一實施例中，方法還可以包括使用該進(jìn)一步生成的發(fā)光信號確定 該生成的發(fā)光信號是否表示假陽性。這些假陽性的出現(xiàn)使得難于以嘈雜的 信號/背景比探測單個光學(xué)地可變的分子，例如熒光團(tuán)。因此，通過最小化 來自假陽性的信號，可以提高根據(jù)本發(fā)明的方法的精度。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種傳感器，用于探測樣品中或樣品上 的光學(xué)地可變的分子。該傳感器包括
-激發(fā)輻射源，用于生成激發(fā)輻射束，
-掃描裝置，用于在第一方向上該激發(fā)輻射束相對于該樣品的移動，以 掃描該樣品，
其中，該傳感器還包括調(diào)制裝置，用于空間地調(diào)制該激發(fā)輻射束相對 于該樣品的相對位置，以在不同于該第一方向的第二方向上提供該激發(fā)輻 射束相對于該樣品的相對移動。
相對移動能夠包括在第一方向和第二方向上相對于該樣品移動該激發(fā) 輻射束，或在兩個方向上相對于該激發(fā)輻射束移動該樣品，或能夠包括該 兩個移動的一個，即該激發(fā)束相對于該樣品的移動，和該兩個移動的第二 個，即相對于該激發(fā)輻射束移動該樣品。
該激發(fā)輻射束可以例如是單個^[發(fā)輻射束。在根據(jù)本發(fā)明的第一方面的優(yōu)選實施例中，第二方向可以基本垂直于 第一方向。
根據(jù)本發(fā)明的方法給出具有提高的信-噪比(SNR)和/或提高的精度的 例如熒光的發(fā)光信號。在本發(fā)明的一方面中，通過使用減小電噪聲并至少 部分地去除背景信號的調(diào)制方案獲得提高的SNR。獲得提高的精度的一個 原因是由假陽性引起的信號能夠由使用根據(jù)本發(fā)明的方法最小化。假陽性 指測量錯誤地表示了存在光學(xué)地可變的分子的事件，這里實際上是測量背 景。這些假陽性的出現(xiàn)使得難于以嘈雜的信號/背景比探測單個光學(xué)地可變 的分子，例如熒光團(tuán)。因此，通過最小化來自假陽性的信號，根據(jù)本發(fā)明 的方法給出具有提高精度的信號。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，該傳感器還包括探測器，用于探測由光學(xué)地可 變的分子在被利用激發(fā)輻射束輻照時生成的發(fā)光信號。該探測器可以例如 是電荷耦合器件(CCD)探測器、相機(jī)或互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS) 探測器，但是也包括光學(xué)傳感器或顯微鏡。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，該傳感器還包括解調(diào)裝置，用于解調(diào)該探測的 發(fā)光信號。該解調(diào)裝置可以是例如鎖定放大器。
從結(jié)合附圖的以下詳細(xì)描述，本發(fā)明的以上和其它特性、特征和優(yōu)點 將變得明顯，其通過范例的方式示例本發(fā)明的原理。此描述僅是為范例給 出，而不是限制本發(fā)明的范圍。以下引用的參考圖指附圖。


圖1是根據(jù)本發(fā)明的實施例的傳感器的示意圖2示例了根據(jù)本發(fā)明的實施例的方法；
圖3示出了被相對于激發(fā)輻射束的調(diào)制居中的發(fā)光團(tuán)；
圖4相對于激發(fā)輻射束的位置示例了發(fā)光團(tuán)的大?。?br> 圖5示出了作為關(guān)于激發(fā)輻射束的發(fā)光團(tuán)的位置的函數(shù)的發(fā)光團(tuán)的響
應(yīng)；
圖6示例了調(diào)制頻率f=l和幅度A=l的激發(fā)輻射束的時間依賴的位
置；
圖7示出時間中的歸因于激發(fā)斑點的可變位置的發(fā)光響應(yīng)；
圖8示出了針對沒有被相對于激發(fā)輻射束居中的發(fā)光團(tuán)和針對等于調(diào)制頻率的參考信號的作為激發(fā)輻射束相對于發(fā)光團(tuán)的位置的函數(shù)的解調(diào)的
信號；
圖9示出了針對沒有被相對于激發(fā)輻射束居中的發(fā)光團(tuán)和針對等于調(diào) 制頻率的兩倍的參考信號的作為激發(fā)輻射束相對于發(fā)光團(tuán)的位置的函數(shù)的 解調(diào)的信號；
圖10示意性地示例了較小的激發(fā)斑點能夠如何提高信-噪比； 圖11至圖13示例了發(fā)光團(tuán)相對于激發(fā)輻射束的不同位置和對應(yīng)的參 考和發(fā)光信號。
在不同的圖中，相同的參考標(biāo)記指相同或類似的元件。
將參照具體實施例和參照某些附圖描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不限于此， 而是僅由權(quán)利要求限定。權(quán)利要求中的任何參考標(biāo)記不應(yīng)視為限定范圍。 描述的附圖僅是示意性的而不是限定性的。在附圖中，為示例目的， 一些 元件的大小被放大并且沒有按比例繪制。在本說明書和權(quán)利要求中使用術(shù) 語"包括"的地方，不排除其它元件或步驟。在使用"一個"、"該"的不 定冠詞或定冠詞引用單數(shù)名詞的地方，這包括多個該名詞，除非定外地特 別說明。
此外，說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語第一、第二、第三等用于區(qū)別兩個 類似的元件并且不必用于描述順次或按時間順序排列的次序。應(yīng)當(dāng)理解， 如此使用的術(shù)語在合適的環(huán)境下是可以互換的，并且于此描述的本發(fā)明的 實施例能夠以不同于于此描述或示例的那些的順序操作。
在一個方面，本發(fā)明提供了用于探測存在于樣品或介質(zhì)中或樣品或介 質(zhì)上的至少一個例如發(fā)光團(tuán)或發(fā)光分子的"光學(xué)地可變的分子"的方法。 該分子能夠例如是熒光的、電致發(fā)光的、化學(xué)發(fā)光的分子等。然后光學(xué)地 可變的分子可以用于標(biāo)注存在于介質(zhì)中的分析物。
在標(biāo)注分析物中使用光學(xué)地可變的分子至少存在三種可能的情形
1 )利用總是例如發(fā)熒光的發(fā)光的光學(xué)地可變的分子標(biāo)注分析物分子。 結(jié)合到捕獲分子(例如連接到基底)的那些分子能夠被看見，所有其它光 學(xué)地可變的分子能夠被沖洗掉。
2)利用僅當(dāng)結(jié)合到連接到基底的分子的分子時才例如發(fā)熒光的發(fā)光的標(biāo)記分子標(biāo)注分析物分子。在那種方式中，形成施主受主對。在那種情況 下使用沖洗步驟用于獲得嚴(yán)格，因為輕微結(jié)合的分子將被沖洗掉。
3)連接到基底的分子當(dāng)結(jié)合到分析物分子時發(fā)光，例如發(fā)熒光。再次 使用沖洗用于獲得嚴(yán)格，因為輕微結(jié)合的分子將被沖洗掉。
本發(fā)明將描述光學(xué)地可變的分子，即發(fā)光標(biāo)簽，光學(xué)地可變的分子連 接到介質(zhì)中的分析物，分析物結(jié)合到被沖洗掉的識別標(biāo)簽，當(dāng)由掃描傳感 器并撞擊到該標(biāo)簽上的照明束輻照時，標(biāo)簽發(fā)光。在進(jìn)一步的描述中，術(shù) 語"發(fā)光分子"和"發(fā)光團(tuán)"將被用作同義詞。應(yīng)當(dāng)理解，這不是限定本 發(fā)明，并且本發(fā)明在上述其它情況下也適用。
根據(jù)本發(fā)明的方法包括相對于要測量的樣品空間地調(diào)制激發(fā)輻射束的 位置。根據(jù)本發(fā)明，這導(dǎo)致具有提高的信-噪比的探測信號。本發(fā)明，在另 一方面，提供發(fā)光傳感器，諸如例如發(fā)光生物傳感器或發(fā)光化學(xué)傳感器， 具有提高的信-噪比，適于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法。因此，根據(jù)本發(fā)明的傳 感器包括用于根據(jù)本發(fā)明的方法空間地調(diào)制激發(fā)輻射束和樣品的相對位置 的調(diào)制裝置。
當(dāng)處理單分子探測時，能夠使用激發(fā)輻射束和樣品的相對位置的空間 調(diào)制以提高信-噪比和/或以找到例如熒光團(tuán)的發(fā)光團(tuán)的位置。在后面的情況 下，激發(fā)輻射束和樣品的相對位置的空間調(diào)制能夠用于局域化例如熒光團(tuán) 的發(fā)光團(tuán)，并隨后將激發(fā)輻射束居中在例如熒光團(tuán)的發(fā)光團(tuán)上(進(jìn)一步參 昭)。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，相對于例如熒光分子的發(fā)光分子空間地調(diào)制激 發(fā)輻射束的位置。
以下，將描述根據(jù)本發(fā)明的實施例的用于探測至少一個例如熒光團(tuán)的 發(fā)光團(tuán)的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生具有提高的信-噪比(SNR)和/或具 有提高的精度的探測信號。根據(jù)本發(fā)明，通過空間地調(diào)制從激發(fā)輻射源發(fā) 出并用于輻照例如熒光團(tuán)的發(fā)光團(tuán)以激發(fā)它們的激發(fā)輻射束，提高了 SNR。 激發(fā)后，例如熒光團(tuán)的發(fā)光團(tuán)將發(fā)射具有特定強(qiáng)度A的例如熒光輻射的發(fā) 光輻射。
圖1中，示出了根據(jù)本發(fā)明的傳感器系統(tǒng)的實施例的示意圖。此圖中， 示出了能夠用于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法的傳感器的可能實施。例如光源的^:發(fā)輻射源i將例如光的激發(fā)輻射束2導(dǎo)引到包括至少一個例如熒光的發(fā) 光分子(圖i中未示出)的樣品板3上。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以使用
不同的激發(fā)輻射源l，諸如例如多斑光源，使用例如Talbot效應(yīng)用于成像。 可選地，可以使用例如聚焦的激光斑的聚焦的光斑作為輻射束2。通過移動 激發(fā)輻射源1的位置和/或通過相對于固定的激發(fā)輻射源1調(diào)制激發(fā)輻射束 2的位置，或通過相對于輻射束2移動樣品板3，能夠改變激發(fā)輻射束2的 位置。例如，樣品可以放置在X-Y臺架上并且能夠移動X-Y臺架的位置以 由此改變樣品和束的相對位置。根據(jù)本發(fā)明的一方面，通過在從第一位置 到第二位置的第一方向上相對于樣品板移動激發(fā)輻射束(掃描移動)，據(jù)此 掃描樣品板3，和通過在不同于第一方向并且優(yōu)選地基本垂直于第一方向的 第二方向上在第一方向的每個位置相對于樣品板調(diào)制激發(fā)輻射束2的位置， 改變了激發(fā)輻射束2相對于樣品板3的位置。通過調(diào)制裝置4執(zhí)行對激發(fā) 輻射束2的位置的調(diào)制?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的適合的調(diào)制裝置4的范例 是聲光調(diào)制器(AOM)、棱鏡對、多模干涉儀(通過改變輸入束的焦平面)、 利用電或壓力元件移動的反射鏡或液晶。
圖2中，示例了根據(jù)本發(fā)明的方法的基本原理。從而，根據(jù)本發(fā)明的 一方面，激發(fā)輻射束2在從第一位置A到第二位置B的第一方向(圖2中 由參考數(shù)字5表示)上掃描包括例如熒光分子的發(fā)光分子的樣品板3。在此 第一移動5上，激發(fā)輻射束2在第二方向(由圖2中箭頭6表示)施行第 二移動，第二方向6不同于第一方向5，并且優(yōu)選地基本垂直于第一方向5。 第二移動(由箭頭6表示)優(yōu)選地是在掃描移動上執(zhí)行的周期移動，并且
一種可能是在第一位置A和第二位置B之間每個點處的位置X,、 X2.....
X0附近以頻率f振蕩。調(diào)制后的激發(fā)輻射束2的部分將稱作調(diào)制的信號2b。
通過探測器8測量例如熒光輻射的發(fā)光輻射7，其由例如熒光分子的發(fā) 光分子被利用例如激發(fā)光的激發(fā)輻射2，更具體地通過調(diào)制的信號2b輻照 時發(fā)射。根據(jù)本發(fā)明的實施例，探測器8可以是用于探測發(fā)光輻射7的任 何適合的探測器，諸如例如電荷耦合器件(CCD)或相機(jī)或互補(bǔ)金屬氧化 物半導(dǎo)體(CMOS)探測器、光電二極管或其陣列、光晶體管或其陣列、相 機(jī)或顯微鏡?？蛇x地，掃描途徑可以用于探測器，其中，探測器包括有限 數(shù)量的探測單元并且僅獲得小的成像視野(view)。然后以使得可以獲得最佳的信-噪比的方式在例如光電二極管的探測器單元上收集例如熒光輻射的發(fā)光輻射7—定的時間。這可以基本上提高傳感器的靈敏度。在由探測器8 探測后，可以利用諸如例如鎖定放大器的適合的解調(diào)裝置來解調(diào)探測的信 號。上文中，通過實施用于執(zhí)行如本發(fā)明的方法的特定傳感器，已經(jīng)描述 了根據(jù)本發(fā)明的實施例的方法。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明也能夠應(yīng)用其它 的傳感器的實施。例如，在以上描述中，傳感器用于透射模式中。這意指 激發(fā)輻射源1安置于傳感器的第一側(cè)而用于探測例如熒光的發(fā)光輻射7的 探測器8安置在傳感器的第二側(cè)，第一和第二側(cè)相對于傳感器彼此反向。 在另一實施中，傳感器可以用于反射模式中，即激發(fā)輻射源1從而可以安 置在傳感器的與探測器6相同的側(cè)。是使用反射模式還是使用透射模式依 賴于用于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法的傳感器的類型。理論上，為了獲得表示樣品板3上存在(定性和定量)發(fā)光團(tuán)并且適 合用于特定應(yīng)用(進(jìn)一步參照)的解調(diào)的發(fā)光信號，可以考慮相對于激發(fā) 輻射2朝向例如熒光分子的發(fā)光分子7的位置和針對調(diào)制的頻率的四個不 同的可能設(shè)置。在描述根據(jù)本發(fā)明的具體實施例之前，將討論這四種理論 情況。在第一理論情況下，如圖3中所示例，將例如熒光的發(fā)光分子9在第 二方向6上相對于激發(fā)輻射束2的位置的調(diào)制居中。在此第一情況下，例 如熒光的發(fā)光分子9從而假定為安置在x=0的位置(這意指在激發(fā)輻射束 2的位置的調(diào)制移動的中心(參照圖3)，并且具有大小s。大小s定義為例 如熒光分子的發(fā)光分子9的橫截面的大小的一半，如圖4中所示例。從激 發(fā)輻射源1發(fā)出的激發(fā)輻射束2在調(diào)制方向6上以調(diào)制頻率f從位置x二一 Z到x二+Z被移動或調(diào)制，圖3中示例的范例中，從x二一2到x二+2。 圖5作為調(diào)制的激發(fā)輻射束2b的位置的函數(shù)示出了發(fā)射的例如熒光輻射的 發(fā)光輻射7。在圖5中給出的范例中，從激發(fā)輻射源1發(fā)出的激發(fā)輻射束2 被從位置x= —1到x= + l調(diào)制。這樣能夠描述例如熒光的發(fā)光分子9對 調(diào)制的激發(fā)輻射束2b的響應(yīng)為這意指僅當(dāng)激發(fā)輻射束2在發(fā)光分子的位置，或換句話說，當(dāng)激發(fā)輻 射束2的位置使得發(fā)光分子9至少部分地由此激發(fā)輻射束2輻照時，發(fā)光 分子9將發(fā)射發(fā)光輻射7。根據(jù)本發(fā)明，周期地進(jìn)行激發(fā)輻射束2的位置的調(diào)制。因此，從以上 和如已經(jīng)描述的，激發(fā)輻射束2的移動是雙重的。第一移動施行在激發(fā)輻 射束2上，用于在第一或掃描方向5上從第一位置(范例中給定為A)到 第二位置(范例中給定為B)掃描包括例如熒光的發(fā)光分子9的樣品。此 外，在第一和第二位置之間的每個位置x處，第二方向6上的第二周期移 動應(yīng)用于激發(fā)輻射束2。例如，此周期移動能夠基本垂直于第一移動的第一 方向5。第二移動在進(jìn)一步的討論中稱作調(diào)制并且具有驅(qū)動頻率f和幅度A。激發(fā)輻射束2的位置x從而能夠由時間t的周期函數(shù)描述<formula>formula see original document page 14</formula> (2)例如，利用f=l和A=l， x(t)看起來如圖6中所示例的。 為了確定例如熒光的發(fā)光輻射7，由F(t)表示，其由例如熒光的發(fā)光分子9在被利用在位置x處的調(diào)制的激發(fā)輻射束2b輻照時生成，需要組合方程(1)和(2)，產(chǎn)生<formula>formula see original document page 14</formula> (3)如果與調(diào)制幅度或調(diào)制深度相比，例如熒光的發(fā)光分子9的大小是小 的(s A)，則通過假設(shè)3=0，當(dāng)考慮該假設(shè)時將給定發(fā)光分子9在第二方 向上相對于激發(fā)輻射束2的位置的調(diào)制居中，此方程能夠近似為 'A pcos(/.2兀<formula>formula see original document page 14</formula>1 7 1功h: j y (6)4/ 2/當(dāng)在曲線圖中顯示時，就八=1，方程(6)如圖7中所示例的，其示出 了歸因于激發(fā)輻射束2在時間上的位置變化的例如熒光的發(fā)光響應(yīng)(圖7 中由參考數(shù)字10表示)。從此數(shù)字能夠看到，在時間上，例如熒光的發(fā)光 輻射7由周期峰(由參考數(shù)字ll表示)描述。這些周期峰對應(yīng)于激發(fā)輻射 束2經(jīng)過存在于樣品板3上的發(fā)光分子9的每個時間。然后通過以參考信號R(t)乘以測得的例如熒光的發(fā)光信號F(t)，并隨后 在一定的時間范圍積分該結(jié)果，能夠確定解調(diào)的信號S。為了示出恒定的背 景信號的影響，增加額外的項B(t)，其描述恒定的背景信號為B(t)二b:S= JX。+M/))^Vf (7)參考信號R(t)幅度為D并根據(jù)此第一情況，假定在某一時間t參考信號 R(t)的頻率為激發(fā)輻射束2的位置的驅(qū)動頻率f的兩倍。則參考信號R(t)的 頻率等于2f并且R(t)能夠?qū)懽鱥 W = Z) cos(2/.2tc /+<()) = cos(/.4兀_/+())) (8)其中0)是相位項。將方程(8)插入方程(7)產(chǎn)生5= f(尸(/)+5(/))Dcos(/.4兀J+()))^ (9)或?qū)τ诤愣ǖ谋尘靶盘?問l5= J*(i^)+6)Dcos(/.47t.f+<l))A (10)f=0此積分能夠分離為兩部分:1 2 方程(11)的部分1描述歸因于例如熒光的發(fā)光分子9被利用調(diào)制的激發(fā)輻射束2b輻照的例如熒光的發(fā)光輻射7，而部分2描述歸因于背景的 例如熒光的發(fā)光輻射。能夠看到背景信號對解調(diào)的信號S的影響為0，因為當(dāng)時間tl足夠長 時，方程(11)的部分2等于零。于是解調(diào)的信號等于<formula>formula see original document page 16</formula>(12)其中<formula>formula see original document page 16</formula>(13)從以上討論能夠得到結(jié)論，根據(jù)本發(fā)明的調(diào)制的激發(fā)輻射束2b能夠用 于從例如熒光的發(fā)光信號7去除背景信號。以下，將確定解調(diào)的例如熒光的發(fā)光信號S。將積分重新寫入和中是可 能的。原理上，這通過計數(shù)F(t)中的多個峰(參照圖7)的影響來進(jìn)行，其 依賴于當(dāng)激發(fā)輻射束2經(jīng)過時例如熒光的發(fā)光分子9的曝光時間t。此時間 依賴于激發(fā)輻射束2的速度，其給出為<formula>formula see original document page 16</formula> (14)如果與調(diào)制幅度或調(diào)制深度相比，例如熒光的發(fā)光分子9的大小是小 的(s A)，則例如熒光的發(fā)光分子9對激發(fā)輻射束2的暴光時間能夠近似為<formula>formula see original document page 16</formula>(15)方程(12)的積分于是變?yōu)?S=E入Dcos(/.4兀J+({>).4/".2兀sin(/.2jc力其中，在以下情況，和超過t的值<formula>formula see original document page 16</formula>(16)<formula>formula see original document page 16</formula>(17a)<formula>formula see original document page 16</formula> (17b)<formula>formula see original document page 17</formula>(18)(19)k的最大值依賴于振蕩中的周期數(shù)。周期數(shù)由調(diào)制的頻率f和總積分時 間to給出<formula>formula see original document page 17</formula>方程(19)然后變成:(20b)5 =cos(兀+()))(21)方程(21)的結(jié)果意指解調(diào)的信號S將具有恒定的值，依賴于參考信 號R(t)的相位O。從以上，能夠得出結(jié)論如果將發(fā)光分子9的位置相對于激發(fā)輻射束2 的位置的調(diào)制居中，則當(dāng)使用頻率為調(diào)制頻率f的二倍的參考信號用于解調(diào) 時，解調(diào)的信號S將不依賴于恒定的背景信號并且將直接與發(fā)光信號7成 比例。因此，激發(fā)輻射束2相對于例如熒光的發(fā)光分子9的位子的和用于調(diào) 制的參考信號R(t)(即從激發(fā)輻射源1發(fā)出的激發(fā)輻射束2a)相對于調(diào)制 的頻率的頻率的設(shè)置，能夠獲得例如熒光的發(fā)光輻射信號，其在調(diào)制后顯 示出沒有或基本沒有背景信號并且因此相對于現(xiàn)有技術(shù)傳感器具有提高的 信-噪比。接下來，將描述第二理論情況以表示當(dāng)與第一情況相同的情形發(fā)生時，但是當(dāng)現(xiàn)在參考信號使用與調(diào)制頻率f相同的頻率時，不能獲得有用的結(jié)果。因此，在此第二情況下，例如熒光的發(fā)光分子9安置在激發(fā)輻射束2 的調(diào)制的中心，并且用于解調(diào)的參考信號R(t)的頻率與調(diào)制的頻率f相同。 使用與第一情況中類似的計算，能夠表明在此第二情況下獲得了等于零的 解調(diào)信號S，因此，為了收集信息，將不使用它。 在此第二情況，解調(diào)的信號S給出為<formula>formula see original document page 18</formula>(22)其中使用方程(15)，解調(diào)的信號S能夠?qū)懽?<formula>formula see original document page 18</formula>使用方程(17)，這變成<formula>formula see original document page 18</formula>從方程(26)，能夠看出，解調(diào)的信號依賴于。0《"".冗+ ^并且余弦乂2 乂的幅角包括k.tt。由于此，余弦將周期地給出正值，緊跟相同但負(fù)的值。當(dāng)將此加和時，結(jié)果將等于零。因此能夠得出結(jié)論如果相對于激發(fā)輻射束2的調(diào)制將例如熒光的發(fā)光分子9的位置居中，則如果參考信號R(t)的頻率與調(diào)制頻率f相同，解調(diào) 的信號S將為零，而當(dāng)用于解調(diào)的參考信號R(t)的頻率等于調(diào)制頻率的二 倍時，獲得有用的結(jié)果。在另一理論情況下，沒有相對于激發(fā)輻射束2的調(diào)制將例如熒光的發(fā)光分子9居中，并且參考信號R(t)的頻率與調(diào)制頻率f相同。因此，在此情 況下，例如熒光的發(fā)光分子9不位于如第一和第二情況下x=0的位置處， 但是現(xiàn)在假設(shè)為位于x-xo處，其中xo不同于零[_0 j;c-;tol》(27)激發(fā)輻射束2的位置x能夠仍然通過如方程(2)中的時間t的周期函 數(shù)來描述。于是，能夠以與第一和第二情況下類似的方式計算例如熒光的 發(fā)光信號F(t)為尸(0-/(;^)) = /(^咖(/.2^)) (28)"[o lcos(/.2兀./)-義0|;>(29)解調(diào)信號R(t)與例如熒光的發(fā)光信號F(t)有相同的頻率并且因此在給定的情況下，解調(diào)頻率與調(diào)制頻率f相同。解調(diào)的信號s現(xiàn)在能夠描述為-S = JV(。Z) cos(/,2丌乂+<|) )J/(30)/=0將這重寫為和并且使用如方程(15)中描述的曝光時間，方程(30) 的積分能夠?qū)懽?4/".2兀sin(/U)其中，在下述情況，和超過t的值 jcos(/.2ju) = jc。(31)/.2兀J = A:.2jc ± arccos 、 、 1一 arccos((32a) (32b)(32c)這給出:S= L A.Z coso arccosl — |+傘乂力/.2兀sina arccosA'爿(33)重寫余弦并對o求和<formula>formula see original document page 20</formula>(36)方程(36)顯示解調(diào)的信號S依賴于x。的值并且依賴于調(diào)制和參考信 號之間的相位差的值。此效果能夠用于找出例如熒光的發(fā)光分子9相對于 激發(fā)輻射束2的位置的位置。圖8作為激發(fā)輻射束2的位置Xc的函數(shù)示出 了解調(diào)的信號S。對于最強(qiáng)的發(fā)光信號，需要設(shè)定調(diào)制信號和解調(diào)的信號之 間的相位差^為0。這例如能夠在系統(tǒng)沒有鎖定到例如熒光的發(fā)光分子9時 通過改變參考解調(diào)信號的相位來實現(xiàn)。從以上，并且從圖8能看到的，能夠得出結(jié)論如果xo是正的，則解 調(diào)的信號S將為正的，并且如果xe為負(fù)的，則S將為負(fù)的。此外，如果xo 的值增加，即如果發(fā)光分子進(jìn)一步遠(yuǎn)離激發(fā)輻射束的諧波移動的中心，則 此信號S的強(qiáng)度也增加。這意指通過使用與施與激發(fā)輻射束2的調(diào)制移動 的頻率相同的頻率用于解調(diào)來確定信號S的符號和強(qiáng)度，能夠找出例如熒 光的發(fā)光分子9相對于激發(fā)輻射束2的位置。在最后的理論情況，再次沒有相對于激發(fā)輻射束2的位置的調(diào)制將例 如熒光的發(fā)光分子9居中(熒光分子9位于x"0處)，并且參考信號的頻率 是調(diào)制頻率f的二倍。在此情況下，能夠以與先前的情況類似的方式計算解 調(diào)信號S并且其變成<formula>formula see original document page 20</formula>(37)當(dāng)對o求和并且重寫余弦時，這給出J= ￡入DJt=0,1.2-.cos(-中)iarccos1"-1,sin(38)S= ￡ A.Z)t=0,l,2.".COSl爿—121-爿(39) ycoslG 、2"7-iA=0,1.2...l — 、2 . (40)從方程(40)，能夠得出結(jié)論對于為調(diào)制頻率的二倍的解調(diào)頻率，解調(diào)的信號S僅依賴于相位^和X()的值，但是不依賴于x。的符號。這也在圖 9中被示例，其中，作為激發(fā)輻射束2的位置XD的函數(shù)示出了解調(diào)的信號S。從此圖，能夠看到在Xq二O，信號的強(qiáng)度最高。因此，使用等于調(diào)制頻率的二倍的解調(diào)頻率也能夠用于找出發(fā)光分子的確切位置，雖然不如當(dāng)解調(diào) 頻率等于調(diào)制頻率時的好，因為它慢。然而，對于如上述的來確定位置， 需要信號的相位信息。這要求首先校準(zhǔn)相位，其導(dǎo)致更加復(fù)雜的方法。因此，此方法不是找出例如熒光的發(fā)光分子9的位置的優(yōu)選途徑。然而，它 是用于測量例如熒光的發(fā)光值的優(yōu)選方法，因為從圖9可以知道，如果解 調(diào)頻率為調(diào)制頻率的二倍，能夠在xo=0處測量例如熒光的發(fā)光。從以上討論，能夠看到，依賴于應(yīng)用，能夠調(diào)整激發(fā)輻射束2的調(diào)制， 以獲得正確的信息。此外，變得清楚地，應(yīng)當(dāng)選擇解調(diào)信號的頻率和激發(fā) 輻射束2相對于例如熒光的發(fā)光分子9的位置作為應(yīng)用的函數(shù)。以下，將描述根據(jù)本發(fā)明的一些具體實施例。如前面己經(jīng)討論的，例如熒光信號的發(fā)光信號7中的背景噪聲依賴于 被照明的總區(qū)域，因為激發(fā)輻射束2不僅照明例如熒光的發(fā)光分子9，而且 也照明存在發(fā)光分子9的例如介質(zhì)的其環(huán)境。此環(huán)境引起背景信號或噪聲， 通過使用激發(fā)輻射束2能夠減小它，例如到樣品板3的到目標(biāo)或斑點上的 激發(fā)輻射束2的投影相對小于要探測的例如熒光的發(fā)光分子9的大小。通過例如使用具有衍射限定的投影或斑點(即大小等于存在例如熒光的發(fā)光分子9的介質(zhì)的衍射限定的斑點)的激發(fā)輻射束2，可以實現(xiàn)這。圖10示出具有小的激發(fā)斑點的激發(fā)輻射束2能夠如何提高信-噪比水 平。不幸的是，問題是利用該小的衍射限定的激發(fā)斑點，要花費更多的時 間來測量大的區(qū)域。圖示例了在不同的情形下所發(fā)生的事情。在第一情形下，僅存在恒定的正常的背景信號(由參考數(shù)字20表示)， 例如來自存在例如熒光的發(fā)光分子9的溶液，但是沒有例如熒光的發(fā)光分 子9被大的激發(fā)輻射束2 (由大圓21a表示)撞擊。因為背景信號不恒定， 根據(jù)第一情形的調(diào)制方案將完全去除此背景信號并且因此探測不到例如熒 光的發(fā)光信號7。在第二情況下(由參考數(shù)字30表示)，存在寄生的例如熒光的發(fā)光分 子。在此情況下，利用較大的激發(fā)輻射束2 (由大圓31a表示)探測到假陽 性。然而，當(dāng)激發(fā)輻射束2的大小減小時(由31b表示的較小的圓)，激發(fā) 輻射束2僅撞擊一個寄生的例如熒光的發(fā)光分子，給出低的例如熒光的發(fā) 光信號，并且最終，不給出陽性探測信號?？蛇x地，對于其它的寄生的例 如熒光團(tuán)的發(fā)光團(tuán)，例如熒光的發(fā)光信號7可以大大高于預(yù)期的真實的發(fā) 光團(tuán)9。還有，在這種情況下，可以拋棄陽性探測信號。對于此第二情況(由 參考數(shù)字30表示)，拋棄信號可以例如通過將探測的信號與預(yù)期的信號比 較來實現(xiàn)，對一定斑點大小的激發(fā)輻射束2預(yù)先確定預(yù)期的信號。在另一情況下(由參考數(shù)字40表示)，存在真實的例如熒光的發(fā)光分 子9。例如熒光的發(fā)光分子9被大的激發(fā)輻射束(由大圓41a表示)撞擊。 當(dāng)激發(fā)輻射束2的大小減小時(由較小的圓41b表示)，真實的例如熒光的 發(fā)光分子9仍然被撞擊并且探測到例如熒光的發(fā)光信號。在最后的情況下，存在具有局部地增加的背景信號的區(qū)域(由參考數(shù) 字50表示)。較大的激發(fā)輻射束(由大圓51a表示)探測高的背景信號并 且給出假陽性。當(dāng)激發(fā)輻射束2的大小減小時(由較小的圓51b表示)，僅 探測到小的背景信號。最終，不給出陽性探測信號。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一具體實施例，通過利用由調(diào)制激發(fā)輻射束2 的位置而具有到目標(biāo)或激發(fā)斑點的大的投影的激發(fā)輻射束2首先搜尋例如 熒光的發(fā)光輻射7減小了例如熒光的發(fā)光信號7的背景信號或提高了 SNR。其后，當(dāng)探測到例如熒光的發(fā)光分子9 (假陽性或不是假陽性)，減小激發(fā) 斑點的大小，并且因此，也減小探測信號中的噪聲，以檢査探測信號是否 為假陽性。通過最小化來自假陽性的信號，可以提高根據(jù)本發(fā)明的方法和 設(shè)備的精度。能夠通過如以上第三理論情況中描述的方法執(zhí)行搜尋或定位例如熒光 的發(fā)光分子9。利用具有頻率f的調(diào)制信號調(diào)制激發(fā)輻射束2。為了能夠相 對于激發(fā)輻射束2定位發(fā)光分子9，參考信號的頻率應(yīng)當(dāng)是作為調(diào)制頻率f 的頻率。通過如以上討論的利用調(diào)制的激發(fā)輻射束2b掃描樣品板3，能夠 獲得如圖8中的曲線圖。從此曲線圖，能夠確定發(fā)光分子9相對于激發(fā)輻 射束2的相對位置。根據(jù)本發(fā)明的此實施例，當(dāng)空間地調(diào)制例如發(fā)光生物傳感器或發(fā)光化 學(xué)傳感器的發(fā)光傳感器的激發(fā)輻射束2時，激發(fā)輻射束2將周期地移到包 括發(fā)光分子9的樣品板3上方。由于此，作為對調(diào)制的激發(fā)輻射束2b的響 應(yīng)的發(fā)光信號7將周期地出現(xiàn)和消失。如己經(jīng)討論的，解調(diào)的信號也依賴 于發(fā)光分子9相對于調(diào)制的中心位置的位置。以下，將演示解調(diào)的信號和 激發(fā)輻射束2的位置之間的關(guān)系。以下，將再次描述例如熒光的發(fā)光分子9相對于激發(fā)輻射束的調(diào)制的 位置的不同情形，僅為理解的容易。圖11示例例如熒光的發(fā)光分子9安置 在調(diào)制移動的中心的左邊的情形。圖11的較低部分示出在掃描束的一個周 期(即例如掃描束從左到右移動并返回)中對發(fā)光信號(實線)和用于解 調(diào)的參考信號(虛線)所發(fā)生的情況。在此情況下，當(dāng)由全黑箭頭表示的 激發(fā)輻射束2的位置使得其照明發(fā)光分子9時，由圖11的較低部分中的點 劃線表示的例如熒光的發(fā)光信號7開始高，并且當(dāng)激發(fā)輻射束2在由箭頭6 和點劃的黑箭頭表示的方向上移開時變到零。當(dāng)激發(fā)輻射束2移回時，例 如熒光的發(fā)光信號7再次變得較高。在圖ll中示例的情況下，例如熒光的 發(fā)光信號7 (點劃線)與用于調(diào)制的參考信號(由圖11的較低部分中的虛 線表示)異相。這意指解調(diào)的信號將是負(fù)的(參照圖8)，與位于調(diào)制移動 的中心位置的左手側(cè)的發(fā)光分子相對應(yīng)。圖12示例例如熒光的發(fā)光分子9位于激發(fā)輻射束2的調(diào)制的中心的情 形。圖12的較低部分示出了在掃描束的一個周期中對發(fā)光信號和用于解調(diào)的參考信號所發(fā)生的情況。在調(diào)制的激發(fā)輻射束2b的一個振蕩中，由圖12 中的較低部分中的點劃線表示的例如熒光的發(fā)光信號7達(dá)到高和低兩次， 即在掃描束每次通過發(fā)光分子所在處的調(diào)制移動的中心時，達(dá)到高。用于 解調(diào)的參考信號由圖12的較低部分中的虛線示出。由于用于調(diào)制的參考信 號具有與調(diào)制信號相同的頻率，獲得了零的解調(diào)信號，表示發(fā)光分子安置 在調(diào)制移動的中心。圖13示例了例如熒光的發(fā)光分子9安置在激發(fā)輻射束2的調(diào)制的中心 的右邊的情形。圖13的較低部分示出在掃描束的一個周期(即例如掃描束 從左到右移動并返回)中對發(fā)光信號(實線)和用于解調(diào)的參考信號(虛 線)所發(fā)生的情況。在此情況下，例如熒光的發(fā)光信號7 (圖13的較低部 分中的點劃線)現(xiàn)在示出了相對于圖11中示例的情形(即發(fā)光分子9安置 在激發(fā)輻射束2的調(diào)制的中心的左邊的情形)相反的行為。這意指例如熒 光的發(fā)光信號7與用于調(diào)制的參考信號同相，給出正的解調(diào)的信號(參照 圖8)，對應(yīng)于位于調(diào)制移動的中心位置的左手邊的發(fā)光分子。使用解調(diào)的例如熒光的發(fā)光信號的信息，從而可能將激發(fā)輻射束正好 安置為居中在例如熒光的發(fā)光分子9上，因為解調(diào)的信號給出關(guān)于此例如 熒光的發(fā)光分子9的位置的信息。一旦定位了例如熒光的發(fā)光分子9，就定位激發(fā)輻射束2并將其調(diào)制， 使得在激發(fā)輻射束2的斑點大小減小時，相對于激發(fā)輻射束2將例如熒光 的發(fā)光分子9居中。例如，能夠?qū)⒓ぐl(fā)輻射束2的投影的大小或斑點大小 降到衍射限定的斑點，即降到大小等于存在例如熒光的發(fā)光分子9的介質(zhì) 的衍射限定的斑點。利用具有調(diào)制頻率f的激發(fā)輻射束輻照例如熒光的發(fā)光分子9。測量例 如熒光的發(fā)光輻射7并利用頻率等于調(diào)制頻率f的兩倍的解調(diào)信號來解調(diào)探 測的信號導(dǎo)致如針對第一理論情況討論的具有提高的信-噪比的例如熒光的 發(fā)光信號。如果例如熒光的發(fā)光信號仍然足夠高，以上探測的信號為真陽 性并且否則，以上探測的信號為假陽性。總之，根據(jù)本發(fā)明的第一具體實施例的方法能夠包括下面的連續(xù)步驟1)通過利用具有例如相對地大的激發(fā)斑點的第一大小的激發(fā)輻射束2 掃描樣品板3，開始尋找陽性的例如熒光的發(fā)光信號7。2) 當(dāng)找到陽性的例如熒光的發(fā)光信號時，使用根據(jù)本發(fā)明的激發(fā)斑點 的調(diào)制以找到例如熒光的發(fā)光分子9相對于激發(fā)輻射束2的確切位置，該 發(fā)光分子9是例如熒光的發(fā)光輻射7的源。解調(diào)的信號的符號和幅度用作 誤差信號以找到發(fā)光分子9的位置。3) 使用2)中獲得的信息作為參考來相對于例如熒光的發(fā)光分子9居 中激發(fā)輻射束2的位置。4) 重復(fù)步驟2)和3)時，縮小激發(fā)斑點的大小。5) 重新測量例如熒光的發(fā)光信號并確定是否存在假陽性。6) 繼續(xù)l)以尋找下一個發(fā)光分子9的存在。根據(jù)此第一具體實施例的方法容許確定探測的例如熒光的發(fā)光分子9 是否為假陽性，同時在搜尋例如熒光的發(fā)光分子9時仍然使用較大的激發(fā) 斑點。根據(jù)本發(fā)明的第一具體實施例的方法從而使得可能以相對大的激發(fā) 輻射束2掃描目標(biāo)并且然后放大潛在的陽性信號，使用調(diào)制以保持激發(fā)束 居中。如己經(jīng)討論的，減小背景信號的一種途徑是使用具有衍射限定的投影 或衍射限定的斑點大小的激發(fā)輻射束2，即到例如樣品板3的目標(biāo)上的投影 或斑點的大小等于存在例如熒光的發(fā)光分子9的介質(zhì)的衍射限定的激發(fā)輻 射束2。然而，對于大小小于衍射限定的激發(fā)輻射束2或斑點的例如熒光的 發(fā)光分子9，仍然保持有背景噪聲。挑戰(zhàn)/問題是提高信-噪比(SNR)到由衍射限定設(shè)定的限制以上。此外， 期望進(jìn)一步提高測得的例如熒光的發(fā)光信號的SNR。因此，在根據(jù)本發(fā)明的此第二具體實施例中，通過在例如熒光的發(fā)光 分子9以上調(diào)和地移動激發(fā)輻射束2來調(diào)制激發(fā)輻射束2。通過此，由例如 熒光的發(fā)光分子9生成的例如熒光輻射的發(fā)光輻射7變成具有調(diào)制頻率Ao) 的諧波信號，而背景信號保持不變。使用反向的傅立葉分析，能夠從背景 分離例如熒光的發(fā)光信號7，歸因于例如熒光的發(fā)光信號和背景信號之間的 調(diào)制頻率中的差異。在此實施例中，調(diào)制激發(fā)輻射束2的位置，在例如熒光的發(fā)光分子9 以上來回移動激發(fā)輻射束2。這在圖11-13中示意性地示出了。在激發(fā)輻射 束2的正常掃描移動上增加激發(fā)輻射束2的位置中的此調(diào)制，如前面已經(jīng)討論的，并且是快速的但小位置的振蕩。具有快的調(diào)制速度意指調(diào)制會具有至少在kHz的量級的頻率，即lkHz或以上，但是優(yōu)選地在MHz的量級， 即lMHz或以上。具有小的振蕩意指幅度典型地大于例如熒光的發(fā)光分子9 的大小2s并且小于數(shù)倍的此長度的振蕩。典型地，此幅度可以在小于l微 米的量級。不期望此幅度的上限是本發(fā)明的限制。然而，對具有大幅度的 振蕩能夠引起的實際問題是，能夠使用的調(diào)制頻率可以變得較小，因為當(dāng) 振蕩具有較小幅度時，較易達(dá)到高的頻率。掃描移動(即此文獻(xiàn)中稱作第一方向5上的第一移動的移動)的頻率 依賴于應(yīng)用，但是優(yōu)選地不應(yīng)當(dāng)大于調(diào)制(即第二方向6上的第二移動) 的頻率，并且優(yōu)選地它應(yīng)當(dāng)至少在調(diào)制的頻率以下因子10。根據(jù)本發(fā)明的此第二具體實施例，能夠以數(shù)個途徑實現(xiàn)激發(fā)輻射束2 的位置的調(diào)制，例如，通過改變多模干涉儀(MMI)的輸入束的焦平面， 或通過使用聲光調(diào)制器(AOM)、棱鏡對、利用電或壓力移動的反射鏡，或 通過使用液晶。依賴于是否利用激發(fā)輻射束2照明例如熒光的發(fā)光分子9，并且因此依 賴于激發(fā)輔射束2相對于發(fā)光分子9的相對位置，發(fā)光信號7將重復(fù)地開 啟和關(guān)閉，歸因于施與激發(fā)輻射束2的諧波移動。結(jié)果，以與激發(fā)輻射束2 相同的頻率調(diào)制發(fā)光信號7。用于解調(diào)的參考信號的頻率應(yīng)當(dāng)是調(diào)制頻率的 兩倍，以至少部分地去除背景信號并且因此提高發(fā)光信號的SNR。然后通過探測器8測量調(diào)制的例如熒光的發(fā)光信號7 (參照圖1)。探 測器8可以是任何合適的探測器8，例如電荷耦合器件(CCD)或互補(bǔ)金屬 氧化物半導(dǎo)體(CMOS)探測器。然后使用諸如例如鎖定放大器的電子設(shè)備解調(diào)測得的信號，并且得到 的信號給出無背景的例如熒光的發(fā)光信號，因此導(dǎo)致具有提高的信-噪比的 信號。因為電噪聲與調(diào)制的頻率的倒數(shù)或1/f成比例，因此這里也存在噪聲改 善，產(chǎn)生SNR的進(jìn)一步的提高。1/f噪聲是在自然中發(fā)現(xiàn)的過程中經(jīng)常出現(xiàn) 的類型的噪聲。當(dāng)使用此技術(shù)時，能夠去除大多數(shù)噪聲，但是l/f噪聲仍然 保持。此類型噪聲的強(qiáng)度隨增加的頻率下降。此探測方案的優(yōu)選要求是例 如熒光的發(fā)光分子9的響應(yīng)時間短于激發(fā)輻射束2的調(diào)制頻率。對于具有在ms量級的例如熒光的發(fā)光壽命的例如熒光的發(fā)光分子9，這暗示約100Hz 的最大的調(diào)制頻率。這暗示在此情況下，歸因于例如1/f噪聲的SNR的提 高有點受限。然而，許多例如熒光的發(fā)光分子9具有在數(shù)納秒的量級的例 如熒光壽命W,的發(fā)光壽命^m，使得調(diào)制頻率在MHz的范圍。數(shù)個熒光 分子和它們的壽命的范例為1. 例如Cyanine、 Alexa榮光素 Tfluor l-5ns2. 例如RU、 Ir: Tflu。r lpS3. 例如Eu、 Tb: Tflu。r lms應(yīng)當(dāng)注意，雖然上述討論針對僅一個激發(fā)輻射束，但是本發(fā)明也可以 應(yīng)用于多個激發(fā)輻射束。在那種情況下，根據(jù)本發(fā)明的實施例，傳感器可 以包括多個例如光源的激發(fā)輻射源1和相同數(shù)量的探測器8。其優(yōu)點是能夠 更快地實現(xiàn)找到例如熒光的發(fā)光分子9，因為同時探測了多個位置。當(dāng)找到 例如熒光的發(fā)光分子9時，調(diào)制方法僅用于例如光源的一個激發(fā)輻射源1 和傳感器對，其后對來自例如光源的多個激發(fā)輻射源1的所有斑點重新開 始搜尋。應(yīng)當(dāng)理解，雖然已經(jīng)于此針對根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備討論了優(yōu)選實施例、 具體結(jié)構(gòu)和配置及材料，但是可以不脫離本發(fā)明的范圍和精神作出形式和細(xì)節(jié)中的多個改變或更改。
權(quán)利要求
1、一種方法，用于探測樣品(3)中或樣品(3)上的光學(xué)地可變的分子(9)，該方法包括-在第一方向上相對于激發(fā)輻射束(2)移動該樣品，據(jù)此激發(fā)所述光學(xué)地可變的分子(9)并且從而生成發(fā)光信號(7)，以及-探測所述生成的發(fā)光信號(7)，其中，該方法還包括在探測該發(fā)光信號(7)時空間地調(diào)制該激發(fā)輻射束(2)相對于該樣品的相對位置，所述調(diào)制包括在不同于所述第一方向的第二方向上該激發(fā)輻射束相對于該樣品的相對移動。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括解調(diào)所述探測的發(fā)光信號(7)， 從而生成解調(diào)的信號。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，還包括使用該解調(diào)的信號的符號和/ 或幅度作為針對該光學(xué)地可變的分子(9)的位置的誤差信號。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，利用第一頻率執(zhí)行所述調(diào)制并且用于 解調(diào)的解調(diào)信號具有第二頻率，其中，該第二頻率是該第一頻率的兩倍。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，利用第一頻率執(zhí)行所述調(diào)制并且用于 解調(diào)的解調(diào)信號具有第二頻率，其中，該第二頻率與該第一頻率相同。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，該激發(fā)輻射束的斑點具有大小，該方 法還包括-從所述探測的發(fā)光信號(7)確定所述光學(xué)地可變的分子(7)相對于 所述激發(fā)輻射束(2)的相對位置，-相對所述光學(xué)地可變的分子(9)使所述激發(fā)輻射束(2)居中，-減小所述斑點的大小，以及-確定進(jìn)一步生成的發(fā)光信號。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，還包括使用該進(jìn)一步生成的發(fā)光信號 確定該生成的發(fā)光信號(7)是否表示假陽性。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該激發(fā)輻射束(2)是單個激 發(fā)輻射束(2)。
9、 一種傳感器，用于探測樣品(3)中或樣品(3)上的光學(xué)地可變的 分子(9)，該傳感器包括--激發(fā)輻射源(1)，用于生成激發(fā)輻射束(2)，-掃描裝置，用于在第一方向上相對于該樣品移動該激發(fā)輻射束(2)， 以掃描該樣品(3)，其中，該傳感器還包括調(diào)制裝置(4)，用于空間地調(diào)制該激發(fā)輻射束 (2)相對于該樣品的相對位置，以在不同于所述第一方向的第二方向上提 供該激發(fā)輻射束相對于該樣品的相對移動。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的傳感器，在利用所述激發(fā)輻射束(2)輻照 時，所述發(fā)光分子(9)生成發(fā)光信號(7)，該傳感器還包括探測器(6), 用于探測所述生成的發(fā)光信號(7)。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的傳感器，其中，所述探測器(6)是電荷 耦合器件或互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體探測器中的一個。
12、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的傳感器，還包括解調(diào)裝置(4)，用于解調(diào) 所述探測的發(fā)光信號(7)。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的傳感器，其中，所述解調(diào)裝置(4)是鎖 定放大器。
14、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的傳感器，其中，該激發(fā)輻射束(2)是單個激發(fā)輻射束(2)。
全文摘要
本發(fā)明提供用于探測樣品(3)中光學(xué)地可變的分子(9)的傳感器和方法。該傳感器包括激發(fā)輻射源(1)，用于輻照樣品(4)并激發(fā)光學(xué)地可變的分子(9)，從而生成發(fā)光信號(7)。該傳感器還包括調(diào)制裝置(4)，用于在不同于優(yōu)選地基本垂直于樣品(3)上的激發(fā)輻射束(2)的掃描方向的方向上調(diào)制激發(fā)輻射束(2)。根據(jù)本發(fā)明的方法和傳感器通過減小并甚至最小化發(fā)光信號(7)中的背景信號導(dǎo)致了提高的信-噪比和通過最小化來自假陽性的信號導(dǎo)致了提高的精度。
文檔編號G01N21/64GK101322026SQ200680045560
公開日2008年12月10日 申請日期2006年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月5日
發(fā)明者C·T·H·F·利登巴姆, D·J·W·克隆德, M·L·M·巴利斯特雷里, M·M·J·W·范赫佩恩 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司