專利名稱：：病原體檢測生物傳感器的制作方法病原體檢測生物傳感器相關(guān)申請本申請為2004年12月1日提交的美國申請?zhí)?1/001,583的部分繼續(xù)申請，美國申請11/001,583為2004年1月16日提交的美國申請10/467,242的部分繼續(xù)申請，美國申請10/467,242為2002年2月6日提交、以英文公開的國際申請PCT/US02/03606的美國國家階段，該國際申請要求2001年2月7日提交的美國臨時(shí)申請60/266,977的利益。本申請也要求2005年11月30日提交的美國臨時(shí)申請60/741,271的利益。通過引用，上述申請的全部教導(dǎo)內(nèi)容包含于此。政府資助本申請是利用美國空軍合約no.F19628-00-C-0002的政府基金完成的，政府在本發(fā)明中具有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
：生物和化學(xué)武器(即窮人的核武器)的擴(kuò)散增加了對能長時(shí)間監(jiān)測環(huán)境的小型、快速、靈敏的生物劑檢測器的需求。在戰(zhàn)場條件下，有效的檢測器能在檢測到特定的生物或化學(xué)物質(zhì)時(shí)快速警告士兵，從而能夠迅速實(shí)施反措施。這種檢測器在非軍事應(yīng)用方面也是有益的。病人的抗生素抗性細(xì)菌的快速檢測將幫助臨床醫(yī)生選擇更有效的治療方案。城市飲用水源的持續(xù)監(jiān)測將提供潛在病原體的早期警告，從而為市政工程官員提供更多時(shí)間處理對公眾的潛在健康威脅。此外，在肉禽枱，驗(yàn)中使用這些檢測器對于目前的"觸和聞(pokeandsmell)"的方法是顯著的改進(jìn)。通常，在醫(yī)藥(如獸醫(yī))、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)(如確診病態(tài)樓宇綜合癥)和食物加工或管理領(lǐng)域中，這種檢測器是非常需要的分析和診斷設(shè)備。所有的脊推動(dòng)物部分地通過產(chǎn)生極多樣的抗體分子獲得對外源物質(zhì)(抗原)的特異性免疫反應(yīng)?？贵w分子高特異性結(jié)合抗原，如，它們能夠差異結(jié)合兩種緊密相關(guān)的細(xì)菌抹、病毒、蛋白質(zhì)、核酸、真菌、原生動(dòng)物、多細(xì)胞寄生蟲、或朊病毒，以及由這些微粒產(chǎn)生或誘導(dǎo)的產(chǎn)物?？贵w是由B細(xì)胞(免疫系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵部分)產(chǎn)生的?？乖軌蛲ㄟ^結(jié)合B細(xì)胞表面上的抗體、導(dǎo)致使鈣離子流入B細(xì)胞胞液內(nèi)的一連串細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)而激活B纟田月包。關(guān)于抗體結(jié)構(gòu)、功能和B細(xì)胞激活的回顧，參見Paul，編者，《基礎(chǔ)免疫學(xué)(FundamentalImmunology)》，第3版，Raven出版社，紐約(1993)。在美國專利6,087,114和6,248,542中已描述了利用抗體多樣性檢測多樣和稀有目標(biāo)顆粒或抗原的設(shè)備。這些設(shè)備通常包括含感應(yīng)細(xì)胞(如，B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或成纖維細(xì)胞)(此處也稱為"金絲雀(CANARY)"細(xì)胞或"發(fā)射體"細(xì)月包)的液體介質(zhì)、光學(xué)檢測器，且該液體介質(zhì)容納要檢測的目標(biāo)顆粒。各細(xì)胞具有在其表面表達(dá)、并且對于被檢測抗原是特異性的受體(如嵌合或單鏈抗體)?？乖c受體的結(jié)合導(dǎo)致涉及化學(xué)或生化變化(如鈣離子濃度增加)的信號通路。這些細(xì)胞也在其胞液中包含能夠響應(yīng)于信號通路的信號(如胞液中鈣濃度增加)而發(fā)射光子的發(fā)射體分子(如水母發(fā)光蛋白或indo-l)。檢測器可以通過對光子透明的遮蓋物(如玻璃)與含細(xì)胞的介質(zhì)隔離。這種遮蓋物可以用于支撐介質(zhì)、保護(hù)檢測器的易碎表面、或被用作透鏡。光學(xué)檢測器，如電荷耦合設(shè)備(CCD)，能夠檢測響應(yīng)于受體介導(dǎo)信號通路而從細(xì)胞發(fā)射出的光子，并且能夠提示用戶存在被檢測的抗原。能夠在該設(shè)備中使用的其它光學(xué)檢測器包括光電倍增管、光電二極管、互補(bǔ)型金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)成像器、雪崩光電二極管、及圖像增強(qiáng)電荷耦合裝置(ICCD)(例如，參見英國東薩塞克斯郡Photek公司提供的設(shè)備)。在一些實(shí)施例中，光學(xué)檢測器能夠辨別個(gè)體細(xì)胞。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供用于檢測目標(biāo)顆粒的方法。特別是，提供用于檢測生物劑、病原體、細(xì)菌、病毒、可溶性抗原、毒素、化學(xué)藥品、炸藥、核苷酸序列(例如DNA或RNA)、植物病原體、血源性病原體等的方法。檢測目標(biāo)顆粒的方法包括液體樣品、氣溶膠樣品、及干試樣中的目標(biāo)顆粒的^r測。本發(fā)明也提供了一種包含受體的發(fā)射體細(xì)胞，其中所述受體可以為目標(biāo)抗原特異性的抗體，對通用目標(biāo)(例如，如生物素的標(biāo)記、或免疫球蛋白等)特異性的抗體。此外，受體可以為Fc受體。發(fā)射體細(xì)胞進(jìn)一步包括用于一企測樣品中的目標(biāo)顆粒的發(fā)射體分子，其中，受體與目標(biāo)顆粒的結(jié)合激發(fā)發(fā)射體分子的反應(yīng)。在一種實(shí)施方式中，受體激發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，其中，發(fā)射體分子對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加作出響應(yīng)而發(fā)射光子。在一種實(shí)施方式中，發(fā)射體分子為水母發(fā)光蛋白。在另一種實(shí)施方式中，發(fā)射體分子為水母發(fā)光蛋白-GFP分子。本發(fā)明還提供了一種使用光子檢測器檢測多個(gè)樣品中的目標(biāo)顆粒的光電子傳感器設(shè)備。光電子傳感器設(shè)備能夠檢測液體樣品中的目標(biāo)顆粒。可選擇地，光電子傳感器設(shè)備能夠檢測空氣或氣溶膠樣品中的目標(biāo)顆粒。在一種實(shí)施方式中，該傳感器設(shè)備包括離心裝置。在另一種實(shí)施方式中，該傳感器設(shè)備不包括離心裝置。在一種實(shí)施方式中，該傳感器設(shè)備包括氣溶膠噴霧器。在另一實(shí)施方式中，該傳感器設(shè)備包括管吸(wicking)裝置。在再一實(shí)施方式中，該傳感器設(shè)備包括可移動(dòng)基底。在一實(shí)施方式中，該傳感器設(shè)備包括用于捕獲目標(biāo)顆粒的針頭基底(pinheadsubstrate)。目標(biāo)顆粒(如可溶性抗原或核酸)的檢測部分由目標(biāo)顆粒與在發(fā)射體細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)的受體直接或間接結(jié)合介導(dǎo)。直接結(jié)合可以通過直接特異性結(jié)合目標(biāo)顆粒的受體，如抗體。目標(biāo)顆粒的間接結(jié)合可以通過結(jié)合已連接(結(jié)合)于目標(biāo)顆粒的抗體的Fc受體。附圖簡要說明專利或申請文件至少包含一幅彩色附圖。在提出請求并支付必要的費(fèi)用后，專利局將提供帶有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞_文本的副本。圖1為光電傳感細(xì)胞概念示意圖。圖2為顯示具有用于初步感應(yīng)可疑制劑的取樣器(觸發(fā)器)的光電感應(yīng)器的一般結(jié)構(gòu)的示意圖。圖3為說明光電感應(yīng)器中所用的細(xì)胞系的建立的示意圖。圖4為集成生物氣溶膠警告感應(yīng)器(BAWS)/光電感應(yīng)器系統(tǒng)的示意圖。圖5說明在光電感應(yīng)器中B細(xì)胞對口蹄疫病毒的反應(yīng)。圖6說明光電感應(yīng)器的干式撞擊取樣器模塊。圖7為說明定位和混合的效果的示意圖。圖8說明使用土拉菌細(xì)胞的定位效果。圖9說明用于光電感應(yīng)器的自動(dòng)細(xì)胞輸送模塊。圖10說明使用光電感應(yīng)器時(shí)土拉菌細(xì)胞樣品的劑量反應(yīng)關(guān)系。圖11說明B細(xì)胞對化學(xué)和生物污染物的抗性。圖12說明用于光電感應(yīng)器的自動(dòng)離心模塊。圖13為說明空氣撞擊取樣器/光電感應(yīng)器的示意圖。圖14為說明光電感應(yīng)器的示意圖。圖15說明用于光電感應(yīng)器的光學(xué)-光電倍增器(PMT)模塊。圖16為說明空氣撞擊取樣器/光電感應(yīng)器的示意圖。圖17為說明光電感應(yīng)器中的多通道離心機(jī)的示意圖。圖18為說明光電感應(yīng)器中的濕式離心機(jī)/撞擊取樣器概念的示意圖。圖19為說明光電感應(yīng)器中的濕式離心機(jī)/撞擊取樣器概念的示意圖。圖20為用于光電感應(yīng)器的特制管(customtube)的示意圖。圖21說明集成的干式撞擊取樣器/光電感應(yīng)器。圖22說明細(xì)胞處理對鼠疫桿菌(Yerseniapestit)特異性B細(xì)胞反應(yīng)的影響。圖23說明設(shè)計(jì)為收集氣溶膠樣品的撞擊取樣器。圖24為解釋"CANARY"傳感器的概念的示意概述。B細(xì)胞已被修飾，從而其在細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)水母發(fā)光蛋白和在細(xì)胞表面表達(dá)病原體的抗體。當(dāng)存在病原體時(shí)，抗體在細(xì)胞表面上"交聯(lián)"(固定、聚集)，激發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣升高的信號級聯(lián)。水母發(fā)光蛋白通過水母發(fā)光蛋白的氧化響應(yīng)這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加并發(fā)射光?？梢允褂肞MT監(jiān)測光子輸出。圖25為DNA檢測的示意圖。與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)、并且含末端地高辛標(biāo)記的寡核苷酸與靶DNA雜交。多個(gè)沿靶DNA結(jié)合的地高辛標(biāo)記的寡核普酸與CANARY細(xì)胞(發(fā)射體細(xì)胞)表面上的地高辛抗體結(jié)合，刺激光發(fā)射。圖26AC為曲線圖。表達(dá)抗地高辛抗體的金絲雀CANARY細(xì)胞(發(fā)射體細(xì)胞)可以由地高辛標(biāo)記的DNA進(jìn)行刺激。向含有50^1標(biāo)示濃度的地高辛標(biāo)記DNA標(biāo)準(zhǔn)物的離心管中加入表達(dá)抗地高辛抗體的發(fā)射體細(xì)胞。對離心管進(jìn)行短暫離心以使細(xì)胞在最接近PMT的試管底部成團(tuán)，并且記錄作為時(shí)間的函數(shù)的光子發(fā)射。三種不同類型的地高辛標(biāo)記的DNA用于刺激細(xì)胞，并且各種地高辛標(biāo)記的DNA以不同的靈敏度成功地刺激細(xì)胞。圖26A,以約lng/ml(50pg絕對量)檢測極限檢測用地高辛密集標(biāo)記(約4000個(gè)堿基對連有200個(gè)地高辛分子)的質(zhì)粒DNA。圖26B，以地高辛稀疏標(biāo)記(每200個(gè)堿基對標(biāo)記一個(gè))的各種尺寸(818576石咸基對)的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物在ljig/ml(50ng絕對量)處被檢測。圖26C，各標(biāo)記了2個(gè)地高辛(DNA分子的各端一個(gè)地高辛)的各種大小(8~587個(gè)堿基對)的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物在100ng/ml(5ng絕對量)處纟皮;險(xiǎn)測。圖27AB為曲線圖。細(xì)胞離心可能降低對可溶性抗原的靈敏度。向含有50jil標(biāo)示濃度的地高辛標(biāo)記的質(zhì)粒DNA的離心管中加入表達(dá)抗地高辛抗體的發(fā)射體細(xì)胞。圖27A,對離心管進(jìn)行短暫離心以使細(xì)胞在最接近PMT的試管底部成團(tuán)，并且記錄作為時(shí)間的函數(shù)的光子發(fā)射。圖27B，細(xì)胞和DNA被手工混合，并且不進(jìn)行離心而置于PMT上。圖28為曲線圖。在試驗(yàn)條件下雜交兩個(gè)互補(bǔ)的Dig標(biāo)記寡核苷酸(寡核苷酸"3"和寡"NEG3")。用C02I培養(yǎng)基以1:10稀釋樣品至100ial總體積，加入20jil細(xì)胞，并且測量光發(fā)射。Dig細(xì)胞表達(dá)Dig抗體，而對照細(xì)力包不表達(dá)。圖29為曲線圖。地高辛標(biāo)記的ssDNA寡核苷酸的快速雜交。標(biāo)示量的寡核苷酸"NEG3"被加入到8pl雜交液中(5OmMNaCL,40mMTrispH7.5)。加入1(^1的"寡核苷酸3"，然后立即加入C02I培養(yǎng)基和20^1DigCANARY細(xì)胞。輕彈試管以使混合，迅速置于光度計(jì)內(nèi)并且監(jiān)測光輸出。在添加第二寡核普酸和置于光度計(jì)內(nèi)(X軸上的"0")之間的總時(shí)間約為15秒。圖30為曲線圖。由pBluescript噬粒生成單鏈DNA，并且與所有10個(gè)Dig標(biāo)記的寡核苷酸雜交。雜交后，反應(yīng)物以C02I稀釋至100^1，加入20[ilDig細(xì)胞，并且測量光發(fā)射。圖例中標(biāo)記的摩爾比為寡核苷酸與耙ssDNA的摩爾比。在該試驗(yàn)中理想的比率應(yīng)在1:2至1:4之間。圖31為曲線圖。單鏈DNA的序列特異性檢測。10個(gè)與pBluescript噬粒的(+)鏈互補(bǔ)的地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針與標(biāo)示量的單鏈?zhǔn)闪NA雜交。加入表達(dá)地高辛抗體的發(fā)射體細(xì)胞，并且在光電倍增管上監(jiān)測細(xì)胞的光輸出。僅檢測到噬粒的(+)鏈，說明該識別是序列特異性的。當(dāng)無寡核苷酸探針時(shí)，單鏈DNA并不激發(fā)細(xì)胞。在該試驗(yàn)中檢測的極限為50ng。圖32AB為柱形圖。雜交溫度對核酸檢測的影響。單鏈?zhǔn)闪NA與標(biāo)示濃度的探針在多個(gè)溫度下雜交，并且標(biāo)繪RLU最大值。圖32A，在PBS中的雜交在5rC下顯示最大雜交信號，但是在47。C和42。C下的雜交樣品顯示類似信號。圖32B,在42。C下的雜交顯示使用低濃度寡核苷酸探針的試驗(yàn)的信號的增加，0.16pmole寡核苷酸與0.63pmole運(yùn)作幾乎一樣好，并且，0.04pmole的信號加倍。圖33為DNA沉降方案的示意圖。捕獲的寡核苷酸粘附于可沉降顆粒的表面。這些寡核苷酸結(jié)合于與Dig-寡核苷酸結(jié)合區(qū)域分隔的區(qū)域。目標(biāo)DNA結(jié)合捕獲DNA，并且地高辛標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合在目標(biāo)上。通過離心(或磁場)沉降整個(gè)復(fù)合物，并且通過表達(dá)抗地高辛抗體的發(fā)射體細(xì)胞對復(fù)合物進(jìn)行檢測。圖34為曲線圖。目標(biāo)DNA的沉降增強(qiáng)靈敏度。用生物素標(biāo)記的捕獲寡核苷酸飽合鏈霉親和素偶聯(lián)的微球，通過清洗去除過量的寡核苷酸。pBluescriptssDNA(+鏈)與微球在47。C孵育5分鐘，并清洗。加入地高辛標(biāo)記的檢測寡核苷酸，在47。C雜交20分鐘，并且通過清洗去除多余量。微球重懸在200plC02I中，并且在各試驗(yàn)中使用40|il。圖35為柱形圖。pBS噬粒ssDNA與連接于鏈霉素親和素包凈皮的聚苯乙烯微球的生物素標(biāo)記的寡核苷酸和地高辛標(biāo)記的寡核苷酸一起在標(biāo)示濃度的封閉劑中、在47。C孵育20分鐘。在室溫下，微球結(jié)合的、地高辛標(biāo)記的目標(biāo)物質(zhì)在TBS(50mMTris，130mMNaCl)中清洗3次。微球重懸在C02I培養(yǎng)基中，加入發(fā)射體細(xì)胞，并且反應(yīng)物被旋轉(zhuǎn)并用光度計(jì)監(jiān)測光輸出。圖36AC為曲線圖。圖36A,當(dāng)用IFNy處理時(shí)，U937細(xì)胞表現(xiàn)出FcYRI表達(dá)的增力口。通過免疫熒光法測量IFNY處理(200ng/ml,空心綠色峰)或未處理(實(shí)心紫色峰)的U937細(xì)胞上的FcyRI的相對表達(dá)。圖36B,U937細(xì)胞表達(dá)功能性水母發(fā)光蛋白質(zhì)。當(dāng)用離子霉素(50M)處理時(shí)，用鈣離子-敏感熒光蛋白水母發(fā)光蛋白轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞發(fā)射光。圖36C，具有穩(wěn)定的水母發(fā)光蛋白表達(dá)的U937細(xì)胞上的Fc受體交聯(lián)后，光被檢測到。U937細(xì)胞與10(ig/ml人IgG預(yù)10培養(yǎng)10分鐘，然后清洗、并用山羊抗-人IgG(Fab2，)處理。圖37AD為曲線圖。U937細(xì)胞可以被快速工程化(engineered)以應(yīng)答多種不同病原體或刺激物。U937細(xì)胞用IFNy(200ng/ml)處理24小時(shí)，以增加內(nèi)源FcyRI的表達(dá)，并且準(zhǔn)備用于CANARY試驗(yàn)。然后，細(xì)胞與以下抗體一起孵育圖37A鼠抗-炭疽芽胞桿菌C8.朋Arac/力孢子、圖37B兔多克隆抗-炭疽芽胞桿菌孢子、圖37C鼠抗土拉熱弗朗西斯氏菌(F.^/ara^)、或圖37D鼠抗枯草芽孢桿菌C8.w&,7/》雜交瘤上清液。然后，細(xì)胞被用于標(biāo)準(zhǔn)的CANARY試驗(yàn)，在該試驗(yàn)中，用單克隆抗體檢測到少至1000cfu的炭疽芽胞桿菌孢子、用兔多克隆抗體4企測到少至10，000cfu的孢子、以及10,000cfu的土拉熱弗朗西斯氏菌和1000cfu枯草芽孢桿菌。圖38AC為曲線圖?？焖俟こ袒腢937細(xì)胞是特異性的，并且特異性由抗體決定。圖38A,與鼠抗土拉熱弗朗西斯氏菌抗體共同孵育的U937細(xì)胞對105cfu的炭疽芽胞桿菌孢子未反應(yīng)，但對106cfu土拉熱弗朗西斯氏菌顯示反應(yīng)。圖38B,負(fù)載鼠抗-炭疽芽胞桿菌孢子抗體的細(xì)胞對土拉熱弗朗西斯氏菌未反應(yīng)，但對10、fu炭疽芽胞桿菌孢子反應(yīng)。圖38C,在無抗-土拉熱弗朗西斯氏菌抗體時(shí)[10、&F.t.(Noab)]，細(xì)胞對106cfu土拉熱弗朗西斯氏菌未顯示任何反應(yīng)。圖39為16-通道傳感器的說明。傳感器設(shè)計(jì)為使得能夠利用單光采集通道同時(shí)測量16個(gè)樣品。該傳感器由轉(zhuǎn)子組成，該轉(zhuǎn)子支承有16個(gè)圍繞其圓周水平、均勻分布的1.5ml管子，并且由繞垂直軸的可變速馬達(dá)驅(qū)動(dòng)。單固定光子檢測部件(如PMT)被置于轉(zhuǎn)子的平面內(nèi)正好超出管子在旋轉(zhuǎn)過程中的路徑之外。這樣，各個(gè)管子順序、反復(fù)地緊密接近PMT,使其光輸出在各次通過時(shí)被采樣。最終，由光源(紅外LED)和檢測器(光電晶體管)組成的光開關(guān)被用于控制檢測到的光子的計(jì)數(shù)和16個(gè)域內(nèi)的數(shù)據(jù)的再組織，各域分別與特定的樣品相關(guān)。圖40為曲線圖。來自16-通道傳感器的數(shù)據(jù)顯示了與在單通道儀器中獲得的數(shù)據(jù)相同的LOD，除了16個(gè)樣品被同時(shí)測量外。單次測量包括以下步驟在各個(gè)1.5ml管子中準(zhǔn)備16個(gè)樣品(和/或?qū)φ?，向各個(gè)管子中引入等份發(fā)射體細(xì)胞，將管子安裝到位于暗箱中的轉(zhuǎn)子中，利用短暫(5秒)的高RCF(~2000g)離心旋轉(zhuǎn)將發(fā)射體細(xì)胞定位到管子的底部，在測量持續(xù)期間內(nèi)降低轉(zhuǎn)子速度至60rpm(每秒鐘各管被采樣一次)，以及對于各樣品生成光子計(jì)數(shù)的時(shí)間序列用于顯示和/或輸入到評估用的計(jì)算機(jī)算法中。圖41為便攜式16通道傳感器設(shè)計(jì)的說明。圖42為整合了氣溶膠收集和發(fā)射體細(xì)胞輸送的CANARY盤(CD)的說明。圖43為具有沖擊嘴和透明管的氣溶膠收集模塊剖面圖的說明。圖44為具有閥輸送系統(tǒng)的發(fā)射體細(xì)胞輸送模塊的說明。圖45為16-通道傳感器和其使用結(jié)果的概述。圖46為毒素檢測的概述。圖47為表達(dá)水母發(fā)光蛋白和通用抗體受體的感應(yīng)細(xì)胞的概述。圖48為可溶性單體抗原卩險(xiǎn)測的示意圖方案1，單發(fā)射體細(xì)月包一皮工程化以表達(dá)抗相同單體抗原上的兩種不同表位的兩種不同的抗體?？乖拇嬖诮宦?lián)抗體，從而刺激發(fā)射體細(xì)胞發(fā)光。圖49為描述表達(dá)抗炭疽桿菌和鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)兩者的抗體的細(xì)胞系各被炭疽桿菌和鼠疫耶爾森氏菌激發(fā)的結(jié)果的曲線圖。這種克隆細(xì)胞系可以檢測少至50cfu的任一炭疽桿菌或鼠疫耶爾森氏菌，說明兩種抗體的兩種抗原結(jié)合位點(diǎn)被表達(dá)、并且是有功能的。圖50為檢測可溶性蛋白質(zhì)的方案的示意圖。使用兩種抗體檢測包含兩種或多種表位的抗原，一種抗體與微球(或者結(jié)合多個(gè)抗體的任何載體)結(jié)合，并且第二種抗體由發(fā)射體細(xì)胞表達(dá)?？乖c抗體包被的微球一起孵育從而用多個(gè)抗原修飾其表面。然后將微球呈遞給發(fā)射體細(xì)胞。因?yàn)榭乖ㄟ^微球交聯(lián)，發(fā)射體細(xì)胞抗體被交聯(lián)，并且激發(fā)光發(fā)射。圖51為描述與G蛋白磁性微球交聯(lián)的抗體6E10-10與不同量的BoNT/AHc在4。C孵育3小時(shí)的結(jié)果。微球用0:021培養(yǎng)基洗三次。加入表達(dá)6B2-2抗體的發(fā)射體細(xì)胞，反應(yīng)物旋轉(zhuǎn)5秒，并且在光度計(jì)中監(jiān)測光輸出。圖52為檢測化學(xué)物質(zhì)的示意圖。與關(guān)注的化學(xué)物質(zhì)特異性結(jié)合的肽被分離，并且產(chǎn)生與肽-化學(xué)物質(zhì)復(fù)合體特異性結(jié)合的抗體。如果肽-化學(xué)物質(zhì)僅形成單功能表位，則可以向肽中加入附加表位。如圖所示，該表位為地高辛分子，但是任何特異性表位都可以。當(dāng)存在化學(xué)物質(zhì)時(shí)，化學(xué)物質(zhì)-肽復(fù)合物應(yīng)包括兩個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)，并且能以與蛋白質(zhì)毒素相同的方式被4企測。圖53為描述用于檢測化學(xué)物質(zhì)的可選擇方法的示意圖。分離與關(guān)注的化學(xué)物質(zhì)順序結(jié)合的兩種肽。通過產(chǎn)生抗各肽-化學(xué)物質(zhì)復(fù)合體的抗體、或者如圖所示通過用肽標(biāo)記抗體結(jié)合位點(diǎn)可以;險(xiǎn)測這些肽的結(jié)合。圖54為另一檢測化學(xué)物質(zhì)的可選擇方法的示意圖。結(jié)合兩種關(guān)注的化學(xué)物質(zhì)的肽被制備，從而形成化學(xué)物質(zhì)-肽二聚體復(fù)合物。制備與該化學(xué)物質(zhì)-肽二聚體復(fù)合物特異性結(jié)合的抗體。所述化學(xué)物質(zhì)-肽二聚體復(fù)合物可以包含兩個(gè)足以刺激發(fā)射體細(xì)胞增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子的抗體結(jié)合位點(diǎn)，從而通過發(fā)射體分子產(chǎn)生光子發(fā)射。圖55為曲線圖。地高辛標(biāo)記的寡核苷酸被加入雜交緩沖液(40mMTris,130mMNaCl，10mMDTT，RnasinPlus)中的RNA，并且在47。C下將育2分鐘。加入C02I培養(yǎng)基和細(xì)胞，管被旋轉(zhuǎn)5秒鐘，并且在PMT上監(jiān)測光輸出。在該試驗(yàn)中的檢測極限為20ng。對對照RNA無反應(yīng)(相反鏈)說明該試驗(yàn)是序列特異性的。圖56為示意圖?？乖?包括毒素)可以包含2個(gè)或多個(gè)表位。CANARY細(xì)胞典型地表達(dá)抗目標(biāo)表位的單個(gè)抗體。在最壞的情況下，抗原可以以單體形式存在。盡管CANARY細(xì)胞上的抗體能夠結(jié)合單體抗原，但是抗體不能交聯(lián)，并且不發(fā)射光。圖57為示意圖。通過CANARY檢測可溶性毒素刺激物。由雜交瘤制備抗BoNT/AHc蛋白質(zhì)(6E10-10)上的一個(gè)表位的單克隆抗體，并且與G蛋白包被的磁性微球偶聯(lián)。向含有BoNT/A的溶液中加入這些微球?qū)⑹刮⑶虮欢喾莨潭乖采w，這樣能激發(fā)CANARY細(xì)胞表達(dá)抗非覆蓋型表位的抗體。圖58為曲線圖。蛋白A包被的孩O求與6E10-10抗體偶聯(lián)，并且這些微球被加入以C02I培養(yǎng)基稀釋的BoNT/AHc中。管旋轉(zhuǎn)2分鐘，表達(dá)6B2-2抗體的CANARY細(xì)胞被加入，并且將混合物旋轉(zhuǎn)5秒。使用PMT監(jiān)測光輸出。圖59為柱形圖。冷凍儲(chǔ)藏對BoNTHc溶解度和抗原性的影響。使用400ng/mlBoNTHc激發(fā)基于微球的CANARY試驗(yàn)。新鮮抗原的反應(yīng)為背景的35倍。冷凍和解凍的抗原的反應(yīng)略微降低，并且離心該冷凍-解凍物質(zhì)顯著降低反應(yīng)，說明在冷凍-解凍過程中產(chǎn)生凝聚。來自同一公司的第二批BoNTHc顯示較低的反應(yīng)活性，說明抗原有顯著的批次差異。圖60為曲線圖。血液制品中的BoNT/AHc的才全測。CANARY能檢測血液制品中的可溶性BoNT/AHc。用C02I摻入BoNT/AHc(400ng/ml**)、并且與微球一起孵育12分鐘，產(chǎn)生強(qiáng)信號。摻入BoNT/AHc的全血也在去除細(xì)胞物質(zhì)前通過CANARY檢測。摻入去除血細(xì)胞后(如別處所述處理的)的血漿的BoNT/AHc也產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)上顯著的信號。**注意這些試驗(yàn)測試?yán)鋬龊徒鈨鯞oNT/AHc,因此，在儲(chǔ)藏期間凝聚抗原的損失負(fù)向影響了描述的表觀靈敏度。圖61為曲線圖。尿液中BoNT/AHc的4企測。檢測尿樣中的BoNT/A無需樣品制備。微球被直接加入用400ng/ml"BoNT/AHc摻入的尿液中，孵育12分鐘，并且磁性去除微球。向微球加入培養(yǎng)基，然后加入CANARY細(xì)胞，并且旋轉(zhuǎn)樣品5秒。三個(gè)摻入尿樣中的兩個(gè)顯示顯著信號，然而第三個(gè)樣品的信號是低的。在微球加入前未摻入BoNT/AHc的對照尿液無信號，說明沒出現(xiàn)非特異性刺激物。**注意這些試-驗(yàn)-使用冷凍和解凍BoNT/AHc,因此，在〗諸藏期間損失的凝聚抗原負(fù)向影響了描述的表觀靈敏度。圖62為示意圖。替代的樣品制備程序被用于源自鼻拭子的樣品。樣品制備需要拭子本身、含一體式5微米濾器的筐和試驗(yàn)管。收集拭14子，裁掉拭子柄，并且將拭子頭部置于濾篋中。向拭子加入C02I培養(yǎng)基，并且為該裝置加蓋、并離心。向?yàn)V液中加入微球，并且完成試驗(yàn)而無進(jìn)一步的改變。圖63為曲線圖。如所述收集鼻拭子，將其置入濾筐內(nèi)，并且加入按400ng/ml^摻入BoNT7AHc的C02I培養(yǎng)基。過濾樣品，加入微球，進(jìn)行試驗(yàn)。對這些摻入樣品的反應(yīng)與對無鼻"物質(zhì)"存在的擬(mock)拭子的反應(yīng)類似，說明以這種方式制備的鼻分泌物不含抑制物。僅加入C02I的鼻拭子顯示無反應(yīng)，說明鼻拭子不含任何試驗(yàn)的非特異性刺激物。**注意這些試驗(yàn)測試?yán)鋬龊徒鈨鯞oNT/AHc,因此，在儲(chǔ)藏期間凝聚抗原的損失負(fù)向影響了描述的表觀靈敏度。圖64為柱形圖。在不同液體中的毒素檢測。BoNT/AHc被摻入各個(gè)溶液達(dá)到標(biāo)示濃度。向lO(il上述溶液中加入1.4(il含560mMNaCl、1.4MpH7.9的Hepes和6E10-10偶聯(lián)的順磁性微球的溶液。樣品旋轉(zhuǎn)12分鐘，加入190pl測試培養(yǎng)基，并且磁性捕獲微球(30秒)。去除未結(jié)合的物質(zhì)，并且將微球置于50^1測試培養(yǎng)基中。加入20|_U表達(dá)抗6B2-2表位抗體的CANARY細(xì)胞，試管旋轉(zhuǎn)5秒，并且置于光度計(jì)中。數(shù)值為峰值光輸出(光子/秒)除以無抗原的培養(yǎng)基中的CANARY細(xì)胞的光輸出(紅色條，0ng/ml)的值。如通過在未添加抗原的不同基質(zhì)中孵育的細(xì)胞對微球的類似反應(yīng)所示，清洗步驟去除了非特異性刺激物。CANARY實(shí)驗(yàn)檢測了摻入桔汁(綠色條)和PBT/triton(淺藍(lán)色條)以及對照溶液(測試培養(yǎng)基)(紅色條)中的具有80ng/mlLOD的抗原。在牛奶中(深藍(lán)色條)的靈敏度被抑制超過5倍。圖65為曲線圖。CANARY試驗(yàn)檢測了A型肉毒毒素。以標(biāo)示濃度的肉毒毒素?fù)饺隒02I培養(yǎng)基。加入6E10-10微球，并孵育2分鐘。加入表達(dá)6B2-2抗體的CANARY細(xì)胞，混合物^走轉(zhuǎn)5秒，并監(jiān)測光輸出。含160pg毒素(16ng/ml)的樣品刺激細(xì)胞為背景的10倍多。含32pg毒素(3.2ng/ml)的樣品刺激細(xì)胞為背景的3倍多。圖66為曲線圖。以標(biāo)示濃度肉毒毒素?fù)饺隒02I培養(yǎng)基。加入與S25抗體偶聯(lián)的G蛋白微球，并且孵育2分鐘。加入表達(dá)Raz抗體的CANARY細(xì)胞，混合物旋轉(zhuǎn)5秒，并且監(jiān)測光輸出。圖67為曲線圖。標(biāo)示濃度的BoNT/A摻入全血。通過離心去除血細(xì)胞，向10^1所得血漿中加入6E，10-10抗體包被的/f茲性微球。樣品旋轉(zhuǎn)2分鐘，加入190ml培養(yǎng)基，并且將管置于磁道中20秒。抽吸培養(yǎng)基和血漿，將管從磁體移走，并且加入50plCO2I培養(yǎng)基。將CANARY細(xì)胞置于管蓋內(nèi)，并且樣品離心5秒，以引起微球-細(xì)胞接觸，將管置于光度計(jì)內(nèi)，并且監(jiān)測光輸出。圖68為曲線圖。將鏈霉親和素包被的微球與已被硫代-NHS-生物素、硫代-NHS-LC-生物素或硫代-NHS-LC-LC-生物素中任一種生物素化的6E10-10抗體結(jié)合。向含有800ng/mlBoNT/AHc的溶液中加入微球，并且將育2分鐘。加入6B2-2CANARY細(xì)胞，將管旋轉(zhuǎn)5秒，并且監(jiān)測光輸出。通過最長間隔臂(LCLC)連接的生物素給出略好的信號。圖69為曲線圖。與鏈霉親和素包被的微球結(jié)合的生物素化6E10-10被加入到標(biāo)示濃度的BoNT/A中，并且在室溫下旋轉(zhuǎn)15分鐘。加入6B2-2CANARY細(xì)胞，旋轉(zhuǎn)管5秒，并且在PMT上監(jiān)測光輸出。圖70為曲線圖。將鏈霉親和素包被的磁性微球與生物素化6C2-4和6E10-10抗體混合物結(jié)合。將微球加入到標(biāo)示濃度的BoNT/A中，并且在室溫下旋轉(zhuǎn)15分鐘。加入6B2-2CANARY細(xì)胞，旋轉(zhuǎn)管5秒，并且在PMT上監(jiān)測光輸出。圖71為曲線圖。微球從標(biāo)準(zhǔn)濃度被稀釋10倍。100jJ按標(biāo)示濃度溶于C02I中的0.32ng/mlBoNT/A被加入，并且管在室溫下旋轉(zhuǎn)過夜。加入6B2-2CANARY細(xì)胞，旋轉(zhuǎn)管5秒，并且在PMT上監(jiān)測光輸出。圖72為示意圖。圖73為顯示U937細(xì)胞能被制備以檢測多個(gè)不同病原體的系列曲線圖。圖74為顯示負(fù)載單克隆或多克隆抗體的U937水母發(fā)光蛋白細(xì)胞能夠檢測炭疽芽胞桿菌孢子的一對曲線圖。圖75為Fc受體/通用細(xì)胞系的概要。圖76為啟動(dòng)/負(fù)載U937細(xì)胞的試驗(yàn)流程的概要。圖77為Fc受體細(xì)胞試驗(yàn)流程的概要。圖78為可選擇的實(shí)施方式的概要。圖79為可選4奪的實(shí)施方式的概要。圖80為說明對于水母發(fā)光蛋白的光發(fā)射隨EGFP偏移的系列曲線圖和柱形圖。圖81為說明檢測水母發(fā)光蛋白-GFP發(fā)射體分子的EGFP熒光的系列FACS分析圖。圖82為說明通過分光光度計(jì)檢測水母發(fā)光蛋白-EGFP波長偏移的一對曲線圖。圖83為說明M12g3REGFP-水母發(fā)光蛋白克隆與僅M12g3R水母發(fā)光蛋白細(xì)胞具有類似功能的曲線圖。圖84為說明通過U937水母發(fā)光蛋白和U937EGFP-水母發(fā)光蛋白細(xì)胞進(jìn)行孢子檢測的系列曲線圖。圖85說明激發(fā)的CANARY細(xì)胞的熒光的系列曲線圖。圖86為多重信號檢測的示意圖。圖87為具有不同發(fā)光顏色的CANARY細(xì)胞的示意圖。圖88為EGFP-水母發(fā)光蛋白的克隆方案的示意圖。圖89為產(chǎn)生病原體特異性CANARY細(xì)胞的示意圖。圖90為通用CANARY細(xì)胞的示意圖。圖91為本發(fā)明的實(shí)施方式的例子的梗概。圖92為產(chǎn)生通用CANARY細(xì)胞的示意圖。圖93為產(chǎn)生通用噬菌體細(xì)胞系的示意圖。圖94為Fc受體信號傳導(dǎo)和通用感應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生的示意圖。圖95為抗-Ig(抗-免疫球蛋白)通用細(xì)胞系的示意圖。圖96為對照示意圖。圖97為通用CANARY細(xì)胞的概要示意圖。圖98為Fc受體通用細(xì)胞的概況。圖99為毒素才全測實(shí)施方式的概況。圖100為說明如本發(fā)明所述檢測天竺葵提取物中的青枯雷爾氏菌的曲線圖。圖101為說明用于病原體檢測的天竺葵組織處理的系列照片。圖102為說明使用如本發(fā)明所述的微球結(jié)合方法檢測馬鈴薯Y病毒BYMV的曲線圖。圖103為說明用于檢測血樣中的血源病原體的設(shè)備的一個(gè)實(shí)施方式的系列照片、和說明病原體檢測結(jié)果的曲線圖。圖104為說明如所述的本發(fā)明的組分的示意圖。圖105為說明血樣中的病原體才企測的曲線圖。圖106為曲線圖。具有20^1細(xì)胞輸送的Ba標(biāo)準(zhǔn)品。C02(I)培養(yǎng)基中制備的、并用20plB細(xì)胞測試的50)ilBa樣品。結(jié)果顯示低背景和50cfuBa的LOD(n=2)。圖107為曲線圖。BaB細(xì)胞噴霧。C02(I)培養(yǎng)基中制備的、并用不同數(shù)目的B細(xì)胞噴霧測試的50iulBa樣品。結(jié)果顯示了與20|id細(xì)胞輸送相比、通過兩次噴霧背景增加。噴霧的次數(shù)不影響峰強(qiáng)度(50000cfuBa)(n=l)。圖108為曲線圖。具有1-噴霧細(xì)胞輸送的Ba標(biāo)準(zhǔn)品。C02(I)培養(yǎng)基中制備的、并用B細(xì)胞的一次噴霧測試的50lalBa樣品。結(jié)果顯示與細(xì)胞輸送類似的背景和5000cf的LOD。50和500cfuBa顯示50%的檢測幾率(n=2)。圖109為曲線圖。Ba標(biāo)準(zhǔn)品使用20|1舊細(xì)胞的500cfuBa檢測。具有500cfuBa的50plBa樣品在CO2(I)培養(yǎng)基中制備并且用20^1B細(xì)胞檢測。即使具有比正常所見更高的背景，結(jié)果也顯示500cfu的100%檢測(n=3)。圖110為曲線圖。BaB細(xì)胞噴霧使用1-噴霧B細(xì)胞的500cfuBa檢測。具有500cfuBa的50filBa樣品在C02(I)培養(yǎng)基中制備，并且用一次噴霧的B細(xì)胞檢測。結(jié)果顯示500cfu的50%4企測和2-3倍高的背景(n=14)。圖111為曲線圖。BaB細(xì)胞噴霧使用1-噴霧B細(xì)胞的500cfuBa檢測，無旋轉(zhuǎn)。具有500cfuBa的50plBa樣品在C02(I)培養(yǎng)基中制備，并且用一次噴霧的B細(xì)胞檢測。樣品在讀數(shù)前不進(jìn)行5秒^走轉(zhuǎn)。結(jié)果顯示沒有細(xì)胞與抗原相互作用，導(dǎo)致500cfuBa的0%檢測(>1=3)。圖112為曲線圖。YpB細(xì)胞噴霧使用2(V1B細(xì)胞的500cfuYp檢測。在C02(I)培養(yǎng)基中制備50jil具有500cfuYp的Yp樣品，并用20[ilB細(xì)胞檢測。結(jié)果顯示典型背景和500cfuYp的100°/"企測(n=4)。圖113為曲線圖。YpB細(xì)胞噴霧使用l-噴霧B細(xì)胞的500cfuYp檢測。在C02(I)培養(yǎng)基中制備50|il具有500cfuYp的Yp樣品，并用一次噴霧的B細(xì)胞檢測。結(jié)果顯示略增加的背景和500cfuYp的100%4企觀'](n=8)。圖114為曲線圖。Yp標(biāo)準(zhǔn)品使用20|ulB細(xì)胞的500cfuBa檢測。在C02(I)培養(yǎng)基中制備50|il具有500cfuYp的Yp樣品，并用20^1B細(xì)胞^r測。結(jié)果顯示具有典型背景的500cfu的100%4全測(n=7)。圖115為曲線圖。YpB細(xì)胞噴霧使用20[ilB細(xì)胞的500cfu干Yp檢測。在dH20中制備5^1具有500cfuYp的Yp樣品，干燥過夜，并用20(ilB細(xì)胞檢測。結(jié)果顯示500cfuYp具有100%檢測(n=10)。圖116為曲線圖。YpB細(xì)胞噴霧使用l-噴霧B細(xì)胞的500cfu干Yp檢測。在dH20中制備5^1具有500cfuYp的Yp樣品，干燥過夜，并用l-噴霧B細(xì)胞檢測。結(jié)果顯示較高背景，但是500cfuYp具有100%檢測(n=10)。圖117為B細(xì)^^沖擊試-驗(yàn)的圖示。圖118為抽吸設(shè)備的圖示。圖119為基于伯努利原理的抽吸的圖示。圖120為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的圖示。圖121為說明本發(fā)明的便攜式16通道傳感器的一對照片。該傳19感器包括容納繞其圓周水平、均勻分布的試驗(yàn)管的轉(zhuǎn)子，并且所述轉(zhuǎn)子由繞垂直軸的變速馬達(dá)驅(qū)動(dòng)。單固定光子檢測原件(此時(shí)為PMT)4皮置于轉(zhuǎn)子的平面內(nèi)恰好超出管子旋轉(zhuǎn)過程中的路徑之外。這樣，各個(gè)管子順序、重復(fù)地緊密接近PMT，使其光輸出在各次通過時(shí)被采樣。最終，由光源(紅外LED)和檢測器(光電晶體管)組成的光開關(guān)被用于控制檢測到的光子的計(jì)數(shù)和16個(gè)域內(nèi)的數(shù)據(jù)的再組織，各域分別與特定的樣品相關(guān)。圖122為收集可疑抗原到樣品表面上的可能的方法的示意圖(a)空氣撞擊；(b)靜電收集；(c)從液體樣品中電泳收集；(d)從液體樣品中的2-部分收集與捕獲抗原的功能化磁性微球一起孵育；通過磁化"大頭針"的非均勻磁場內(nèi)的吸引捕獲微球(此時(shí)，由于作用在磁性微球上力與磁場的非均一性相關(guān)，因此使用鋒利的尖部、而非"頭部"應(yīng)是可取的。)圖123(a)~(c)為示意圖圖123(a)具有收集在"頭部"上的顆粒的"直的大頭針"；圖123(b)具有培養(yǎng)基和沉淀的CANARYB細(xì)胞的樣品管的橫截面；圖123(c)倒插進(jìn)B細(xì)胞管的大頭針，引發(fā)發(fā)光反應(yīng)。圖124為對于在針頭上干燥、并且引入(在0秒)含5(Hd沉淀(通過離心)的對Bs敏感B細(xì)胞的200^1管中的Bs孢子的針頭劑量-反應(yīng)曲線的曲線圖。Bs孢子制劑的濃度在圖例中顯示。對用107/mlYp制備的大頭針的反應(yīng)顯示為陰性對照且顯示缺少交聯(lián)反應(yīng)。圖125為BsB細(xì)胞對靜電收集的Bs孢子的反應(yīng)的曲線圖。將5.5KV的電壓施加于對置的大頭針(如圖122(b)所示)。100~370ACPLA(每升空氣含抗原物質(zhì)顆粒)范圍內(nèi)的Bs孢子濃縮物以21/min的速率在不同長度的時(shí)間內(nèi)流經(jīng)大頭針。觀察收集時(shí)間和B細(xì)月包反應(yīng)之間的大致相關(guān)性。圖126為曲線圖。磁"針頭"實(shí)施方式?？莶菅挎邨U菌顆粒在針頭上干燥(刺激空氣沖擊或任何其它適合的局部收集方法的產(chǎn)物)，然后置于含磁性標(biāo)記的B細(xì)胞的液體內(nèi)。磁化大頭針，以將B細(xì)胞吸附于干燥的孢子，并置于光度計(jì)內(nèi)。圖127(a)~(b)為標(biāo)準(zhǔn)的離心CANARY試驗(yàn)和雙重磁性微球試驗(yàn)之間的對比的曲線圖。圖127(a)，在標(biāo)準(zhǔn)的CANARY試驗(yàn)中的鼠疫耶爾森氏菌，和圖127(b)在雙重磁性微球試驗(yàn)中的鼠疫耶爾森氏菌。鼠疫耶爾森氏菌特異性的磁性微球與鼠疫耶爾森氏菌劑稀釋物系列混合5分鐘。5分鐘后，磁性微球與任何結(jié)合的鼠疫耶爾森氏菌一起下降至試驗(yàn)管的底部，并且去除上清液。然后向樣品中加入》茲性標(biāo)記的B細(xì)胞，并且下降至管的底部。圖128為示意圖。在側(cè)向流形式中樣品捕獲的原理。將樣品加至樣品墊(~200W)內(nèi)，其隨之使墊飽和、并流向捕獲膜(0.2卞m膜)。然后向樣品墊中加入B細(xì)胞(50^1),并且緩慢管吸向捕獲膜，在捕獲膜處，B細(xì)胞遇到捕獲的抗原、并發(fā)射光子。圖129為手持側(cè)向流試驗(yàn)形式的照片。著色微球(l屮m直徑)的樣品被置于樣品墊上，并使其被管吸至捕獲膜，以顯示抗原物質(zhì)捕獲帶?？偝叽鐬?英寸x0.25英寸。圖130為顯示側(cè)向流試驗(yàn)結(jié)果的系列曲線圖(a)在標(biāo)準(zhǔn)的CANARY試驗(yàn)中的大腸桿菌，(b)顯示每200ml樣品5000個(gè)顆粒的LOD的大腸桿菌側(cè)向流試驗(yàn)，(c)在標(biāo)準(zhǔn)CANARY試驗(yàn)中的炭疽芽胞桿菌，以及(d)顯示每200ml樣品5000個(gè)顆粒的LOD的側(cè)向流試馬全中的炭疽芽胞桿菌。圖131為自動(dòng)CANARY生物氣溶膠傳感器的實(shí)施方式的示意圖。圖132為說明本發(fā)明的集成式CANARY盤的一對照片。所述自動(dòng)CANARY生物氣溶膠傳感器盤進(jìn)行氣溶膠收集和CANARYB細(xì)胞儲(chǔ)存及輸送功能。為了尺寸比較，顯示了光盤(CD)。圖133為說明自動(dòng)CANARY生物氣溶膠傳感器盤的收集細(xì)節(jié)的系列照片。圖134為顯示自動(dòng)CANARY生物氣溶膠傳感器盤氣溶膠收集最優(yōu)化的系列說明。設(shè)計(jì)多個(gè)沖擊器幾何結(jié)構(gòu)，并且使用CFD(計(jì)算機(jī)流體動(dòng)力學(xué))模擬測試，以及通過收集作為模型顆粒的氣溶膠化熒光ljim聚苯乙烯球試驗(yàn)性地檢驗(yàn)性能。所有測試說明收集的幾何形式和所有最簡單的功能幾何形式被實(shí)現(xiàn)，并且被用于進(jìn)一步研究中。其它的測試幾何形式顯示包括顆粒聚集和重指向的有用性能，這些性能在研發(fā)能產(chǎn)生相對于標(biāo)準(zhǔn)幾何形式更高顆粒密度的新沖擊器幾何形式中應(yīng)是有用的。圖135為自動(dòng)CANARY生物氣溶膠傳感器盤細(xì)胞輸送-粘性塞實(shí)施方式的系列照片。在該實(shí)施方式中，以通過由高粘度、細(xì)胞相容的脂或凝膠(如硅脂、或凡士林油)制備的塞能夠在盤的平面內(nèi)以密封的構(gòu)造形成具有足夠容積以容納用于單試驗(yàn)的CANARYB細(xì)胞的腔。其中粘性塞被插入盤內(nèi)的壁的幾何形式被設(shè)計(jì)為限定所述塞、并在運(yùn)輸和處理過程中保持其穩(wěn)定，但是當(dāng)在短暫旋轉(zhuǎn)過程中施加足夠的離心力時(shí)，能釋放所述塞，從而釋放細(xì)胞以自動(dòng)移動(dòng)到分析位點(diǎn)?？梢赃x擇凝膠為比含CANARYB細(xì)胞的氣溶膠培養(yǎng)基具有更高或更低的密度。如果其密度高于B細(xì)胞培養(yǎng)基(如硅脂)的密度，則粘性塞將位于遠(yuǎn)離CANARY分析位點(diǎn)的盤的規(guī)定區(qū)域內(nèi)的液體的底部。如果凝膠的密度低于B細(xì)胞培養(yǎng)基(如硅脂)的密度，則粘性塞將位于CANARY試劑的頂部，并且能被用于在反應(yīng)位點(diǎn)的上方形成密封，以使其穩(wěn)定用于儲(chǔ)存和運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室用于進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)。圖136為說明自動(dòng)CANARY生物氣溶膠傳感器細(xì)胞輸送-可破壞泡實(shí)施方式的示意圖。在該實(shí)施方式中，使用常規(guī)泡罩包裝材料和方法，用于各個(gè)分析位點(diǎn)的CANARYB細(xì)胞儲(chǔ)存室內(nèi)置到盤蓋中。所述泡的形狀和厚度將被設(shè)計(jì)為使施與所述盤的頂部的局部壓力能破裂面向試驗(yàn)位點(diǎn)的泡壁，從而通過短暫旋轉(zhuǎn)就使CANARYB細(xì)胞能被輸送到試驗(yàn)位點(diǎn)。所述盤具有均勻支撐遠(yuǎn)離反應(yīng)位點(diǎn)側(cè)的泡、和集塑卡具有如圖所示開孔，以提供與用于氣溶膠收集的引導(dǎo)氣流通過盤的管線的適當(dāng)接觸，并且整個(gè)卡對于磁盤是密封的，以在各個(gè)單獨(dú)分析通道之間提供隔離。圖137為曲線圖。PANTHER盤枯草桿菌孢子沖擊結(jié)果。使用氣溶膠室和碰撞噴霧器，一分鐘時(shí)間枯草桿菌顆粒(每升空氣200個(gè)含抗原物質(zhì)顆粒，或ACPLA)壓入測試盤內(nèi)。隨后的測試槽內(nèi)有對枯草芽孢桿菌特異性(曲線圖)和非反應(yīng)性(耶爾森氏菌細(xì)胞系)的B細(xì)胞。對于非反應(yīng)性(耶爾森氏菌)系未觀察到信號。圖138為CANARY技術(shù)的概要。圖139為病原體檢測細(xì)胞系的概要。圖140為用于檢測新出現(xiàn)疾病的通用CANARY細(xì)胞的概要。圖141為用于液體和干樣品的CANARY試-險(xiǎn)的示意圖。圖142為液體樣品的CANARY試驗(yàn)的例子。圖143為使用本發(fā)明所述CANARY技術(shù)的毒素檢測的示意圖。圖144為如本發(fā)明所述的使用微球捕獲的肉毒桿菌毒素的CANARY檢測的例子。圖145為用于血源病原體的CANARY試驗(yàn)的概要。圖146為使用CANARY技術(shù)的衣原體研究的概要。圖147為應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病原體的CANARY技術(shù)的概要。圖148為植物病原體的CANARY檢測的例子。圖149為便攜式16-通道CANARY傳感器的一對照片。圖150為自動(dòng)生物氣溶膠CANARY(BCAN)試驗(yàn)臺(tái)的說明。圖151為對于威脅環(huán)境的排放物的病原體分析儀(PANTHER)的說明圖152為集成的PANTHER盤發(fā)展的說明。圖153為CANARY技術(shù)的概要。圖154為肉毒桿菌毒素的CANARY檢測的概要。圖155為CANARY生物氣溶膠傳感器性能的概要。圖156為植物組織的病毒提取的概要。圖157A和B說明了使用CANARY的植物病毒檢測。圖157A說明樣品制備。圖157B的曲線圖說明結(jié)果。圖158為尿液中BoNT/A的檢測結(jié)果的曲線圖。對于尿樣中的BoNT/A檢測無需樣品制備。與6E10-10抗體偶聯(lián)的微球被直接加入到摻有活性BoNT/A的尿中，孵育15分鐘，并且洗微球。將培養(yǎng)基加到微球中，隨后加入CANARY細(xì)胞，并且旋轉(zhuǎn)樣品5秒。檢測限為16ng/ml，比直接稀釋到測試培養(yǎng)基介質(zhì)內(nèi)的BoNT/A高約5倍。在孩i球加入前未摻有BoNT/AHc的對照尿(0ng/ml)沒有產(chǎn)生信號，說明任何非特異性刺激物都已去除。圖159為血液中BoNT/AHc的檢測結(jié)果的曲線圖。CANARY能夠檢測血制品中的可溶性BoNT/AHc。BoNT/A被摻入如其它處所述制備的全血和血漿(參見Fran，s關(guān)于血樣制備的部分)中。向血漿中加入6E10-10抗體包被G蛋白微球，孵育2分鐘，在培養(yǎng)基中清洗、并使用6B2-2細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。在該試驗(yàn)中對BoNT/A的檢測限為16ng/ml。圖160為向血漿中加入NaCl、Tween-20和TritonX-100的影響結(jié)果的曲線圖。加入NaCl(0.5M終濃度)對信號強(qiáng)度產(chǎn)生了從1700RLU至4800RLU的最顯著的提高。加入Tween是無影響的，但是加入Triton提高信號至接近2700RLU。與單獨(dú)的清潔劑相比，鹽和清潔劑結(jié)合提高了信號，但未至上述單獨(dú)加鹽所實(shí)現(xiàn)的水平。圖161為與鏈霉親和素微球連接的6E10-10抗體孵育20分鐘的BoNT/A(5fmole=800pg)和BoNT/A復(fù)合物(5fmole=5ng)的結(jié)果的曲線圖。加入6B2-2細(xì)胞，并且監(jiān)測光輸出。對等摩爾量的兩種制劑CANARY試驗(yàn)的相似反應(yīng)說明所述復(fù)合體蛋白質(zhì)沒有影響抗體與BoNT/A結(jié)合。圖162為檢測對照培養(yǎng)基中的BoNT/A的結(jié)果的曲線圖。用6E10-10抗體包被的磁性微球被加入到摻有標(biāo)示濃度的BoNT/A的培養(yǎng)基中。將樣品旋轉(zhuǎn)2分鐘，以使毒素與微球結(jié)合。加入6B2-2CANARY細(xì)胞，混合物旋轉(zhuǎn)5秒，并監(jiān)測光輸出。含160pgBoNT/AHc(16ng/ml)的樣品產(chǎn)生的信號為背景的6倍。圖163為柱形圖。分析等量的覆蓋所有三種發(fā)射體類型(a、P、和Y)的各種放射材料。CANARY的反應(yīng)可與市售、基于實(shí)驗(yàn)室的儀器相比。24圖164為CANARY細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)檢測的示意圖。從概念上看，利用CANARY檢測化學(xué)物質(zhì)如生物戰(zhàn)試劑與蛋白質(zhì)毒素的檢測非常類似。周質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)(PBPs)附于微球的表面。目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)的存在將PBP轉(zhuǎn)化為被CANARY細(xì)胞表面上的抗體識別的形式，從而激發(fā)光發(fā)射。圖165為曲線圖。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表使用Pitt發(fā)生器氣溶膠化多分散聚苯乙烯乳膠球進(jìn)行的6次沖擊測得的平均效率。單APS顆粒分選才幾在沖擊機(jī)的進(jìn)口和出口之間轉(zhuǎn)換。實(shí)心紅線為與0.7和1.5nm之間的平均數(shù)據(jù)擬合的指數(shù)。2pm以上，由于在Pitter發(fā)生器中對這些較大顆粒的氣溶膠化效率較低(以及因此顆粒計(jì)數(shù)低)，計(jì)算的效率數(shù)字可信度低。圖166A和B說明枯草桿菌(5ac/〃ww^7/勻孢子的千式鑒定的方法和結(jié)果。如干式試驗(yàn)流程的示意圖(圖166A)所示，加入枯草桿菌特異性的B細(xì)胞，短暫離心旋轉(zhuǎn)驅(qū)使細(xì)胞到達(dá)樣品管底部的收集位點(diǎn)。在干式試驗(yàn)?zāi)Ｊ街械奶禺愋哉f明(圖166B):藍(lán)色曲線撞擊到樣品管上、并且用抗枯草桿菌的細(xì)胞檢測的枯草桿菌說明了CANARY檢測被沖擊樣品的能力。陰性對照觀察枯草桿菌細(xì)胞暴露于干燥的霍亂弧菌(灰色曲線)、無病原體時(shí)的壓入空管內(nèi)的空氣污染物(紅色曲線)、以及當(dāng)抗鼠疫耶爾森氏菌(1^"/m'ape"&)的細(xì)胞被暴露于干式?jīng)_擊的枯草桿菌孢子(黑色曲線)的基礎(chǔ)反應(yīng)。圖167說明用于自動(dòng)生物氣溶膠收集、和CANARY分析的BCAN載體。圖168說明設(shè)計(jì)為整合氣溶膠收集和B細(xì)胞輸送的CANARY盤(CD)。圖169說明具有沖擊嘴和透明管的氣溶膠收集模塊剖視圖。圖170說明具有閥輸送系統(tǒng)的CANARYB細(xì)胞輸送才莫塊。圖171說明去除了不透光蓋的TCAN-2自動(dòng)生物傳感器。圖172說明本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式。PANTHER盤(左側(cè))為可以像CD—樣被加載于便攜式PCNTHERCUB傳感器(中間)內(nèi)，或者最終被加載于高通量自動(dòng)點(diǎn)檢測和鑒定傳感器(右側(cè))內(nèi)的自主式生物氣溶膠取樣和CANARY分析工具。圖173A和B為如此處所述的本發(fā)明的實(shí)施方式的示意圖解。圖174為本發(fā)明的實(shí)施方式的另一示意圖。圖175為說明流速和通過盤有效輸送并且引導(dǎo)沖擊到此處所述設(shè)備的收集表面上的顆粒大小之間的關(guān)系的柱形圖。圖176說明本發(fā)明的實(shí)施方式。圖177說明自動(dòng)處理圖示CANARY盤的壓縮傳感器設(shè)備。圖178說明此處所述的CANARY設(shè)備的核心部件。圖179為CUB傳感器的性能特征的曲線圖?？莶輻U菌孢子氣溶膠的CUB分析的典型信號。圖180說明本發(fā)明的不同實(shí)施方式。圖181為正、負(fù)雙向電泳概念的示意說明。圖182為用于DEP測試芯片的制作過程。圖183A和B說明(a)由在石英基底上的叉指鎢薄膜電極組成的DEP芯片的基本設(shè)計(jì)。(b)線寬和間隔的組合的板。圖184為側(cè)向流模式的樣品捕獲原理的示意圖。將樣品加至樣品墊(~200m1)內(nèi)，其隨之使所述墊飽合、并且流向捕獲膜(0.2卞m膜)。然后向樣品墊中加入B細(xì)胞(50|al),并且緩慢管吸向捕獲膜，在捕獲膜處，B細(xì)胞遇到捕獲的抗原、并發(fā)射光子。圖185為手持側(cè)向-流試驗(yàn)?zāi)Ｊ降恼掌Ｖ⑶?l屮m直徑)的樣品被置于樣品墊上，并使其被向上管吸至捕獲膜，以顯示抗原捕獲帶?？偝叽鐬?英寸x0.25英寸。圖186A-D為側(cè)向流試驗(yàn)結(jié)果的曲線圖圖186A:在標(biāo)準(zhǔn)的CANARY試驗(yàn)中的大腸桿菌，圖186B:顯示每200ml樣品5000個(gè)顆粒的LOD的大腸桿菌側(cè)向流試驗(yàn)，圖186C:在標(biāo)準(zhǔn)CANARY試驗(yàn)中的炭疽芽胞桿菌，以及圖186D:顯示每200ml樣品5000個(gè)顆粒的LOD的側(cè)向流試驗(yàn)中的炭疽芽胞桿菌。圖187A和B為標(biāo)準(zhǔn)的離心CANARY試驗(yàn)和雙重磁性微球試驗(yàn)之間的對比的曲線圖。圖(a),在標(biāo)準(zhǔn)的CANARY試驗(yàn)中的鼠疫耶爾森氏菌，以及(b)在雙重磁性微球試驗(yàn)中的鼠疫耶爾森氏菌。鼠疫耶爾森氏菌特異性的磁性微球與鼠疫耶爾森氏菌劑稀釋物系列混合5分鐘。5分鐘后，磁性微球與任何結(jié)合的鼠疫耶爾森氏菌一起被拉至試驗(yàn)管的底部，并且去除上清液。然后向樣品中加入磁性標(biāo)記的B細(xì)胞，并且下降至管的底部。圖188為手持傳感器筒的示意圖。(a)具有處于儲(chǔ)存位置的磁拭體的筒。(b)從筒中拉出的拭體。(c)準(zhǔn)備使用的拭體，具有l(wèi)-柄、2-保護(hù)套(拉出)、3-軸、4-磁頭。(d)準(zhǔn)備插至讀取位置的拭體。(e)具有處于讀取位置的拭體的筒5-旋轉(zhuǎn)至接受磁頭位置的B細(xì)胞嚢、6-通過筒底部的孔的光發(fā)射。圖189為手持CANARY傳感器設(shè)計(jì)的一對示意圖。該設(shè)計(jì)重新定位PMT,從而其被直接指向試驗(yàn)管的底部，在此處為了收集最大信號而收集CANARY細(xì)胞。設(shè)計(jì)樣品插入裝置，以經(jīng)滑動(dòng)裝置運(yùn)行，所述滑動(dòng)裝置使得操作方便、樣品和PMT之間的距離最小、以及在樣品負(fù)載步驟中遮蔽PMT不受環(huán)境光的影響，從而使讀取過程中的儀器噪音最小。設(shè)計(jì)門柄以包含用于樣品處理的強(qiáng)稀土磁體，以及在這些處理進(jìn)行的同時(shí)在磁體附近的位置容納管的管接收器。圖190為手持CANARY傳感器樣機(jī)的系列照片。PMT具有雙堿陰極，其具有300650nm有效光i普靈敏度范圍。其以光子計(jì)數(shù)模式被操作，并且信號被記錄、且經(jīng)RS-232(9針插頭)被傳遞至便攜式電腦用于進(jìn)一步的分析。手持部件具有使用內(nèi)置在傳感器內(nèi)的可充電NiCd電池運(yùn)行達(dá)8小時(shí)、或者當(dāng)與12V電源(也用于^^內(nèi)部電池組充電)連接時(shí)的無限運(yùn)行的選擇。具體實(shí)施例方式此處描述的本發(fā)明提供了用于檢測可溶性抗原的方法。例如，所述可溶性抗原可以為可溶性蛋白質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可溶性抗原4又包4舌一種或兩種抗原表位。4吏用在細(xì)力包表面上表達(dá)27的抗體檢測可溶性抗原依賴于抗原交聯(lián)(或結(jié)合，從而固定在細(xì)胞表面抗體上)細(xì)胞表面上的抗體從而激發(fā)細(xì)胞內(nèi)4丐增加的能力，其中抗體與抗原的結(jié)合引發(fā)了鈣濃度的增加這又刺激了發(fā)射體分子響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)4丐的增加而發(fā)射光子。可溶性抗原對于交聯(lián)細(xì)胞表面上表達(dá)的抗體可能是無效的，并且因而對于激發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣增加是無效的。此處描述了用于檢測可溶性抗原的方法，其中通過所述方法實(shí)現(xiàn)抗體的交聯(lián)，這又激發(fā)了細(xì)胞內(nèi)4丐增加，并且引起發(fā)射體分子響應(yīng)鈣離子濃度增加而發(fā)射光子。待檢測的受關(guān)注可溶性抗原和化學(xué)物質(zhì)包括多種多樣的抗原。例如，但不限于，此處本發(fā)明所描述的方法可以被用于檢測蛋白質(zhì)毒素如肉毒桿菌毒素(A、B、C、D、E、F、G血清型)、葡萄球菌腸毒素-B(SEB)和其它超抗原、篦麻毒素、百日咳毒素、志賀毒素、芋螺毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌e毒素、志賀樣核糖體滅活蛋白質(zhì)，其它可溶性細(xì)菌產(chǎn)物，如來自鼠疫耶爾森氏菌的Fl抗原、來自炭疽桿菌的保護(hù)抗原、致死因子、來自炭疽桿菌的水肺因子。檢測中的其它受關(guān)注分子包括如高絲氨酸內(nèi)酯的細(xì)菌群體感應(yīng)分子。使用此處描述的方法可以檢測的化學(xué)戰(zhàn)劑、或者其水解后分解產(chǎn)物的例子包括、但不限于氰化物(氰氫酸)、光氣(碳氯化物)、CK(氯化氰)、CL(氯)、CX(二氯碳亞胺、氫氧化物)、DP(氯曱酸千酯、三氯曱基酯)、GA、塔崩(二曱氨基氰磷酸乙酯)、GB、沙林(甲氟膦酸(Methylphosphonofluoridicacid)(l-甲基乙基)異丙酯)、GD、索曼(甲氟膦酸1，2，2-三曱基丙酯)、GF(曱氟膦酸環(huán)己酯)、芥子氣(l，l，-硫代二[2-氯乙烷])、HN-1、氮芥(2-氯-N-(2-氯乙基)-N-乙基乙胺)、HN-2、氮芥(2-氯-N-(2-氯乙基)-N-甲乙胺)、路維西特(二氯化(2-氯乙烯基)亞胂酸)、PFIB(1，1,3，3，3-五氟-2-三氟曱基-1-丙烯)、三光氣(三氯甲基碳酸酯)、V-氣(甲硫磷酸S-[2-(二乙胺)乙基]0-2-曱丙酯)、VX(曱硫磷酸S-[2-[二(l-曱乙基)胺]乙基]O-乙酯)、雙組分的VX(0-乙基0-2二異丙基胺乙基曱基亞膦酸酯和硫)、雙組分的GD(甲膦酰二氟(DF)和頻哪基醇與胺的混合物)、雙組分28的GB(甲膦酰二氟(DF)及異丙基醇與異丙胺的混合物(OPA))。枝菌素，尤其單端孢霉烯(T2)毒枝菌素、蛇形菌素多樣組、貝類毒素或其它腰鞭毛蟲(dinoflagellage)產(chǎn)物，微嚢藻毒素(各種類型)、水螅毒素、葡萄穗霉毒素H、黃曲霉毒素和河豚毒素。待檢測的其它受關(guān)注蛋白質(zhì)包括APP(淀粉樣前體蛋白質(zhì))、與CJD、BSE、癢病、苦魯病和PSA(前列腺特異性抗原)相關(guān)的朊病都是有用的，如臨床應(yīng)用，例如曱狀腺功能、腎上腺功能、骨代謝、生育、不育、IVF、懷孕、生長和生長激素不足、糖尿病、血液病、心臟功能、癌、過敏、自身免疫性疾病、治療藥物監(jiān)控、藥物濫用、研究免疫分析應(yīng)用、遺傳工程蛋白質(zhì)、乳品的藥物殘留、肝功能、抗生素和抗生素合成路徑。用于在這些應(yīng)用中分析的適合的可溶性抗原對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的(例如，參見"免疫實(shí)驗(yàn)手冊(TheImmumoassayHandbook)"(第二版)，DavidWild編輯。自然出版集團(tuán)(NaturePublishingGroup)2001。NYNY)。本發(fā)明也提供了對于特異性核酸(NA)序列的檢測和鑒定。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用寡核苷酸探針將抗原連接于目標(biāo)NA。這些探針利用抗原修飾特異性NA序列。這些抗原修飾的(此處也稱為"抗原偶聯(lián)的")寡核苷酸能夠激發(fā)表達(dá)抗所述抗原的抗體的發(fā)射體細(xì)胞。自由探針(如果存在)為單體，因而不能激發(fā)發(fā)射體細(xì)胞。同樣地，標(biāo)記的寡核苷酸與NA上的非特異性位點(diǎn)的背景結(jié)合不會(huì)顯著激發(fā)發(fā)射體細(xì)胞，因?yàn)橛蛇@些極少的背景結(jié)合事件得到的抗原非常之少以至于不能有效地交聯(lián)抗體?？乖倪x擇取決于許多因素，包括相應(yīng)的抗體的可用性和特性、在被測樣品中不存在交叉活性的抗原、以及抗原-寡核苷酸復(fù)合物的溶解性、穩(wěn)定性和費(fèi)用，這些都是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解的。如在此所應(yīng)用的，寡核苷酸可以為DNA、RNA、肽核酸(PNA)、鎖核酸、或具有本領(lǐng)域已知的專門和獨(dú)特性質(zhì)的任何種類的修飾核酸替代物。此外，向這些探針中加入陽離子氨基酸(以肽或蛋白質(zhì)的形式)可以提高雜交率。如果希望，那些陽離子肽/蛋白質(zhì)可作為被發(fā)射體細(xì)胞檢測的抗原發(fā)揮雙重職能。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供基于在其表面上具有一個(gè)或多個(gè)抗體、且包含化合物(發(fā)射體分子)的發(fā)射體細(xì)胞的檢測系統(tǒng)，當(dāng)被抗原刺激時(shí)所述化合物發(fā)射光子，特別是通過細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增加刺激光發(fā)射，所述抗原由于存在靶NA而為多體的。此處所述的本發(fā)明也提供了檢測被一個(gè)或多個(gè)抗體結(jié)合的目標(biāo)顆粒的感應(yīng)細(xì)胞。具體地，所述感應(yīng)細(xì)胞包括發(fā)射體分子和結(jié)合與目標(biāo)劑或顆粒結(jié)合的抗體的Fc受體。在一個(gè)實(shí)施方式中，包括Fc受體的感應(yīng)細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，如人巨噬細(xì)胞系U937。其它適合的細(xì)月包或細(xì)胞系對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。所述Fc受體為結(jié)合抗體或免疫復(fù)合物的一族膜表達(dá)蛋白質(zhì)。它們在包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的幾種血液細(xì)胞上表達(dá)。存在Fc受體的多個(gè)亞類，包括FcY受體(FcYRI)、可溶性抗體的高親和結(jié)合物。FcYRI結(jié)合免疫球蛋白G(IgG)的恒定區(qū)(Fc部分)，留下抗體的抗原結(jié)合區(qū)域。抗體結(jié)合的Fc受體被特異性抗原交聯(lián)啟動(dòng)刺激鈣離子釋放的信號通路。因而，感應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體的交聯(lián)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增加，并且從而發(fā)射體分子響應(yīng)4丐濃度的增加而發(fā)射光子。此處所描述的本發(fā)明也提供16-通道傳感器。在其最簡單的形式中，發(fā)射體細(xì)胞試驗(yàn)包括在透明管中制備樣品、向所述管中引入等份的特別制備的發(fā)射體細(xì)胞、利用快速離心旋轉(zhuǎn)將發(fā)射體細(xì)胞驅(qū)至管底部、以及用光計(jì)數(shù)傳感器測量管的光輸出。在實(shí)驗(yàn)室中，大多數(shù)發(fā)射體細(xì)胞試驗(yàn)順序進(jìn)行，每次一個(gè)樣品；在自動(dòng)BAWS/CANARY儀器中，同時(shí)測量四個(gè)樣品，各樣品具有其自己的光收集通道。前一系統(tǒng)需要更多時(shí)間，然而后者需要更復(fù)雜(和昂貴)的硬件。此處描述了減少測量多個(gè)樣品的時(shí)間(同時(shí)保持硬件需求最小)的不同方法。已設(shè)計(jì)了允許使用單光收集通道同時(shí)測量多個(gè)樣品的傳感器。所述傳感器包括容納16個(gè)繞其圓周水平、均勻分布的1.5ml管子、并且由繞垂直軸的可變速馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)子(圖39)。單固定光子檢測原件(如PMT)被置于轉(zhuǎn)子的平面內(nèi)恰好超出管子旋轉(zhuǎn)過程中的軌跡之外。在該設(shè)計(jì)中，使各個(gè)管子順序、反復(fù)地緊密接近光子檢測原件，使其光輸出在各次通過時(shí)被采樣。最終，由光源(紅外LED)和檢測器(光電晶體管)組成的光開關(guān)用于控制檢測到的光子的計(jì)數(shù)和將數(shù)據(jù)再組織在16個(gè)域內(nèi)，各個(gè)域分別與特定的樣品相關(guān)聯(lián)。該16-通道設(shè)計(jì)的另一實(shí)施方式被稱作TCAN傳感器。所述TCAN(觸發(fā)-CANARY)生物傳感器為將氣溶膠收集和發(fā)射體細(xì)胞液體輸送組合為集成徑向盤形式的自動(dòng)生物傳感器。所述TCANCANARY盤(CD)(圖42)與將氣流分流到分離的通道內(nèi)的管線組件連接。氣溶膠收集設(shè)備(圖43)使用干式?jīng)_擊技術(shù)，以隨后將來自氣流的顆粒定位至干凈的塑料管底部。氣溶膠顆粒沖擊后，所述CD與所述管線組件連接以驅(qū)動(dòng)位于盤內(nèi)的閥。所述圓盤快速旋轉(zhuǎn)，這隨之使發(fā)射體細(xì)胞液體利用離心力輸送至各個(gè)管(圖44)。然后使用光檢測器基于與氣溶膠顆粒相互作用的發(fā)射體細(xì)胞的光子輸出鑒定潛在的生物抗原。該氣溶膠收集和發(fā)射體細(xì)胞輸送的過程可以在一個(gè)盤中重復(fù)多次。該特征使在多個(gè)觸發(fā)事件后進(jìn)行多次發(fā)射體細(xì)胞試驗(yàn)，而無需換CD。以下進(jìn)一步描述適于本發(fā)明中使用的材料和方法。發(fā)射體細(xì)胞所述發(fā)射體細(xì)胞(此處也稱為感應(yīng)細(xì)胞或CANARY細(xì)胞)可以為任何天然地或通過遺傳工程或通過化學(xué)添加而具有適當(dāng)受體、信號通路和信號輸出方法的真核或原核細(xì)胞。所述細(xì)胞可以為人造或非生命單元，只要其具有功能受體、信號通路和信號輸出方法。當(dāng)抗原-受體結(jié)合，例如結(jié)合到抗體時(shí)，細(xì)胞將鈣離子調(diào)集到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。在本發(fā)明的設(shè)備和方法中使用的細(xì)胞的例子為可以通過遺傳工程表達(dá)一個(gè)或多個(gè)表面結(jié)合的單克隆抗體的B細(xì)胞(如，具有骨質(zhì)顎的冷或熱血脊推動(dòng)物的B細(xì)胞)。在所述設(shè)備中使用的細(xì)胞的另一例子為在細(xì)胞表面上表達(dá)Fc受體的巨噬細(xì)胞，如人細(xì)胞系U937。通過向目標(biāo)中加入抗體，抗原與抗體結(jié)合，且該抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合細(xì)胞上的Fc受體并激活導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣增加的信號傳導(dǎo)。例如，單克隆抗體可以通過如下方法制備用待4全測的抗原免疫動(dòng)物并收獲免疫動(dòng)物的b細(xì)胞，然后，可以分離編碼單克隆的dna，并將其轉(zhuǎn)移至永生化細(xì)胞系內(nèi)，再篩選產(chǎn)生對待檢測抗原具有特異性的表面單克隆抗體的細(xì)胞。尤其因?yàn)楫?dāng)附加的目標(biāo)試樣被暴露于b細(xì)胞時(shí)b細(xì)胞的發(fā)射信號典型地不會(huì)顯著減少，并且也因?yàn)樵揵細(xì)胞的發(fā)射信號為線性的，因此b細(xì)胞對于定性和定量分析都是有用的?？蛇x擇地，細(xì)胞可以為成纖維細(xì)胞。然而，成纖維細(xì)胞并不含有對于將信號從表面抗體的細(xì)胞質(zhì)部分轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的鈣庫所必須的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。為了克服該問題，可以在成纖維細(xì)胞內(nèi)表達(dá)嵌合表面抗體。這種嵌合抗體含有源自可以將成纖維細(xì)胞的質(zhì)膜的內(nèi)表面的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)鈣庫的多肽(如成纖維細(xì)胞生長因子受體)的細(xì)胞質(zhì)氨基酸序列。這樣，當(dāng)抗原與嵌合抗體的細(xì)胞外部分結(jié)合、以引起在表面上的抗體聚集時(shí)，誘導(dǎo)釣動(dòng)員。使用嵌合抗體的相似方案可以被用于任何其它非b細(xì)胞的細(xì)胞類型，從而細(xì)胞適宜在本發(fā)明的設(shè)備和方法中使用。在此處的設(shè)備和方法中有用的細(xì)胞為被設(shè)計(jì)成識別特異性物質(zhì)的細(xì)胞，包括在其表面具有與所述物質(zhì)特異性結(jié)合的受體的細(xì)胞。盡管其它與待識別的物質(zhì)特異性結(jié)合的適合受體包括促細(xì)胞分裂劑受體(如脂多糖(lps)受體)、巨噬細(xì)胞消除劑受體、t細(xì)胞受體、細(xì)胞粘附分子、如序列特異性限制性酶部分或轉(zhuǎn)錄因子的dna結(jié)合蛋白質(zhì)、單鏈rna或雙鏈rna結(jié)合蛋白質(zhì)、與被識別的dna或rna序列互補(bǔ)的寡核苷酸、或其它配體結(jié)合受體(如Fas;細(xì)胞因子、白介素、或荷爾蒙受體；神經(jīng)遞質(zhì)受體；著嗅劑受體；化學(xué)引誘物受體等)，優(yōu)選受體為抗體或單鏈抗體。受體可以通過跨膜域、與受體(如與抗體結(jié)合的Fc受體)特異性結(jié)合的膜結(jié)合分子、或膜結(jié)合分子的共價(jià)或非共價(jià)連接物(如生物素-鏈霉親和素、二硫鍵等)被附于細(xì)胞表面。受體也可以為嵌合分子；例如，其可以具有細(xì)胞外域，如抗體、單鏈抗體、凝集素或其它物質(zhì)特異性結(jié)合域或肽，以及胞內(nèi)域，如胰島素受體、成纖維細(xì)胞生長因子或其它引發(fā)第二信號級聯(lián)反應(yīng)的蛋白質(zhì)等的細(xì)胞內(nèi)域。除了待識別物質(zhì)的直接結(jié)合，受體可以特異性結(jié)合另一分子或物體，其隨之特異性結(jié)合待識別物質(zhì)，如次級抗體、標(biāo)記的微球、抗原偶聯(lián)的寡核苷酸等?？蛇x擇地，僅這些結(jié)合步驟之一可能需為特異性的。例如，使用與一個(gè)抗原偶聯(lián)的(或直接與微球偶聯(lián)的、或在基質(zhì)上的)寡核苷酸探針可以將含特異性序列的DNA或RNA從溶液中調(diào)出，并且第二組與目標(biāo)DNA/RNA退火的非特異性抗原偶聯(lián)寡核苷酸探針將被用于刺激對第二抗原特異性的細(xì)胞。并且，在細(xì)胞表面上作為嵌合體表達(dá)的非特異性核酸結(jié)合蛋白質(zhì)(組蛋白、魚精蛋白、RNA結(jié)合蛋白)或抗這些結(jié)合蛋白質(zhì)的抗體在序列特異性選擇步驟之后也可能被用于檢測核酸的存在。抗體無論何種源細(xì)胞類型，單克隆抗體的抗原結(jié)合可變區(qū)域可以作為公共來源的DNA序列被獲得，或者可以通過RT-PCR由雜交瘤細(xì)胞系克隆。使用設(shè)計(jì)為在5，端與可變區(qū)域的前導(dǎo)區(qū)或框架區(qū)退火、在3，端與恒定區(qū)域退火的引物組進(jìn)行RT-PCR。然后將抗體可變區(qū)域克隆到已含有輕和重鏈的恒定區(qū)域的表達(dá)載體內(nèi)。在Persic等，Gene187:9-18，1977中描述的輕《連表達(dá)載體尤其適于該目的。Persic等描述的VKExpress包含EF-la啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、多克隆位點(diǎn)和人IgK恒定與和多聚腺苷酸化信號。重鏈表達(dá)載體源自Invitrogen的pDisplay。該載體含有CMV啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、HA標(biāo)簽、多克隆位點(diǎn)和myc標(biāo)簽，之后為PDGFR跨膜域和牛生長激素多聚腺苷酸化信號。對于重鏈表達(dá)，pDisplay可以被修飾如下。用沒有分泌用外顯子的鼠IgM恒定區(qū)域代替pDisplay的PDGFR跨膜域。這樣確保了蛋白33質(zhì)仍為膜連接的。新霉素抗性基因可以包括但不限于潮霉素、爭光霉素、嘌呤霉素、卡那霉素、和殺稻瘟菌素基因的多種抗生素抗性基因的任何一種替代。使用重疊PCR、以兩步驟方法可以插入重鏈(或可選擇地輕鏈)可變區(qū)域以去除pDisplay的多克隆位點(diǎn)任何一側(cè)出現(xiàn)的HA和myc標(biāo)簽。也可以進(jìn)一步發(fā)展載體以允許含被融合至IgM恒定區(qū)域的約300個(gè)堿基對的可變區(qū)域的重疊延伸產(chǎn)物的插入，從而可以以單步進(jìn)行克隆。使用上述抗體載體構(gòu)建方法實(shí)施了以下例子。與待檢測的抗原特異性結(jié)合的抗體為結(jié)合抗原或抗原的表位的分子，但基本不結(jié)合樣品中的其它抗原或表位。這種抗體可以為嵌合體(即，含非抗體氨基酸序列)或單鏈(即由一個(gè)連續(xù)的多肽序列形成抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)域)?？蛇x4奪地，可以從動(dòng)物獲得產(chǎn)生表面抗體的細(xì)胞，并且用于通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如最早由Kohler等Nature256:495-497(1975);Kozbor等ImmunolToday4:72(1983);或Cole等MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.LissInc.,pp.77-96(1985)描述的雜交瘤技術(shù))制備表達(dá)表面抗體的單克隆群。制備表達(dá)單克隆抗體的細(xì)胞的技術(shù)是公4口的(參見，^口CurrentProtocolsinImmunology(1994)Coligan等(eds)JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,N.Y.),對此進(jìn)行了選擇表面抗體而非分泌抗體所必須的改進(jìn)。任何被用于融合淋巴細(xì)胞和永生細(xì)胞系的已知流程都可以^皮用于制備產(chǎn)生表面單克隆抗體的細(xì)胞的目的(參見如CurrentProtocolsinImmunology,如上；Galfre等，Nature266:55052,1977;Ke匿th，InMonoclonalAntibodies:ANewDimensionInBiologicalAnalyses,PlenumPublishingCorp.,NewYork,N.Y.,1980;和Lemer，YaleJBiolMed54:387-402(1981))。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解有許多同樣有用的這種方法的變化形式。通過用待檢測的抗原免疫適當(dāng)?shù)膭?dòng)物可以制備表達(dá)抗體的多克離，并且通過如用抗原覆蓋的皮氏培養(yǎng)皿淘洗的公知技術(shù)被進(jìn)一步純化。作為制備單克隆細(xì)胞的可選擇方法，通過用抗原篩選重組免疫球蛋白庫(如抗體噬菌體展示文庫)鑒定和分離編碼單克隆抗體的核酸，從而分離結(jié)合抗原的免疫球蛋白文庫成員。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫的i式劑盒是市售可4尋的(如，PharmaciaRecombinantPhageAntibodySystem，貨號No.27-9400-01;和StmtageneSurfZAP⑧噬菌體展示試劑盒，貨號No.240612)。此外，在如，美國專利No.5,223,409、PCT公開No.WO92/18619、PCT公開No.WO91/17271、PCT公開WO92/20791、PCT公開No.WO92/15679、PCT公開No.WO93/01288、PCT公開No.WO92/01047、PCT公開No.WO92/09690、PCT公開No.WO90/02809、Fuchs等Bio/Technology9:1370-1372(1991);Hay等，HumanAntibodHybridomas3:81-85(1992)、Huse等Science246:1275-1281(1989)、Griffiths等EMBOJ.12:725-734(1993)中可以找到尤其適于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫所用的方法和試劑的例子。文庫的期望成員被鑒定后，特異性序列可以被克隆到任何適合的核酸表達(dá)子(如載體)內(nèi)，并且可以被轉(zhuǎn)染到如成纖維細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)。所述表達(dá)子可以也編碼適合表達(dá)抗體之細(xì)胞的可操作地連接于抗體序列的氨基酸。如上所述，成纖維細(xì)胞生長因子受體的細(xì)胞質(zhì)跨膜序原接觸時(shí)固定4丐。盡管可以在成纖維細(xì)胞中表達(dá)單獨(dú)的重組重鏈和輕鏈以形成嵌合抗體，但是單鏈抗體也是適合的(參見如Bird等TrendsBiotechnol9:132-137，1991;和Huston等IntRevImmunol10:195-217,1993)。光子發(fā)射體分子待檢測物質(zhì)與細(xì)胞表面受體的結(jié)合應(yīng)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號通路。優(yōu)選的信號通路為在B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第二信使級聯(lián)反應(yīng)，其中細(xì)胞表面受體的交聯(lián)激活了酪氨酸激酶，然后其磷酸化磷脂酶C,然后磷脂酶C將磷酸肌醇4,5-二磷酸(PIP2)裂解為肌醇1，4,5-三磷酸(IP3)和甘油二酯；然后IP3開啟鈣通道以從如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞內(nèi)庫釋放鈣、或者放入細(xì)胞外的鈣，從而提高細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)的鈣濃度。根據(jù)受體類型、細(xì)胞類型和所希望的信號傳導(dǎo)方法，可以使用替代的第二信使級聯(lián)，如G蛋白-腺苷酰-環(huán)-cAMP-蛋白激酶A級聯(lián)。應(yīng)提供監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)對待檢測物質(zhì)反應(yīng)的信號。如果內(nèi)部信號涉及細(xì)胞質(zhì)4丐增加，則優(yōu)選的檢測方法為釣敏感發(fā)光或熒光分子，如水母發(fā)光蛋白、奧貝4木(obelin)、thalassicolin、mitrocomin(halistaurin)、4丐調(diào)發(fā)光蛋白(clytin(phialidin))、mnemopsin、瓜tK母光蛋白、Indo畫l、Fura-2、Quin-2、Fluo-3、Rhod-2、4丐綠(calciumgreen)、BAPTA、cameleons(A.Miyawaki等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.96，213540)或類似分子。預(yù)計(jì)通過使用鈣敏分子所賦予的光的相對強(qiáng)度和感應(yīng)細(xì)胞儲(chǔ)存特性可以隨特異性發(fā)射體分子的光產(chǎn)生效率和活化的發(fā)射體分子的半衰期而變化一在某些情況下提供顯著的益處(如改善的靈敏度、定量和定性檢測)。附加性能改進(jìn)可以來自發(fā)光蛋白發(fā)射體分子的天然協(xié)同因子的結(jié)構(gòu)類似物。可以被活細(xì)胞吸收的各種鈣敏熒光染料為從包括MolecularProbes,Inc.Eugene,Oreg的商業(yè)來源獲得。如水母發(fā)光蛋白、奧貝沖木、thalassicolin、mitrocomin(halistaurin)、《丐i周發(fā)光蛋白(phialidin)、mnemopsin、瓜？J^母光蛋白、或cameleons的蛋白可以通過遺傳學(xué)方法加入、注入細(xì)胞內(nèi)或通過HIVTAT的蛋白質(zhì)吸收標(biāo)簽(大約47-57氨基酸；AHo等(2001)CancerResearch61,474-477)運(yùn)送或通過其它方法。如果希望，該報(bào)告分子可以包括將其定向于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)面、線粒體的內(nèi)部或其它局部鈣濃度變化可能尤其大的區(qū)域的定位信號。也可以使用檢測信號通路其它點(diǎn)的活性的光學(xué)方法，如與信號通路的組分連接的熒光基團(tuán)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)(S.R.Adams等(1991)Nature349,694-697)。當(dāng)內(nèi)部信號涉及反應(yīng)性氧物質(zhì)(如過氧化物陰離子自由基、羥基自由基、辣根過氧化物酶的化合物I或II等)增加時(shí)，優(yōu)選的檢測方法為反應(yīng)性氧敏感發(fā)光或熒光分子，如發(fā)光蛋白pholasin(來自生物發(fā)光軟體動(dòng)物海夢(Pholasdactylus)的34-kDa糖蛋白)或類似分子?？蛇x擇地,可以將對于任何熒光素酶的報(bào)告基因與被信號通路誘導(dǎo)的啟動(dòng)子連接。在如T細(xì)胞和肥大細(xì)胞的某些細(xì)胞中，信號通路引發(fā)含如顆粒溶解酶、類胰蛋白酶、或糜酶的蛋白酶的顆粒的胞外分泌。可以通過測熱量或測焚光的方法檢測這些蛋白酶的胞外分泌(如與被蛋白酶裂解的肽連接的對硝基苯胺或7-氨基-4-三氟曱基香豆素(AFC)[S.E.lavens等(1993)J.Immunol.Methods166,93;D.Masson等(1986)FEBSLetters208，84;R&DSystems])。并且，微電極或其它4全測與4丐通量或其它信號離子通量相關(guān)的電活性的方法適用于監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)的信號反應(yīng)。適合的發(fā)射體分子為任何響應(yīng)于升高的細(xì)胞胞質(zhì)鈣濃度發(fā)射光子的分子，包括生物發(fā)光和熒光分子。在Button等CellCalcium14:663-671(1993)、Shimomura等CellCalcium14:373-378(1993)、和Shimomura,Nature227:1356-1357(1970)中描述了一個(gè)發(fā)射體分子，即生物發(fā)光的水母發(fā)光蛋白。通過氧化一種小的化學(xué)分子(腔腸素)，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生光子。腔腸素通過細(xì)胞膜擴(kuò)散，從而腔腸素或其類似物可以被加入到細(xì)胞周圍的培養(yǎng)基內(nèi)?？蛇x擇地，編碼產(chǎn)生腔腸素的酶的基因可以被引入細(xì)胞內(nèi)。在另一實(shí)施方式中，生物發(fā)光的綠色熒光蛋白(GFP)(參見Chalfie，PhotochemPhotobio62:651-656[1995])或黃色熒光蛋白(YFP)可以被使用。在該實(shí)施方式中，細(xì)胞溶質(zhì)同時(shí)含有GFP和水母發(fā)光蛋白。對細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)升高的4丐作出響應(yīng)，水母發(fā)光蛋白在無發(fā)射的能量轉(zhuǎn)移過程中向GFP供能量。然后GFP發(fā)射光子。可選擇地，發(fā)射體分子可以為通過適于誘導(dǎo)熒光的波長光發(fā)光的鈣敏熒光分子(如indo-l)。法引入細(xì)胞。如果發(fā)射體分子為蛋白質(zhì)(如使用水母發(fā)光蛋白的情況)，則細(xì)胞可以含有編碼所述蛋白質(zhì)的表達(dá)載體(即，當(dāng)被引入細(xì)胞時(shí)將產(chǎn)生發(fā)射體分子的核酸或病毒)。表達(dá)載體可以存在于染色體外或被整合到細(xì)胞基因組內(nèi)。偶聯(lián)抗原/標(biāo)簽一個(gè)或多個(gè)抗原或標(biāo)簽可以被加入(此處也稱作"偶聯(lián)到，，)提供已知抗原表位的分子中。例如，一個(gè)或多個(gè)抗原可以與寡核苷酸偶聯(lián)以產(chǎn)生具有已知抗原表位的抗原偶聯(lián)寡核苷酸?？乖悸?lián)分子可以包括一個(gè)抗原或多個(gè)相同或不同的抗原。例如，但不限于，與;f企測的分子偶聯(lián)的抗原或標(biāo)簽包括如毛地黃毒苷、地高辛、膽堿磷酸、熒光素或其它熒光基團(tuán)和生物素的小抗原，和如HIS、VSV-G、FLAG和C(AAKK)多聚體的肽(如Corey,J.Am.Chem.Soc.，(1995)117:9373-4中所述)。寡核苷酸除了常規(guī)的DNA和RNA探針外，各種修飾核酸已顯示以序列特異性的方式與靶核酸序列雜交。這些包括肽核酸(PNA)(Nielsen等，(1991)Science254:1497-1500)、雙PNA(Griffith等，(1995)J.Am.Chem.Soc117:831-832)、尾夾PNA(Bentin(2003)Biochemistry42:13987-13995)、PD環(huán)(Bukanov等，(1998)PNAS95:5516-5520)、包含假互補(bǔ)堿基的PNA(Lohse等，(1999)PNAS96(21)11804-11808)、或鎖核酸(Braasch和Corey(2001)Chem.Biol.8:1-7)。各種各樣的這些修飾核酸已顯示在雜交特性、穩(wěn)定性、親和性和特異性方面不同，并且能夠代替常規(guī)的DNA寡核苷酸使用(由Beck和Nielsen,在ArtificialDNA:MethodsandApplications中討論，pp.91-114，CRCPress,Y.E.Khudyakov和H.A.Fields編輯)。陽離子蛋白、肽或DNA結(jié)合蛋白的連接已顯示改善了雜交動(dòng)力學(xué)(Corey(1995)J.Am.Chem.Soc117:9373-9374;Zhang等，(2000)Nuc.Ac.Res.27(17)3332-3338)。通過添加輔助寡核苷酸，已顯示改善寡核苷酸的結(jié)合(O'Meara等，(1998)Anal.Biochem.225:195-203;Barken等,Biotechniques(2004)3836:124-132)。通過添加未標(biāo)記的發(fā)夾竟?fàn)幪结樋梢愿纳铺禺愋?Huang等，(2002)NucleicAc.Res.30:(12)e55)。與目標(biāo)雜交后，去除未結(jié)合的寡核苷酸對于核酸序列檢測不是必須的，但可能是可取的。可以根據(jù)所用探針的具體化學(xué)性質(zhì)使用包括粒度篩析、疏水相互作用或離子交換的各種常規(guī)色譜技術(shù)去除未結(jié)合的標(biāo)記寡核苷酸。其它核酸結(jié)合分子寡核苷酸不是唯一的能夠鑒定特異性核酸序列的分子。蛋白質(zhì)也能夠進(jìn)行這種辨別，并且能夠在發(fā)射體細(xì)胞的表面上表達(dá)，重組地連附于結(jié)合時(shí)引發(fā)鈣離子反應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)域。例如，其包括連接于抗體的Fc部分的核酸結(jié)合蛋白。核酸結(jié)合蛋白在發(fā)射體細(xì)胞表面上的表達(dá)避免了在寡核苷酸雜交前必須變性雙鏈核酸，并且另外，系統(tǒng)產(chǎn)生所有必須的組分不需要外源合成的寡核苷酸?？赡艿男蛄刑禺愋訢NA結(jié)合蛋白包括(1)DNA限制性內(nèi)切酶(優(yōu)選具有去除或滅活的DNA切割催化位點(diǎn)，如L.F.Dorner和I.Schildkraut(1994)Nucl.AcidsRes.22,1068-1074);(2)轉(zhuǎn)錄因子或其它特異性DNA-或RNA-結(jié)合蛋白，尤其那些識別關(guān)注的病原體或生物體中的獨(dú)特DNA或RNA序列的(如，HIVTAT轉(zhuǎn)錄因子C.Brigati等(2003)FEMSMicrobiologyLetters220，57-65;痘病毒轉(zhuǎn)錄因子S.S.Broyles(2003)JournalofGeneralVirology84,2293-2303)。具有這種受體的發(fā)射體細(xì)胞可被設(shè)計(jì)為在具有特定重復(fù)序列或可選擇地兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)特序列的耙DNA/RNA上交聯(lián)。捕獲寡核苷酸盡管不是檢測所必須的，但是在可沉降的或固體載體上捕獲耙核酸序列可以改善試驗(yàn)靈敏度。例如使用與鏈霉親和素包被的聚苯乙烯或順磁性微球連接的生物素標(biāo)記的捕獲寡核苷酸可以捕獲單鏈DNA靶?？梢酝ㄟ^離心或暴露于磁場(在適當(dāng)?shù)那闆r下)將捕獲的材料與未結(jié)合物質(zhì)分離。在將寡核苷酸連接于微球中使用中間體結(jié)合反應(yīng)(親和素-生物素)可能不是必須的，可以使用將寡核苦酸連接于固體載體的任何相互作用，包括直接偶聯(lián)。此外，可以使用任何捕獲寡核苷酸能夠連接的固體載體，其可以為其中特異性捕獲的寡核苷酸被置于陣列上特定位置的二維陣列形式?？蛇x擇地，靶核酸序列可以以非特異性方式被捕獲(如，離子交換樹脂、沉淀、組蛋白或精蛋白結(jié)合)。目標(biāo)捕獲也濃縮靶核酸序列和/或去除試驗(yàn)干擾物。多價(jià)發(fā)射體細(xì)胞激發(fā)取決于抗原對發(fā)射體細(xì)胞表現(xiàn)為多價(jià)。通常，這可以以至少兩種途徑完成。首先，多份的抗原可以被連于目標(biāo)分子，例如，將多個(gè)抗原偶聯(lián)的寡核苷酸與靶核酸序列雜交。第二，各具有被連接的單個(gè)抗原的幾個(gè)靶核酸序列副本可以互相連接，或者被結(jié)合在相互接近的位置(如附于微球上)。在該例子中，單個(gè)的靶核酸序列不是多價(jià)的，但具有連接的多份靶核酸序列的微球?qū)⒊蔬f多價(jià)抗原。反應(yīng)室適于本發(fā)明使用的反應(yīng)室可以為任何發(fā)射體細(xì)胞和候選顆?？梢曰ハ嗷旌喜⒔佑|的基質(zhì)或容器。在一個(gè)實(shí)施方式中，反應(yīng)容器為離心管(如微離心或埃彭道夫管)。如此處所述，離心是尤其適合的先將候選顆?；虬l(fā)射體細(xì)胞形成團(tuán)粒，然后再向先形成的團(tuán)粒驅(qū)入其它物質(zhì)的方法。為了進(jìn)一步促進(jìn)顆粒和細(xì)胞形成團(tuán)粒，管的側(cè)壁可以被涂覆如牛血清白蛋白的非粘性載體蛋白質(zhì)，以防止發(fā)射體細(xì)胞粘附于側(cè)壁，并且管的底部可以被涂覆聚-L-賴氨酸，以幫助確保目標(biāo)顆粒保持粘附于管底部。其它的防止或促進(jìn)細(xì)胞粘附的蛋白質(zhì)或分子是細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中已知的，并且適于在本發(fā)明中使用。具有特定的樣品孔幾何形式的離心管可以提供利用離心增加發(fā)射體細(xì)胞與難以沉淀的顆粒的相互作用、以及降低定制旋轉(zhuǎn)順序的需40求的另外的實(shí)施方式。在該實(shí)施方式中，待檢測的含樣品的顆粒被置于其中樣品室的最大寬度幾乎等于發(fā)射體細(xì)胞的直徑的管內(nèi)。在樣品上覆蓋濃縮的發(fā)射體細(xì)胞懸浮液、隨后離心使大量緊密疊壓的發(fā)射體細(xì)胞通過較小的顆粒，同時(shí)形成的幾何形式增加了發(fā)射體細(xì)胞抗體與顆粒相互作用的可能性。細(xì)胞相關(guān)的抗體與顆粒的結(jié)合捕獲了沉淀不足的顆粒，并且與發(fā)射體細(xì)胞一起快速將其拖至管底，從而通過光放大設(shè)備檢測所得的光。在另一實(shí)施方式中，反應(yīng)室為二維陣列的孔，比如如附圖所示的微量滴定板，或沿帶設(shè)置的點(diǎn)或孔。這些設(shè)置允許多個(gè)樣品和/或多個(gè)目標(biāo)顆粒的多重檢測。對于候選顆粒和/或發(fā)射體細(xì)胞的自動(dòng)輸送，反應(yīng)室或樣品收集器和發(fā)射體細(xì)胞庫的位置可在至少兩維平面內(nèi)設(shè)置。也可以使用如上所述用于離心管的粘性或非粘性涂層處理陣列的孔，以促進(jìn)發(fā)射體細(xì)胞和候選顆粒之間的接觸。樣品收集器可以使用不同設(shè)備收集如空氣中的樣品。一般，氣體采樣設(shè)備具有收集室，所述收集室含有空氣或氣體從其中穿過或從其旁邊經(jīng)過的液體、或含有當(dāng)空氣或氣體通過濾器時(shí)捕獲微粒(如目標(biāo)顆粒)的多孔濾器。對于含液體的收集室，收集的液體可以被離心或做其它處理以從液體中分離顆粒。然后，在反應(yīng)室中沉淀這些一皮分離的顆粒。對于含濾器(硝化纖維)的收集室，濾器或?yàn)V器的部分可以起反應(yīng)室作用?？蛇x擇地，可以從濾器洗脫顆粒，或者，濾器可以被溶解或另外與顆粒分離。濾器收集室也可以適于從流經(jīng)濾器的液體(如供水樣品或腦脊液)收集顆粒。此外，如上所述，可以離心液體樣品，以去除液體中出現(xiàn)的任何微粒物質(zhì)。各種取樣器是已知的，并且對本發(fā)明的使用是可行的。參見銷售SKCBioSampler⑧和其它取樣設(shè)備的SKC，Inc.公司的目錄。其它空氣取樣器可以被使用。例如，可選擇的設(shè)備為氣體-O-細(xì)胞(Air-O-Cell)取樣盒(SKC，Inc.)。在該設(shè)備中，空氣顆粒被加速，并且使其與直接適于各種染色程序和顯微檢測的粘性載玻片沖撞?？梢栽谝阎獮樽矒羧悠鞯脑O(shè)備中利用慣性分離收集氣溶膠微粒。將含待收集的微粒的氣流從關(guān)注的環(huán)境吸至撞擊取樣器中，在此處，氣流直接指向用于沖擊的表面。通過撞擊取樣器中的適當(dāng)?shù)膸缀螀?shù)和流速，具有足夠慣性的顆粒不會(huì)跟隨流線流動(dòng)，而是沖擊在表面上。沖擊表面的顆粒的主要部分通過靜電和/或范德瓦耳斯相互作用粘附，并且因而被收集和濃縮。這樣，使用各種可獲得的試驗(yàn)技術(shù)(包括此處的設(shè)備和方法)可以收集用于檢測的含蛋白質(zhì)(包括毒素)、病毒、細(xì)菌(生長的或孢子形式)、寄生蟲、花粉和其它可檢測的物質(zhì)的氣溶膠顆粒?？諝庾矒羧悠饔糜谏镌囼?yàn)的干樣品收集通過減少或;肖除流體消耗和轉(zhuǎn)移機(jī)制從而提供了超過常規(guī)氣體-液體樣品收集的一般優(yōu)點(diǎn)，減少試驗(yàn)成本和簡化自動(dòng)操作。此處的設(shè)備和方法的特別優(yōu)點(diǎn)之一為使用干式?jīng)_擊的收集確保了此處的設(shè)備和方法加入感應(yīng)細(xì)胞之前，所有的收集樣品定位在表面上，而無論各分析物顆粒的大小。這樣實(shí)現(xiàn)了所有分析物的定位，而無論其在液體中的沉降系數(shù)，從而使此處的設(shè)備和方法的靈敏度最大，且通過去除耗時(shí)步驟而極大地加快了試^r的實(shí)施。任何保留其上沖擊的顆粒的一部分、并且與隨后生物試驗(yàn)兼容的表面適于作為收集表面。適合的材料包括生物相容性金屬、塑料、玻璃、晶體、氣凝膠、水凝膠、紙等。這些材料的尤其有用的構(gòu)造包括微離心試管、在高通量篩選中使用的多孔板、連續(xù)帶、濾器、側(cè)向流免疫試驗(yàn)的偶聯(lián)釋放墊等。通過對收集表面的修飾可以增加收集效率，修飾包括添加促進(jìn)生物顆粒粘附的涂覆物(這些涂覆物本質(zhì)上可以為化學(xué)的或生物化學(xué)的，如多熔素)；增加表面粗糙度，以增加用于收集的表面積；以及促進(jìn)顆粒在表面上的限定區(qū)域內(nèi)沉積的特定表面幾何形式。此外，可以通過調(diào)控收集表面和吸入顆粒上的靜電荷、從而產(chǎn)生附加引力實(shí)現(xiàn)收集效率的進(jìn)一步提高?？梢酝ㄟ^在收集器上游使用氣體-氣體濃縮器以增加在收集面上被沖擊的空氣樣品的單位顆粒數(shù)目而對干式撞擊進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)。這可以顯著降低收集足夠數(shù)目的氣溶膠顆粒以為檢測器提供可靠結(jié)果所需的時(shí)間。在該收集概念的一個(gè)實(shí)施例中，圖23所述的沖擊器已被設(shè)計(jì)為在市售可得的塑料管的底部收集氣溶膠樣品。噴嘴向下突出在管內(nèi)，并且出口按管內(nèi)表面的曲率半徑定位。這種定位增加了顆粒沖擊在設(shè)備感應(yīng)細(xì)胞最可能與其接觸的管底部上的可能性。一旦完成收集，含設(shè)備感應(yīng)細(xì)胞的單液滴被直接加入含收集的氣溶膠顆粒的管內(nèi)，旋轉(zhuǎn)5秒以加速細(xì)胞輸送至管表面，并且使用光子檢測器(如PMT、CCD、光電二極管等)檢測發(fā)射的光。使用該設(shè)備，可以從氣溶膠中收集千細(xì)菌孢子、并且通過光電設(shè)備在不到一分鐘的時(shí)間內(nèi)直接檢測。可以使用多個(gè)用于收集樣品的管和進(jìn)行后續(xù)分析的自動(dòng)系統(tǒng)實(shí)施該方法。系統(tǒng)如何能夠進(jìn)行至少10個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的例子如圖4、6、9、12和15所示。通過實(shí)施一種其中能夠在單個(gè)管中尋找多個(gè)分析物的多項(xiàng)測試的途徑(多重的)，可以使單個(gè)試驗(yàn)周期可檢測物質(zhì)的數(shù)目大于可用管的數(shù)目。這可以通過建立表達(dá)多個(gè)具有不同分析物親和性的受體的單獨(dú)光電檢測設(shè)備細(xì)胞系、或者通過在單個(gè)試管中組合具有不同特異性的多個(gè)細(xì)胞系而實(shí)現(xiàn)。圖4為集成生物氣溶膠警告感應(yīng)器(BAWS)/光電感應(yīng)器系統(tǒng)的示意圖。BAWS觸發(fā)模塊被用于初步檢測如預(yù)定粒度范圍的顆粒的存在。如果檢測到符合規(guī)定的顆粒，則BAWS觸發(fā)空氣-空氣濃縮器從而經(jīng)千式撞擊取樣器模塊使特定粒度范圍內(nèi)的顆粒在孔(如反應(yīng)室、管)內(nèi)被收集、并沉積。所述干式撞擊取樣器模塊允許樣品收集、并且與用于在反應(yīng)室內(nèi)(如管)進(jìn)行細(xì)胞(如發(fā)射體細(xì)胞)輸送的注射模塊連通。運(yùn)輸模塊被用于將反應(yīng)室裝置(具有一個(gè)或多個(gè)室或管)轉(zhuǎn)移至用于沉淀或混合顆粒樣品和細(xì)胞的離心模塊。所述離心模塊可以、但非必須與用于檢測光發(fā)射的光/PMT組件連通?？刂破髂K對于控制系統(tǒng)的操作是有用的。圖6顯示干式撞擊取樣器模塊概念的實(shí)施例。在該實(shí)施例中，說明了單(如樣機(jī)系統(tǒng))以及多通道設(shè)備，所述設(shè)備包括獨(dú)立樣品管(如PCR管)和管載體，其與從測試樣品收集顆粒的空氣-空氣濃縮器連通。圖9顯示了可以為自動(dòng)化的細(xì)胞輸送的實(shí)施例。感應(yīng)細(xì)胞(如發(fā)射體細(xì)胞)通過注射器和注射泵裝置(其可以包括吸移管管理器和其它輸送設(shè)備)被引入系統(tǒng)。該類型的裝置允許向顆粒樣品(如反應(yīng)室(如管)中的樣品)中多重、同時(shí)引入感應(yīng)細(xì)胞。圖12顯示了用于旋轉(zhuǎn)顆粒樣品或細(xì)胞樣品的離心模塊概念的實(shí)施例。具有樣品管的載體經(jīng)負(fù)載裝置被引入適于接收所述載體的轉(zhuǎn)子裝置。所述轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)樣品。轉(zhuǎn)子裝置與用于信號收集(如光子發(fā)射)的光學(xué)才莫塊連通，并且分度馬達(dá)(indexedmotor)可以:帔用于使樣品室與檢測器(如光學(xué)組件)對準(zhǔn)。圖15顯示了光學(xué)模塊的實(shí)施例。根據(jù)確切構(gòu)造的不同，該模塊允許多個(gè)同時(shí)測試的樣品(如在反應(yīng)室、試管內(nèi))。載體和其內(nèi)的管被引入所述光學(xué)模塊，從而其與透鏡裝置(如整體反射鏡、透鏡)(如果需要)連通，并最終與光檢測器(如PMT)連通。所述PMT產(chǎn)生隨后被發(fā)送至用于處理和顯示的處理器的信號。圖21說明了集成干式撞擊取樣器/光電感應(yīng)器。在該感應(yīng)器內(nèi)，上述模塊與支撐30個(gè)可輸送至帶驅(qū)動(dòng)的運(yùn)輸傳輸模塊的載體的卡盒成線性排列安裝。該輸送模塊將試驗(yàn)管順序地從收集器輸送至細(xì)胞輸送模塊、再至離心模塊、最終在完成光檢測后輸送至確認(rèn)樣品儲(chǔ)存模塊。該集成感應(yīng)器的總大小約為54英寸寬、33英寸高、22英寸深。現(xiàn)實(shí)世界中的樣品可能包含抑制試驗(yàn)(假陰性)或在無特異性抗原時(shí)引起反應(yīng)(假陽性)的物質(zhì)。在許多情況下，可以在試驗(yàn)前處理這些樣品以去除這些物質(zhì)。例如，如清潔劑或血清因子的可溶性物質(zhì)可以通過預(yù)離心步驟被去除，在預(yù)離心步驟中抗原物質(zhì)被集中到試管底部，并且用測試培養(yǎng)基(PortalShield樣品)替代液體。通過使用具有允許抗原物質(zhì)通過、但截留污染物(內(nèi)燃機(jī)或煙灰樣品)的孔徑(35jim)的市售濾器進(jìn)行過濾可以從樣品中去除不溶性大顆粒物質(zhì)。通過注射濾器可以快速處理樣品，這對于總的試驗(yàn)時(shí)間僅增加了幾分鐘。樣本定位作為樣品收集器或反應(yīng)室的部分，可以使用不同裝置(除離心機(jī)外)促進(jìn)發(fā)射體細(xì)胞和候選顆粒之間的接觸。例如，在生物電子設(shè)備中電泳、等電子聚焦、雙向電泳、磁標(biāo)記顆粒等的使用可以整合到本發(fā)明的系統(tǒng)中。參見，如美國專利No.6,017，696和其它轉(zhuǎn)讓給NanogenInc.的其它專利；Goater等，Parasitology117:S177-189,1998;和美國專利No.5,512,439和4,910,148以及其它轉(zhuǎn)讓給DynalAS的專利。粒-蛋白質(zhì)/毒素、病毒、細(xì)菌、寄生蟲、核酸等)的水性樣品與部分含發(fā)射體細(xì)胞的培養(yǎng)基導(dǎo)致引起光子發(fā)射率短暫增加的顆粒-細(xì)胞接特征性反應(yīng)，以及混合發(fā)生所經(jīng)時(shí)間(混合時(shí)間)和在混合后顆粒和細(xì)胞發(fā)生接觸所需的典型時(shí)間(擴(kuò)散時(shí)間)。因?yàn)榧词乖跓o目標(biāo)顆粒存在時(shí)也存在檢測的光子的背景發(fā)射率(例如，背景細(xì)胞發(fā)射和在光子檢測器及其電子設(shè)備中的熱噪聲)，由單個(gè)目標(biāo)-細(xì)胞相互作用發(fā)射的光子可能難以與該背景區(qū)分。為了有用地形成信號，被檢測到的光子必須比背景顯著提高。對于給定樣品，當(dāng)混合時(shí)間和擴(kuò)散時(shí)間最小化時(shí)，該比率被最大化。樣品中出現(xiàn)目標(biāo)顆粒的其它可能的信號包括在某一時(shí)間段內(nèi)檢測到的光子的總數(shù)目超出單獨(dú)背景的增加、檢測到的光子的統(tǒng)計(jì)學(xué)的變化、或者檢測到的光子的光譜性質(zhì)的變化。通過降低混合后顆粒和細(xì)胞之間的平均距離可以使擴(kuò)散時(shí)間最小。這可以通過將顆粒和/或細(xì)胞定位至較大的混合容積中的小體積(通常為層)內(nèi)而實(shí)現(xiàn)。然而，定位顆粒和/或細(xì)胞的時(shí)間可能長于細(xì)胞的特征性反應(yīng)時(shí)間。在長時(shí)間的定位過程中，顆粒和細(xì)胞之間的混合通過增加發(fā)射之間的平均時(shí)間可能產(chǎn)生較低的光子發(fā)射率，并且因而45產(chǎn)生較低的信號。為了避免此種情況，顆粒和細(xì)胞之一或兩者應(yīng)分離定位，而使它們之間的接觸最少。這種定位也能導(dǎo)致減少混合時(shí)間。通常，使顆?；蚣?xì)胞運(yùn)動(dòng)的手^:包括以下沉降(通過重力或離心)；流體流動(dòng)(外力的或?qū)α鞯?；電力(電泳或雙向電泳)；》茲力(使用磁性微球)；以及聲學(xué)/超聲(駐波或行波)。定位需要移動(dòng)與屏障(barrier)結(jié)合的顆粒和/或細(xì)胞的手段，例如，所述屏障為收集顆粒和/或細(xì)胞的位置，如通道或容器的固體表面、濾器的表面、或圍繞電場最低點(diǎn)的潛在能障。例子包括沉降(將細(xì)胞定位在室的下表面)；空氣沖擊(被沖擊的顆粒粘附或定位于收集面上)；過濾(在濾器表面上或體內(nèi)部收集顆粒或細(xì)胞)；親和性捕獲(通過特異性或非特異性結(jié)合相互作用可以定位顆粒或細(xì)胞)；磁性捕獲(通過磁力保持磁性微球緊靠固體表面、濾器表面、或在濾器體內(nèi)；微球可能具有或可能沒有促進(jìn)顆?；蚣?xì)胞的粘附的表面化學(xué)性質(zhì))；電泳(僅帶電顆粒；在電極表面上的收集)；以及雙向電泳(正顆?；蚣?xì)胞在電極表面上的收集；負(fù)收集到最小場區(qū)域內(nèi))。顆粒和細(xì)胞的定位和混合可以通過結(jié)合上述和其它方法實(shí)現(xiàn)。在下表中，提供了各種定位/檢測器結(jié)合的例子。特定的代表性例子說明了二維定位顆粒或細(xì)胞的方法，如果使用光子檢測器(包括CCD)的陣列，而不是單光子檢測器(如PMT)，則所述方法使不同顆粒之間的靈敏度和分辨性得到改進(jìn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>定4立實(shí)施例在以下各實(shí)施例中，除非另行聲明，則假設(shè)樣品為可能含有目標(biāo)顆粒的(盡管以下描述將假定存在顆粒)與短期細(xì)胞生命和功能相容的等分水性溶液?？梢杂森h(huán)境、臨床、空氣-液體、洗-4式或其它樣品獲得水性樣品。可以由驅(qū)動(dòng)的氣流(氣體取樣器或表面撿拾器)、靜電捕獲、或者沉淀的氣源顆粒獲得氣體樣品。所稱的細(xì)胞應(yīng)理解為在與其生命和功能相容的水性培養(yǎng)基中的發(fā)射體細(xì)胞。使顆粒與細(xì)胞接觸被假定導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)光子的發(fā)射。單個(gè)或陣列光子檢測器存在于樣品與細(xì)胞在其中混合的室之外，并且因而可以在所述空間之外或之內(nèi)存在為了提高發(fā)射光子的捕獲和檢測而設(shè)置的附加光學(xué)元件。所述室被假定為部分或整體透明的，或具有另外的使得發(fā)射光子到達(dá)檢測器的裝置。在實(shí)施例中提供本發(fā)明的特定實(shí)施方式的進(jìn)一步描述。離心樣品可以在室(chamber)內(nèi)離心足以沉降顆粒的時(shí)間。纟田月包可以被引入所述室內(nèi)不干擾顆粒，并且短暫離心以使其沉降在顆粒上。光子檢測可以在旋轉(zhuǎn)過程中、或更典型地在旋轉(zhuǎn)之后發(fā)生。親和捕獲(表面捕獲)樣品可以被引入微離心管、多孔盤、過濾裝置、或其它與樣品接結(jié)合和留置樣品中可能出現(xiàn)的顆粒的適當(dāng)裝置?？梢酝ㄟ^靜電/離子交換相互作用、疏水相互作用、親水相互作用等促進(jìn)非特異性結(jié)合。可以通過將與顆粒(如抗體、受體、糖蛋白、蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、寡核苷酸等)上的基底結(jié)合的組分固定至表面、或者通過固定顆粒(小分子、肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物等)的表面上被受體結(jié)合的組分促進(jìn)特異性結(jié)合。親和捕獲(至移動(dòng)基底上)與在表面上的親和捕獲類似，但顆粒通過包括此處所描述的這些方法的各種方法結(jié)合至提供使顆?；蚣?xì)胞運(yùn)動(dòng)或定位的額外手段的移動(dòng)基底(聚合物微球、細(xì)胞、帶電分子、磁性微球、細(xì)菌等)。流動(dòng)池發(fā)射體細(xì)胞可以被引入至淺流動(dòng)池，并且使其粘附到底面；可以通過額外流去除非粘附細(xì)胞。樣品被引入，替換大部分的細(xì)胞培養(yǎng)基，并且顆粒可以沉淀在纟皮粘附的細(xì)胞上。由于顆粒*接觸細(xì)月包，從而發(fā)射光子。流動(dòng)池(多細(xì)胞系)與"流動(dòng)池"類似，其具有對不同目標(biāo)顆粒敏感的發(fā)射體細(xì)胞的不同區(qū)域。通過成像檢測器的光子檢測能夠鑒別細(xì)胞被激發(fā)、以及因而判定在樣品中存在目標(biāo)顆粒。流動(dòng)池(磁性微球)其與"流動(dòng)池，，類似。適當(dāng)?shù)拇判晕⑶蚺c樣品混合，以使目標(biāo)顆粒附于微球。這些被粘附的微球可以被引入流動(dòng)池，其中強(qiáng)定位磁場(由于永久磁場或電磁)在被結(jié)合細(xì)胞的上方的表面上捕獲所述微球。可以通過去除磁力和使微球沉淀于細(xì)胞之上、或者移動(dòng)磁力以將微球吸引于細(xì)胞被吸附的表面上而引發(fā)混合。，危動(dòng)〖也(電場)與"流動(dòng)池"類似，其具有細(xì)胞吸附的表面、和與其平行的分隔電極(至少其中之一可以為透明的)。樣品可以加入，替換大部分細(xì)胞培養(yǎng)基?？梢栽陔姌O之間施加適當(dāng)?shù)腄C電壓，并且顆粒通過電泳移至被吸附的細(xì)胞。帶/管吸可能含有目標(biāo)顆粒的氣體樣品可以沖擊在可能為剛性或柔性(如條帶)、多孔或無孔的透明表面上。吸收物質(zhì)或管吸裝置可以連接在沖擊區(qū)周圍或當(dāng)為多孔表面時(shí)在該表面的相對側(cè)上。細(xì)胞可以被置于沖擊區(qū)之上，并且，由于管吸作用，過量培養(yǎng)基將被吸收，從而減少負(fù)載細(xì)胞的培養(yǎng)基的體積和深度，并且使其更接近顆粒。如果管吸材料前的表面是多孔的，則細(xì)胞沉淀于被沖擊顆粒上，或者通過液流額外地纟皮拖向所述顆粒。氣體沖擊可能含有目標(biāo)顆粒的氣體樣品可以被沖入適于離心的(固定的且最初為空的)室中。細(xì)胞可以被引入所述腔室中而不干擾顆粒，并且細(xì)胞被短暫離心，以將其沉淀于顆粒之上。在無旋轉(zhuǎn)時(shí)、或在旋轉(zhuǎn)過程中、或者更典型地在旋轉(zhuǎn)之后，可以發(fā)生光子檢測。過濾設(shè)備/磁性微球包括室和具有適合濾器(Whatman,Mini-UniprepTM或類似)的活塞的改造的無注射過濾設(shè)備可以用能附于所述室的底面的細(xì)胞負(fù)載；未粘附的細(xì)胞可以^f皮洗去。樣品可以與具有適當(dāng)表面親和力的49磁性微球一起被引入所述室。具有插入到濾器的內(nèi)部、并且固定于其背側(cè)附近的適當(dāng)磁體的改進(jìn)活塞可以被插入至所述腔室內(nèi)，直至圈入的氣體通過濾器逸出。該裝置可以被反轉(zhuǎn)，并且(可能在使微球沉淀于濾器表面之上的時(shí)間之后)將所述腔室向下推至活塞上。通過過濾、沉淀和;茲吸引，》茲性微球和顆?？梢苑e聚在濾器表面上。顆?？梢愿接谒龃判晕⑶蚧蛟谄渲斜徊东@。當(dāng)再反轉(zhuǎn)所述設(shè)備時(shí)，顆粒通過磁性微球而保持不與細(xì)胞接近，而所述磁性微球通過活塞內(nèi)的^茲體被控制。移開該磁體，釋力文孩t球和顆粒，所述顆粒越過短距離沉積于細(xì)月包之上。流經(jīng)細(xì)月包可以使一層或多層細(xì)胞沉淀于位于室底部的適當(dāng)濾器或膜的表面上。樣品可以被引入細(xì)胞上方的室，并且施壓(例如通過活塞或外部泵)。當(dāng)樣品流經(jīng)緊密接觸的細(xì)胞時(shí)，顆粒被帶入細(xì)胞的附近范圍內(nèi)，乂人而發(fā)生^妄觸。對流一層或多層細(xì)胞可以被沉淀于位于"細(xì)胞"室底部的適當(dāng)濾器或膜的表面上。樣品可以被置于通過某流動(dòng)通道與位于濾器下方的點(diǎn)的細(xì)胞室連通的分開的"樣品，，室內(nèi)。所述室彼此相對而置，從而，在離心才幾內(nèi)，樣品室更較接近旋轉(zhuǎn)軸；樣品室內(nèi)的流體液面比細(xì)胞室內(nèi)的流體更接近旋轉(zhuǎn)軸。這樣，在離心機(jī)的旋轉(zhuǎn)過程中，流體將在兩個(gè)腔室之間流動(dòng)，以尋求距旋轉(zhuǎn)軸的共同距離。這可以迫使一些樣品向上通過支撐細(xì)胞的濾器、并且經(jīng)過細(xì)胞，細(xì)胞通過向外的離心力抵抗所述液流。當(dāng)樣品流經(jīng)緊密接觸的細(xì)胞時(shí)，顆粒纟皮帶入細(xì)胞的附近范圍內(nèi)，/人而4妻觸。離心管濾器樣品可以被引入具有適當(dāng)粒徑截止值的離心管濾器的濾器筐。在適當(dāng)?shù)碾x心條件下，樣品將被迫使通過濾器，從而在濾器的表面上積累大于濾器的截至粒徑的顆粒。細(xì)胞可以被加入濾器筐，并且短暫離心，以將其帶至濾器表面和顆粒上。50雙向電泳捕捉除了具有在任何表面之上、或探入流動(dòng)池之內(nèi)的適當(dāng)電極外，與"流動(dòng)池"類似。樣品可以通過經(jīng)過電極的連續(xù)流被引入，所述電極可以與外部電源連接、并電驅(qū)動(dòng)。為了適當(dāng)結(jié)合流速、頻率、波形和強(qiáng)度，可以通過負(fù)雙向電泳引導(dǎo)顆粒，并且在細(xì)胞上方的最小電場強(qiáng)度區(qū)域內(nèi)被捕獲。在停止流體、并且改變對電極的電驅(qū)動(dòng)(可能包括在某些電極之間的dc電壓，以產(chǎn)生電泳力)后，顆?？梢猿练e于或(通過電泳或正雙向電泳)纟皮驅(qū)至粘附的細(xì)月包上。4亍波雙向電泳在淺圓柱室內(nèi)，可以在平行面中的一個(gè)或兩個(gè)上制備適當(dāng)?shù)碾姌O(可能透明)，包括用于收集顆粒的中心平面電極、圍繞圓周的電極、和一組螺旋電極(與中心平面電極在同一表面上、或在其相對表面上)。樣品可以被引入所述室，并且在外周和中心電極之間施加dc電壓以通過電泳將顆粒吸引至中心電^i。通過流體的交換，細(xì)月包可以#:引入所述室中。用適當(dāng)?shù)南嘁芶c電壓接通螺旋電極，可以通過行波雙向電泳將細(xì)胞沖至中心，從而其能在顆粒上沉淀?？扇苄阅す芸梢允褂秒婒?qū)動(dòng)溶解金膜在通過離心沉淀定位顆粒的過程中保持目標(biāo)顆粒和發(fā)射體細(xì)胞之間的分隔。顆?？梢员怀恋碛诩?xì)胞上方的膜之上(如圖20所示)，或者通過跨分開的腔(或許嵌入物)的底部的膜保持細(xì)胞不接近所述腔的底部。在任一情況下，在膜通過電激活4皮溶解后，顆粒和細(xì)胞通過沉淀(可能離心);波混合。聲學(xué)/超聲駐波形(sandingwavepattern)的節(jié)點(diǎn)處積累，或通過行波形移動(dòng)。細(xì)胞也可以這樣移動(dòng)，或者通過上述討論的各種方法之一祐:輸送。毒素檢測為了檢測單價(jià)抗原，必須利用兩種通用方案之一誘導(dǎo)表面抗體的交聯(lián)。首先，可以在細(xì)胞表面上表達(dá)兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，從而，兩個(gè)受體分子可以結(jié)合于單一配體。可選擇地，如果配體以表現(xiàn)為多價(jià)的方式纟皮呈現(xiàn)于細(xì)胞，則可以在細(xì)胞表面上表達(dá)一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。以下為使用抗體抗原識別模式的特定例子。首先，在單一細(xì)胞系的表面上可以表達(dá)兩個(gè)抗體，各個(gè)抗體對單獨(dú)分子的不同表位(表位1和2)具有特異性。單分子與雙抗體(一個(gè)抗表位1的抗體和另一個(gè)抗表位2的抗體)的結(jié)合將引發(fā)交聯(lián)和光發(fā)射。更特別地，單B細(xì)胞系被工程化以表達(dá)兩個(gè)獨(dú)立抗體，各個(gè)抗體識別單分子上的不同表位。單體抗原的出現(xiàn)將能夠交聯(lián)表面抗體，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca^的增加和水母發(fā)光蛋白的光發(fā)射。表達(dá)抗鼠疫耶爾森氏菌和土拉熱弗朗西斯氏菌的功能性抗體(除了內(nèi)源表達(dá)的PC抗體外)的細(xì)胞系已被測試(參見實(shí)施例)。這些抗原中的各個(gè)都被該細(xì)胞系獨(dú)立識別，說明兩個(gè)抗體都是功能性的，并且證明發(fā)射體細(xì)胞能夠同時(shí)表達(dá)兩個(gè)功能性抗體。另一個(gè)潛在的問題是光電設(shè)備和方法對不能使用離心力沉淀的抗原的靈敏度。鼠疫耶爾森氏菌Fl抗原在溶液中以低分子量聚合物存在，并且因而在我們的試驗(yàn)中是不沉淀的。然而，表達(dá)抗Fl抗體的B纟田月包能夠一全測5ng/ml的可溶性Fl抗原。這與目前的免疫試-瞼4支術(shù)對比有利，并且表明光電設(shè)備對于可溶性抗原可以是相當(dāng)靈敏的。利用與卵清蛋白偶聯(lián)的磷酸膽堿抗原進(jìn)行互補(bǔ)試驗(yàn)。該小抗原刺激在細(xì)胞表面上交聯(lián)的抗體的能力說明該含多PC表位的低分子量抗原能夠有效地交聯(lián)表面抗體、并且產(chǎn)生鈣內(nèi)流和光發(fā)射。第二種方案可以通過利用離心形式的優(yōu)點(diǎn)提高如上所示的單價(jià)抗原的檢測極限。這種方案利用了其中毒素抗體之一在良性細(xì)菌表面上表達(dá)、且第二抗體在B細(xì)胞表面上表達(dá)的路線?，F(xiàn)在可以通過離心沉淀毒素，再加入表達(dá)第二抗體的B細(xì)胞。因?yàn)槎鄠€(gè)抗原被固定在細(xì)菌的表面上，因此，毒素本質(zhì)上對于B細(xì)胞是多價(jià)的，并且將引發(fā)交聯(lián)事件和光發(fā)射。更具體地，抗單體抗原(如毒素)的表位1的抗體在細(xì)菌的表面上表達(dá)?？扇苄远舅亟Y(jié)合這些抗體，從而用毒素抗原覆52蓋細(xì)菌。在加入表達(dá)抗表位2的抗體的B細(xì)胞之前，通過離心沉淀這些毒素覆蓋的細(xì)菌。B細(xì)胞抗體的交聯(lián)導(dǎo)致水母發(fā)光蛋白的光發(fā)射。關(guān)于該方案的試驗(yàn)結(jié)果證明細(xì)菌表面抗原檢測的可行性、和在加入B細(xì)胞之前沉淀這些細(xì)菌所導(dǎo)致的靈敏度增加。對于任何不易沉淀的抗原都可以使用類似的措施改善其對B細(xì)胞的呈遞。交聯(lián)目標(biāo)顆粒的交聯(lián)可以通過任何已知方法實(shí)現(xiàn)。例如，可以使用一個(gè)或多個(gè)如肽、抗體、化合物、抗體、生物素、鏈霉親和素的中間劑或分子實(shí)現(xiàn)交聯(lián)，此外，可以通過共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合交聯(lián)。用于交聯(lián)的方法也包括利用本領(lǐng)域已知的配體、抗體或化學(xué)官能團(tuán)沉淀或粘附于固相。多重測試以下為B細(xì)胞如何可以被用于增加可檢測抗原的數(shù)目而不增加檢測通道(管等)的數(shù)目的說明。檢測多個(gè)分析物的最簡單方法是每個(gè)檢測通道i"吏用單細(xì)胞型、以及通過增加纟全測通道的數(shù)目增加細(xì)月包測試的數(shù)目。這對于小數(shù)目的試驗(yàn)是可接受的，但是，隨著加入分析物數(shù)目的增加，過程變得更加復(fù)雜和需要更多的資源。然而，如果不同B細(xì)胞系被混合到一起，在僅5-通道系統(tǒng)內(nèi)可能進(jìn)行多達(dá)31個(gè)具有陰性對照的測試。作為例子，如果具有單通道，則至多能檢測單個(gè)B細(xì)胞測試。然而，如果具有雙通道，則能檢測3個(gè)單獨(dú)的試驗(yàn)，其中各個(gè)通道含有3種獨(dú)立B細(xì)胞系的兩種等量混合物例如，如有具有3種B細(xì)胞系A(chǔ)、B、C并且將其在兩個(gè)通道內(nèi)混合，因此，通道1:A、B通道2:B、C然后，有三種陽性讀出可能性。<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>是是暗示僅B存在(或者多于一種抗原存在，目前我們認(rèn)為這是不可能的)類似地，如果具有3個(gè)通道，則可以通過將四種細(xì)胞系的組合混合在一起檢測7個(gè)獨(dú)立測試。(以下為方便說明，其中單個(gè)抗原物質(zhì)的細(xì)胞系通過與細(xì)胞系的數(shù)目對應(yīng)的字母被標(biāo)記A，并且記下通道號以說明用于陽性4企測各個(gè)單獨(dú)抗原物質(zhì)需要什么通道，如下123:F-意。未著通道l、2和3必須全部為陽性記錄以確i人抗原物質(zhì)F)。通道1通道2通道3A,B,G，F(xiàn)B，C,E,FC，D,G，F(xiàn)1:A12:B123:F2:E13:G3:D23:C假定所有試驗(yàn)都是以等比例混合，表達(dá)簡單描述通過給定數(shù)目的通道可以讀耳又的獨(dú)立試^驗(yàn)數(shù)的關(guān)系的7>式為弁細(xì)胞試驗(yàn)二211-1其中n為通道的數(shù)目，并且由2(n—"得出需要在各通道內(nèi)混合的細(xì)胞測試的數(shù)目。因此，為了將16種不同B細(xì)胞系混合到一起，需要5個(gè)通道以檢測31個(gè)不同測試。事實(shí)上，對于10-通道系統(tǒng)設(shè)計(jì)可被用于同時(shí)具有陰性對照的31個(gè)單獨(dú)抗原物質(zhì)提供ID(5-通道陽性ID、5-通道陰性對照)。對于4-通道系統(tǒng)(15個(gè)不同測試)的通道混合物和陽性4企測關(guān)聯(lián)顯示如下通道1通道2通道3通道4A、B、G、F、I、K、L、M1:A2:N3:0B、C、H、IJ、L、M、N23:C24:H34:DF、C、D、IJ、K、M、0123:1234:J134:KD、E、G、HJ、K、L、M1234:M54<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>無需進(jìn)一步的詳細(xì)描述，可以認(rèn)為基于上述公開內(nèi)容和以下實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以將本發(fā)明利用至其最充分程度。以下實(shí)施例應(yīng)被理解為僅說明本領(lǐng)域技術(shù)人員如何能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明，而不不以任何方式限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例圖1為顯示本發(fā)明的通用細(xì)胞組分的示意圖表。含發(fā)射體分子(此處為水母發(fā)光蛋白)的細(xì)胞(此處為B細(xì)胞)在其表面上具有抗體。這些抗體對如生物戰(zhàn)劑的目標(biāo)顆粒上的抗原是特異性的。目標(biāo)顆粒與B細(xì)胞上的抗體的結(jié)合使細(xì)胞表面上的兩個(gè)或多個(gè)抗體靠攏，引起導(dǎo)致《丐從細(xì)胞內(nèi)庫釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。這種細(xì)胞質(zhì)4丐濃度的增加導(dǎo)致水母發(fā)光蛋白發(fā)射光子。然后，光子被捕獲，并且通過如CCD的光倍增設(shè)備記錄。這樣，使用具有功能性表面抗體、且含有對增加的釣離子濃度響應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)發(fā)射體分子的細(xì)胞可以實(shí)施細(xì)胞生物傳感器。這種基于細(xì)胞的檢測系統(tǒng)提供了對任何目標(biāo)顆粒上的任何抗原的快速、靈敏、特異性、精準(zhǔn)和靈活的檢測。關(guān)于靈活性，該系統(tǒng)可以被修改以4巴任何顆?；蝾w粒組作為目標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施例中，單發(fā)射體細(xì)胞可以包含多個(gè)抗體類型，各個(gè)類型對于目標(biāo)顆粒的非重疊組是特異性的。然后，該單發(fā)射體細(xì)胞可以被用于一次鑒定一類目標(biāo)顆粒物質(zhì)。在又一實(shí)施例中，反應(yīng)室可以包含兩種類型的發(fā)射體細(xì)胞。一種類型的發(fā)射體細(xì)胞包含對一類目標(biāo)顆粒(如細(xì)菌)特異性的抗體，并且響應(yīng)于該類的任何成員的接觸發(fā)出第一波長的光子。第二類型的發(fā)射體細(xì)胞包含對該類內(nèi)的特定種(如鼠疫耶爾森氏菌)特異性的抗體，并且響應(yīng)于與該種的接觸發(fā)射不同于第一波長的第二波長光子。這種設(shè)置通過降低或去除假陽性信號而提供了極高的精確性。僅當(dāng)?shù)谝缓偷诙ㄩL的光子被檢測到時(shí)，陽性事件才被記錄。這種發(fā)射體細(xì)胞特異性的嵌套可以被擴(kuò)展到兩級以上，只要是降低或去除假陽性信號需要的。圖2為用于本發(fā)明的一般構(gòu)造和使用環(huán)境的示意圖表。圖3為在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中使用的分子生物學(xué)概念的示意圖表。在該實(shí)施例中，表達(dá)發(fā)射體分子(如水母發(fā)光蛋白)、但不表達(dá)抗體的通用B細(xì)胞系是產(chǎn)生能表達(dá)對任何抗原特異性的任何抗體的B細(xì)胞的基礎(chǔ)?？贵w表達(dá)載體被引入通用B細(xì)胞內(nèi)、對于表達(dá)載體的存在進(jìn)行選擇、并且進(jìn)行擴(kuò)增以用于本發(fā)明的檢測系統(tǒng)。使用這種策略，連同pDisply和VKExpress(在上述"抗體，，部分描述)，目標(biāo)-特異性發(fā)射體細(xì)胞被產(chǎn)生用于各種目標(biāo)物質(zhì)。對口蹄疫病毒(FMDV)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)病毒、鼠疫耶爾森氏菌、土拉熱弗朗西斯氏菌、布魯氏菌某些種(5n/ce〃aspp.)、霍亂弧菌的Ol和0139系、以及正痘(orthopox)病毒特異性的發(fā)射體細(xì)胞已被制備。從USDA獲得FMDA抗體可變區(qū)的cDNA和序列。從NMRC的研究人員獲得鼠疫耶爾森氏菌、土拉熱弗朗西斯氏菌、布魯氏菌某些種、霍亂弧菌的01和0139系的cDNA和序列。分別由從CDC和USAMRIID獲得的雜交瘤克隆得到VEE和正痘抗體的可變區(qū)。口蹄疫病毒(FMDV)、鼠疫耶爾森氏菌、土拉熱弗朗西斯氏菌和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)分別引起口蹄疫、瘟疫、土拉菌病和腦炎。利用多篇公開文章中描述的引物的組合進(jìn)行從雜交瘤的克隆。因?yàn)榍蛐窝挎邨U菌(Bac/〃仏？g/o^g/Z)被某些軍事機(jī)構(gòu)用作生物戰(zhàn)劑檢測系統(tǒng)的戰(zhàn)地試驗(yàn)中的測試生物，因此，正在制備對球形芽孢桿菌特異性的發(fā)射體細(xì)胞。圖5包括顯示在多個(gè)克隆的FMDV特異性發(fā)射體細(xì)胞與活的FMDV目標(biāo)物質(zhì)接觸時(shí)光發(fā)射反應(yīng)的曲線圖。在各種情況下，在目標(biāo)顆粒與細(xì)胞之間接觸后的約2030秒內(nèi)，發(fā)射體細(xì)胞發(fā)射光子。圖中數(shù)據(jù)顯示當(dāng)未預(yù)想與發(fā)射體細(xì)胞結(jié)合的突變FMDV(在病毒的外殼蛋白中具有單氨基酸突變)與發(fā)射體細(xì)胞克隆接觸時(shí)無發(fā)射。陰性對照支持檢測系統(tǒng)本身的高特異性。離心機(jī)和光電倍增管(PMT)布置的各種配置可以包含在本發(fā)明的系統(tǒng)內(nèi)。所述布置包括由擺動(dòng)裝置(swingingharness)旋轉(zhuǎn)樣品微離心管的轉(zhuǎn)子(馬達(dá))、并且包括處于固定位置的平衡管。在底部顯示PMT，向上朝向靜止的樣品管的底端。在小于發(fā)射體細(xì)胞的目標(biāo)顆粒的典型試驗(yàn)中，含顆粒的液體樣品被置于樣品管內(nèi)，并且在足以使大部分顆粒沉淀于管的底部的條件下離心(如對于土拉熱弗朗西斯氏菌以5600xg離心60秒)。然后，將發(fā)射體細(xì)胞的懸浮液層置于管內(nèi)的樣品上(從而不干擾沉淀的顆粒)、并且短暫離心，以使細(xì)胞成團(tuán)與目標(biāo)顆粒接觸。如果在候選顆粒中出現(xiàn)目標(biāo)顆粒，則從細(xì)胞發(fā)射特定波長的光子，并且由PMT捕獲和記錄。在特定實(shí)施方式中，PMT可以為與斯坦福研究系統(tǒng)SR400雙通道門控光子計(jì)數(shù)器接口的HamamatsuHC125-08PMT。離心機(jī)可以為具有吊斗配置的Sapphire17轉(zhuǎn)、18.5AWG、5amp馬達(dá)。離心管(反應(yīng)室)可以因促進(jìn)候選顆粒和發(fā)射體細(xì)胞之間的接觸的需要而改變或升級。在圖20所示的一個(gè)實(shí)施方式中，管在管底部具有容納預(yù)先負(fù)載的發(fā)射體細(xì)胞的封閉隔間。該隔間通過可溶性金正極膜與管的其余部分分隔。在操作中，相同的含候選顆粒的顆粒被沉積于管內(nèi)，并且離心以在膜處濃縮候選顆粒、然后溶解膜，并且短暫離心試管，以將顆粒與發(fā)射體細(xì)胞接觸。該可溶性膜系統(tǒng)由Langer和其同事在AngewantdeChimieInternationalEdition39:2396-2407,2000和Nature397:335-338，1999中描述。離心過程的步驟可以被自動(dòng)化，或者可選擇地被設(shè)計(jì)以使用戶根本不必停止離心才幾。例如，通過采用從BeckmanInstruments獲得的制備離心才幾(如超離心機(jī))的機(jī)械特征可以完成液體和樣品的引入和去除而無需停止轉(zhuǎn)子。此外，可以期望在向心力仍被施加的同時(shí)(如，當(dāng)發(fā)射體細(xì)胞和目標(biāo)顆粒之間的接觸因沒有離心而不穩(wěn)定時(shí)H企測光子發(fā)射。為了在其旋轉(zhuǎn)的同時(shí)檢測樣品管的發(fā)射光子，可以將PMT安置在相對于轉(zhuǎn)子軸的徑向位置。在大多數(shù)情況下，采用這種布置的PMT不需要與樣品管一起旋轉(zhuǎn)，相反可以為靜止的、并且當(dāng)樣品管在PMT前面經(jīng)過時(shí)可以方便地記錄光子發(fā)射。如果發(fā)射信號非常弱，則檢測器(如PMT、CCD芯片)可以與轉(zhuǎn)子耦聯(lián)，并且與樣品管一起旋轉(zhuǎn)?？蛇x擇地，為了檢測發(fā)射，可以圍繞轉(zhuǎn)子的圓周安置多個(gè)PMr。如果在同一轉(zhuǎn)子上旋轉(zhuǎn)多個(gè)樣品，則如果需要可以改變PMT的定位或信號處理。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)子容納4個(gè)各含有在相同波長發(fā)射的細(xì)胞的樣品管。為了區(qū)分來自一個(gè)樣品的發(fā)射和來自另一個(gè)樣品的發(fā)射，單個(gè)快速對準(zhǔn)的PMT可以連續(xù)地檢測發(fā)射。然后，使用監(jiān)視各個(gè)樣品在該時(shí)期的位置的轉(zhuǎn)子同步追蹤解析連續(xù)發(fā)射數(shù)據(jù)，以將發(fā)射分配到各個(gè)樣品。在本發(fā)明內(nèi)的其它變化是可以理解的。例如，圖17為與轉(zhuǎn)子耦聯(lián)的兩個(gè)反應(yīng)管，且具有兩個(gè)在所述管下方對準(zhǔn)的PMT。在靜止位置，轉(zhuǎn)子利用轉(zhuǎn)子位置編碼器將各個(gè)試管定位于相應(yīng)PMT下方。在另一實(shí)施方式中，圖17中所示的離心系統(tǒng)可以與空氣樣品收集器整合以實(shí)現(xiàn)圖18所示的系統(tǒng)。徑向氣溶膠沖擊管可以包括任何類型的顆粒監(jiān)視器，如在美國專利No.5，932,795及其引用的參考文獻(xiàn)中所描述的。在再一實(shí)施例中，圖18描述的系統(tǒng)可以被改變，從而如圖19所示，僅需要一個(gè)相對于轉(zhuǎn)子軸徑向?qū)?zhǔn)的PMT。如上所述，對于各個(gè)樣品管使用軸角編碼器對PMT記錄的發(fā)射進(jìn)行解析。返回參考圖17,包括，但不限于被工程化以識別特異性生物劑的B細(xì)胞的懸浮液、緩沖液、防腐劑、細(xì)胞培養(yǎng)基的流體組分可以被置于多個(gè)離心管的各管內(nèi)，與之前已經(jīng)在單獨(dú)的處理中從氣溶膠樣品收集的樣品顆粒的液體懸浮液混合。顆?？梢园幌抻诘鞍踪|(zhì)、肽、化學(xué)物質(zhì)、病毒、有活力的和孢子形式的細(xì)菌、真菌孢子、花粉顆粒、原生動(dòng)物、血或組織源的細(xì)胞、及其單獨(dú)或與如灰塵的載體顆粒結(jié)合的片段。當(dāng)旋轉(zhuǎn)馬達(dá)開動(dòng)時(shí)，離心管向外擺動(dòng)到徑向位置，且B細(xì)胞和/或樣品顆粒以由顆粒的粒度和密度決定的速率^皮帶動(dòng)至離心管底部。細(xì)力包和含樣品的流體纟皮加入和離心的確切順序可以基于其相對沉58淀速度制定以使信號最大化。通常，預(yù)計(jì)通過在加入B細(xì)胞之前旋轉(zhuǎn)這些樣品(預(yù)旋轉(zhuǎn))達(dá)適當(dāng)時(shí)間、并且旋轉(zhuǎn)以使其接觸，可以從比B細(xì)胞沉淀慢的顆粒獲得最大光輸出。對于以與B細(xì)胞相同或更快的速率的沉淀的顆粒，混合的樣品和B細(xì)胞組分的單次旋轉(zhuǎn)將引發(fā)該系統(tǒng)的最大光輸出。在離心設(shè)備的上游加入的顆粒粒徑分析器(包括、但不限于BAWS裝置和液體顆粒分析器)的數(shù)據(jù)可以被用于自動(dòng)確定最優(yōu)操作順序、并且啟動(dòng)適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)控制自動(dòng)樣品處理。當(dāng)"旋轉(zhuǎn)周期"結(jié)束、并且轉(zhuǎn)子到達(dá)位于由旋轉(zhuǎn)馬達(dá)和軸角編碼器調(diào)控的預(yù)定位置的可控停止位時(shí)，擺臂在重力作用下旋轉(zhuǎn)，從而離心管的底部被呈現(xiàn)于光電倍增管的敏感面，然后記錄任何光信號。在該實(shí)施的改進(jìn)版中，單光電倍增管可以定位于轉(zhuǎn)子/管配置的最大半徑處，并且用于當(dāng)各管連續(xù)經(jīng)過光電倍增管的敏感面時(shí)收集各管的光子。基于監(jiān)測軸角編碼系統(tǒng)，可以分配或組合從單個(gè)管測得的光輸出。返回參考圖18,氣溶膠顆粒的收集過程與使氣溶膠顆粒與B細(xì)胞接觸的過程整合。此處，離心管與擺臂連接使其在旋轉(zhuǎn)時(shí)覆蓋徑向沖擊器的末端，并且通過作用于旋轉(zhuǎn)徑向沖擊器管內(nèi)的空氣的離心力(如必要可以通過額外的送風(fēng)機(jī)裝置輔助)，誘導(dǎo)氣溶膠樣品流入樣品入口。氣流的高速度使氣溶膠顆粒沖擊在離心管的內(nèi)表面、或管內(nèi)含有的液體表面上，并且導(dǎo)致分別在管的表面上或液體內(nèi)捕獲顆粒。當(dāng)存在液體時(shí)，作用在液體上的離心壓力將抵消在液體內(nèi)捕獲顆粒所需的高速氣流所賦予的力，并且防止其被沖擊空氣吹出。在與管表面或液體沖擊后，氣溶膠顆粒被截留，并且當(dāng)液體收集時(shí)，氣溶膠顆粒被迫使徑向向外流動(dòng)，從而在最大半徑處(離心管的底部)提高局部顆粒濃度。在收集階段后加入B細(xì)胞并且將其旋轉(zhuǎn)至局部濃縮顆粒帶將引發(fā)光子輸出?？蛇x擇地，在收集過程中B細(xì)胞可以出現(xiàn)在液體中，并且在單光電倍增管旋轉(zhuǎn)的同時(shí)實(shí)時(shí)檢測光輸出(圖19)。在該實(shí)施的改進(jìn)版中，流體組分(包括但不限于經(jīng)可選擇生物氣溶膠收集器收集的顆粒樣品、和工程化B細(xì)胞懸浮液)可以,皮加到進(jìn)口，并且離心力可以被用于將其分散至管中。當(dāng)"旋轉(zhuǎn)周期"結(jié)束、并且轉(zhuǎn)子到達(dá)位于由旋轉(zhuǎn)馬達(dá)和軸角編碼器調(diào)控的預(yù)定位置的可控停止位時(shí)，擺臂在重力作用下旋轉(zhuǎn)，從而離心管的底部被呈現(xiàn)于光電倍增管的敏感面，并且記錄任何光信號。在該實(shí)施的改進(jìn)版中，單光電倍增管可以定位于轉(zhuǎn)子/管配置的最大半徑處，并且用于當(dāng)各管連續(xù)經(jīng)過光電倍增管的敏感面時(shí)收集各管的光子。基于監(jiān)測軸角編碼系統(tǒng)，可以分配或組合從單個(gè)管領(lǐng)'J得的光輸出。圖7為順序離心結(jié)果的示意圖。對于小于發(fā)射體細(xì)胞、但具有與發(fā)射體細(xì)胞相同密度的目標(biāo)顆粒，有利的是首先旋轉(zhuǎn)候選顆粒(如以高速)以使其成團(tuán)。之后，可以加入發(fā)射體細(xì)胞，并且根據(jù)需要在對于防止其反應(yīng)性下降的較溫和的條件下離心(頂部系列)。此外，該離心序列迫使幾乎所有候選顆粒和發(fā)射體細(xì)胞進(jìn)入離心管底部的相對小空間。相反，將候選顆粒和發(fā)射體細(xì)胞混合到一起、并且同時(shí)旋轉(zhuǎn)將導(dǎo)致顆粒和細(xì)胞之間的分離、而非接觸(中間系列)。當(dāng)然，完全無旋轉(zhuǎn)將極度降低反應(yīng)中顆粒和發(fā)射體細(xì)胞的有效濃度(底部系列)。圖8包括顯示證實(shí)圖7中所提出的結(jié)果的真實(shí)試驗(yàn)的曲線圖。以圖7中所示三種方法將土拉熱弗朗西斯氏菌特異性的發(fā)射體細(xì)胞與滅活的土拉熱弗朗西斯氏菌細(xì)胞混合。如線圖所示，順序旋轉(zhuǎn)方法導(dǎo)致接觸后快速、有效的發(fā)射。相反，單旋轉(zhuǎn)方法的發(fā)射曲線在時(shí)間和幅度方面低得多。非旋轉(zhuǎn)方法幾乎不顯示反應(yīng)。如圖8中所示曲線圖總結(jié)的，單獨(dú)試驗(yàn)中產(chǎn)生相似的發(fā)射特征。發(fā)射痕跡的檢查表明單旋轉(zhuǎn)方法導(dǎo)致靶特異性發(fā)射稍快于雙旋轉(zhuǎn)方法。然而，發(fā)現(xiàn)該結(jié)果主要為雙旋轉(zhuǎn)方法所需較長旋轉(zhuǎn)的人為結(jié)果，并不反映B細(xì)胞反應(yīng)時(shí)間的實(shí)際改進(jìn)。事實(shí)上，雙旋轉(zhuǎn)方法的起始斜率顯著大于單旋轉(zhuǎn)方法，說明雙旋轉(zhuǎn)方法導(dǎo)致強(qiáng)烈的發(fā)射體反應(yīng)。通過滴定測量離心管中沉積的土拉菌細(xì)胞的數(shù)目評估圖8所示檢測系統(tǒng)的靈敏度。在圖10所示的線圖中總結(jié)了結(jié)果。似乎，響應(yīng)于約5,300個(gè)土拉菌靶顆粒，25,000個(gè)發(fā)射體細(xì)胞能夠發(fā)射高于背景的可檢測的光子。預(yù)計(jì)反應(yīng)條件的進(jìn)一步優(yōu)化將增加靈敏度。在單冷凍-解凍循環(huán)后改善了細(xì)胞反應(yīng)(參見圖22)。在該試驗(yàn)中，鼠疫耶爾森氏菌(YP)特異性的細(xì)胞被離心，然后在冷凍培養(yǎng)基(具有10y。DMSO和附加10%FBS的RPMI)中被重懸、在-80。C冷凍、并且被轉(zhuǎn)移至液氮中。在37。C解凍細(xì)胞并且lml(2x106)細(xì)胞^皮稀釋至4mlRPMI中，并且在37°C孵育過夜。次日，用腔腸素(Coelentemzine)負(fù)載2小時(shí)，在不依賴(202培養(yǎng)基(C02-I)中清洗，并且恢復(fù)24小時(shí)。用5x105YP(50pl1()7/mlYP)激發(fā)10,000個(gè)細(xì)胞。未處理的細(xì)胞顯示每秒9500個(gè)光子的反應(yīng)，然而冷凍解凍的細(xì)胞響應(yīng)于YP發(fā)射約6倍多的光子。通過將細(xì)胞暴露于冷凍培養(yǎng)基而無需實(shí)際冷凍，這種刺激效應(yīng)能被很大地復(fù)制(5倍刺激)。似乎冷凍培養(yǎng)基中的刺激因子為DMSO。當(dāng)細(xì)胞用2。/。DMSO處理時(shí)(當(dāng)lml溶的DMSO的終濃度)，檢測到類似水平的刺激。DMSO作用可能由于許多因素。已知DMSO影響造血細(xì)胞分化，并且通過該途徑刺激激。因此，似乎該影響也部分由于由DMSO誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)，并且使用刺激"熱激(heatshock)"反應(yīng)的多個(gè)條件中的任一種都可能重復(fù)這種刺激。細(xì)胞可以以負(fù)載腔腸素的狀態(tài)被冷凍儲(chǔ)存。用腔腸素負(fù)載細(xì)胞，使其恢復(fù)24小時(shí)，然后冷凍。當(dāng)解凍時(shí)，通過10mlC02-I培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，并且在10mlCO2-I培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞至5x1()S個(gè)細(xì)胞/ml的濃度。這些細(xì)胞能夠檢測YP(在該情況下，解凍后約1小時(shí)，但是更短的時(shí)間也是可能的)。當(dāng)在室溫下儲(chǔ)存時(shí)，這些細(xì)胞保持檢測抗原能力多日。在用腔腸素負(fù)載和冷凍之前，用DMSO預(yù)處理這些細(xì)胞能夠增加解凍后細(xì)胞對抗原的靈敏度。在圖22中，各種細(xì)胞處理之后，用50(il稀釋于C02-I中的10，000,000YP/ml激發(fā)細(xì)胞。未處理細(xì)胞在RPMI中生長，用腔腸素負(fù)載，清洗，恢復(fù)24小時(shí)，并且用YP激發(fā)。冷凍/解凍細(xì)胞在RPMI中生長，轉(zhuǎn)移至冷凍培養(yǎng)基中，并且冷凍。解凍的細(xì)胞(lml)-陂置于41111RPMI中，并且在37。C孵育24小時(shí)，用腔腸素負(fù)載，清洗，恢復(fù)24小時(shí)，并且激發(fā)。冷凍培養(yǎng)基細(xì)胞在RPMI中生長，轉(zhuǎn)移至冷凍培養(yǎng)基并且在室溫孵育IO分鐘。細(xì)胞(lml)被置于4mlRPMI中，并且在37。C孵育24小時(shí)，用腔腸素負(fù)載，清洗，恢復(fù)24小時(shí)，并且激發(fā)。2。/。DMSO:細(xì)胞在RPMI中生長，轉(zhuǎn)移至含2%DMSO的RPMI并且在37。C孵育24小時(shí)，用腔腸素負(fù)載，清洗，恢復(fù)24小時(shí)，并且激發(fā)。成功的生物戰(zhàn)檢測系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)對戰(zhàn)場中存在的一般環(huán)境物質(zhì)的污染是有抗性的。為了評估發(fā)射體細(xì)胞是否能在環(huán)境應(yīng)激或污染下運(yùn)行，在發(fā)射體細(xì)胞暴露于全強(qiáng)度柴油機(jī)排放物達(dá)1小時(shí)后(圖11中的左側(cè)線圖)，或者當(dāng)用107被用作任何戰(zhàn)地細(xì)菌替代污染物的大腸桿菌污染細(xì)胞時(shí)(圖11中的右側(cè)線圖)，混合發(fā)射體細(xì)胞和目標(biāo)顆粒。如圖11所示，測試的特定化學(xué)和生物污染物并未影響發(fā)射體細(xì)胞響應(yīng)于目標(biāo)顆粒發(fā)射光子的能力。圖13~14描述了本發(fā)明的不需要離心的不同實(shí)施例。圖13的示意圖顯示了該實(shí)施方式的各種部件。生物氣溶膠警告?zhèn)鞲衅?BAWS)-險(xiǎn)測如在預(yù)定粒度范圍內(nèi)的顆粒的存在。BAWS的例子在Primmerman,LincolnLaboratoryJournal12:3-32,2000中4皮4笛述。Jj口果檢測到符合規(guī)定的顆粒，BAWS觸發(fā)空氣-空氣濃縮器(如美國專利No.5,932,759中所描述的試樣收集器)，使得特定粒度范圍內(nèi)的顆粒被收集、并且沉積在圖14中不同視圖所示的第一站位的部分試樣帶上的孔(反應(yīng)室)內(nèi)。候選顆粒在孔內(nèi)沉積后，所述帶前進(jìn)至發(fā)射體細(xì)胞庫下方、PMT上方的第二站位。對目標(biāo)顆粒上的特定抗原特異性的發(fā)射體細(xì)胞置于孔內(nèi)，并且監(jiān)測孔的光子發(fā)射。在通過BAWS檢測候選顆粒的時(shí)間內(nèi)，隨著傳送帶通過第一站位前進(jìn)，候選顆?？梢栽诤罄m(xù)孔上沉積(圖14)。在第二站位，各含有具不同目標(biāo)特異性的發(fā)射體細(xì)胞的多個(gè)發(fā)射體細(xì)胞庫被安裝于轉(zhuǎn)動(dòng)架上，所述轉(zhuǎn)動(dòng)架將特定庫旋轉(zhuǎn)至位置以在孔內(nèi)沉積不同發(fā)射體細(xì)胞。這樣，候選顆粒內(nèi)的不同目標(biāo)可以被沖企測，如圖14的孔的示意62性俯視圖所示。當(dāng)然，如果不同發(fā)射體細(xì)胞以不同波長發(fā)射，只要第二站位下方的PMT能夠區(qū)分不同波長的光子，則可能在含候選顆粒的單個(gè)孔內(nèi)沉積不同發(fā)射體細(xì)胞。圖16示意性地顯示本發(fā)明的系統(tǒng)的另一實(shí)施方式。在該實(shí)施方式中，在第一站位，空氣顆粒在二維陣列(如具有六行和數(shù)百列的帶)內(nèi)的一行中的六個(gè)孔的每一個(gè)內(nèi)沉積。隨陣列前進(jìn)一行，上述行定位在第二站位，不同發(fā)射體細(xì)胞在該行內(nèi)的各個(gè)孔中沉積，并且通過在第二站位下方的一行PMT同時(shí)檢測所有六個(gè)反應(yīng)的發(fā)射。為了促進(jìn)顆粒與帶上的孔的粘附，可以用粘合劑或液體涂覆孔。具體范例方法和/辦勿^^#和脊染M12g3R細(xì)胞在37°C、在5%C02的濕潤空氣中、在補(bǔ)充有10%胎牛血清、lmM丙酮酸鈉、2mML-谷氨酰胺、100faM非必須氨基酸、50pM2-巰基乙醇、50叫/ml鏈霉素和50U/mL青霉素(LifeTechnologies)的RPMI1640中維持。用線性化pCMV.AEQ.IRES.NEO[11](每107細(xì)胞20嗎DNA)通過電穿孑L(270V,950|iF)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并且在lmg/mlG418中選擇2周?？股乜剐缘募?xì)胞在具有IOjiM腔腸素(MolecularProbes)的生長培養(yǎng)基中、在室溫下孵育2小時(shí)，用箔覆蓋，清洗兩次，并且在生長培養(yǎng)基中重懸。細(xì)胞在光度計(jì)中就響應(yīng)于抗-鼠IgMF(ab，)2的光發(fā)射進(jìn)行篩選。在補(bǔ)充有10%胎牛血清的RPMI1640中維持U937細(xì)月包。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的前一天細(xì)胞被稀釋至5x1()S細(xì)胞/ml。在第二天，2x1()7個(gè)U937細(xì)胞在HBSS中被清洗一次，并且在900^1HBSS中重懸。向細(xì)胞中加入20嗎的線性化pCMV.AEQ.IRES.NEO,并且在室溫孵育10分鐘。然后將混合物轉(zhuǎn)移至電穿孔小池(0.4cm),并且在250V、975[iF下電穿孔。細(xì)胞在37。C下，在生長培養(yǎng)基中將育48h，然后通過在96孔板中進(jìn)行有限稀釋而在含有5嗎/ml殺稻瘟素的培養(yǎng)基中被克隆。1014天后，選擇并生長克隆以進(jìn)行篩選。用腔腸素負(fù)載克隆子，并就對5mM離子霉素的反應(yīng)進(jìn)行篩選。陽性克隆被進(jìn)一步擴(kuò)增、并鑒定。輕鏈表達(dá)載體VKExpress包括處于人延伸因子-la(EF-la)啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)(MCS)下游的人k基因恒定區(qū)。通過修飾pDisplay(Invitrogen)、保留巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列、但用鼠IgM的膜結(jié)合恒定區(qū)的基因代替血小板源的生長因子受體跨膜域、并且去除在MCS任一側(cè)的標(biāo)簽而產(chǎn)生重鏈載體。使用含EcoRI和NotI位點(diǎn)(分別在5，和3')的引物，通過PCR擴(kuò)增鼠IgM的膜結(jié)合恒定區(qū)的基因組序列，CpM。具有平端EcoRI位點(diǎn)、并用Notl消化制備的插入片段被克隆到具有平端Bsml、并用NotI消化的pDisplayhygro中。通過利用PCR分別向hygro⑧基因的5，和3'端加入ClaI和BstBI限制性位點(diǎn)，并且將新抗生素抗性基因克隆至pDisp1ay的這些位點(diǎn)中，新霉素抗性基因被用賦予潮霉素抗性的基因(hygro,從pcDNA3.1Hygro(Invitrogen)獲得)代替。利用PCR向抗體可變區(qū)加入適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)，并且在克隆至表達(dá)構(gòu)建體前確:[人所有PCR產(chǎn)物的序列。_^^戎體差西才艮據(jù)制造商的說明用Trizol試劑(LifeTechnologies)提取RNA，并且使用Retroscript試劑盒(Ambion)進(jìn)行第一鏈合成。利用設(shè)計(jì)在5，端與前導(dǎo)序列或框架區(qū)退火、并且在3'端與恒定區(qū)或框架區(qū)退火的引物組進(jìn)行PCR。將可變區(qū)克隆至表達(dá)載體如下進(jìn)行。通過PCR、使用含ApaLI和BamHI限制性位點(diǎn)序列的引物將這兩個(gè)位點(diǎn)加到輕鏈可變區(qū)的5，和3，端，并且被克隆至VKExpress中。以兩步法將重鏈可變區(qū)(Vh)克隆至pDisplay-C(iM中，以去除HA和myc標(biāo)簽。首先，重疊延伸PCR被用于將Vh與CpM的第一個(gè)300個(gè)堿基對(bp)融合，同時(shí)向5，端添加BglII限制性位點(diǎn)。用BglII消化插入片段，BglII也在恒定區(qū)的293bp處切割，并且將插入片段克隆至用同一酶消化的pDis-C|iM。第二重疊延伸產(chǎn)物將Vh與使用KpnI和BglII位點(diǎn)被克隆到其中的IgK引導(dǎo)序列融合。通過產(chǎn)生具有緊隨引導(dǎo)序列的BglII位點(diǎn)的pDisplay-CpM載體以使得去除兩個(gè)標(biāo)簽的單個(gè)克隆步驟，我們隨后改進(jìn)了該克隆方法。d顏r試,通過以5x1()5個(gè)細(xì)胞/mL的濃度、在添加2%DMSO的生長培養(yǎng)基中孵育制備用于發(fā)光的B細(xì)胞。2024小時(shí)后，細(xì)胞在室溫下、在具有50fiM腔腸素(MolecularProbes,Eugene，OR)的測試培養(yǎng)基中[不依賴C02的培養(yǎng)基，10%胎牛血清，50嗎/ml鏈霉素，50U/ml青霉素，和250ng/mL兩性霉素B(LifeTechnologies)]黑暗中孵育2小時(shí)。然后，清洗細(xì)胞兩次，在1.5mL微離心管內(nèi)用測試培養(yǎng)基以5xl05個(gè)細(xì)胞/mL終濃度重懸，并且將其在室溫下旋轉(zhuǎn)過夜。用測試培養(yǎng)基稀釋測試樣品，并且用吊斗(swingbucket)或水平離心機(jī)以最大速度在0.2mL或1.5mL管內(nèi)離心2分鐘。通過倒置輕混B細(xì)胞，并且的細(xì)胞被沉積在樣品管側(cè)。樣品在配有特制水平轉(zhuǎn)子的小的、臺(tái)式微量離心機(jī)(Daigger)中離心4秒，然后插入光度計(jì)(Zylux,FB12)中。使用單動(dòng)力曲線設(shè)置、在共60秒內(nèi)、以1秒的間隔記錄反應(yīng)。陽性反應(yīng)定義為從4秒離心開始、在1530秒范圍內(nèi)具有>3的信號與背景比和最大光輸出。U937纟田月包(5x1()5個(gè)纟田月包/mU與IFNy(200ng/mL,Sigma)一起在37。C下孵育過夜。次日，7.5x105個(gè)細(xì)胞在含200|iM腔腸素的100lal測試培養(yǎng)基中在室溫下黑暗培養(yǎng)2小時(shí)，在測試培養(yǎng)基中清洗3次，以5x1()S個(gè)細(xì)胞/mL濃度重懸，轉(zhuǎn)移至1.5ml管中，并且在室溫下旋轉(zhuǎn)過夜。細(xì)胞與抗體(10-100|ag/mL純化的、或1:1比例的雜交瘤細(xì)胞)在37。C下孵育530分鐘，然后清洗1次，并且在測試培養(yǎng)基中重懸。如上所述進(jìn)行試驗(yàn)。##發(fā)蛋冷4這^建#為了融合水母發(fā)光蛋白和GFP，我們制備了含與6個(gè)氨基酸連接子(SGGGSG)融合增強(qiáng)的GFP(EGFP)基因、其后為水母發(fā)光蛋白基因的構(gòu)建體。通過PCR從pEGFP-Cl載體(BDBiosciences65Clontech)擴(kuò)增EGFP，去除終止密碼子、并且在該基因的3'端加入連接區(qū)域有義引物5'-GCCACCATGGTGAGCAAGGGC-3'(SEQIDNO:12)反義引物5'-CCTGATCCACCGCCAGACTTGTACAGCTCGTCC誦3'(SEQIDNO:15)。EGFP含有雙氨基酸取代(F64L和S65T)，并且與GFP相比顯示了增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。從pCMV水母發(fā)光蛋白構(gòu)建體中擴(kuò)增水母發(fā)光蛋白基因，向該基因的5'端加入連接區(qū)域有義引物CTGGCGGTGGATCAGGAATGACCAGCGAACAATA-3'(SEQIDNO:22)反義引物5'-TTAGGGGACAGCTCCA-3'(SEQIDNO19)。然后，通過重疊延伸PCR利用用作重疊區(qū)域的連接區(qū)域?qū)GFP和水母發(fā)光蛋白基因連接到一起。然后，將該融合基因克隆至pcDNA3.1-TOPO(Invitrogen)中，并且確認(rèn)序列。使用泡沫頭拭子(VWRCritical拭子)收集鼻分泌物，然后使用標(biāo)示量的炭疽芽胞桿菌(5.aw//zrac^)孢子接種，并且用400^1測試培養(yǎng)基置于含5(im濾器(MilliporeUltrafree-MC)的籃中。通過離心2分鐘、在1.5ml微離心管中收集洗出液，離心也用于將孢子濃縮至管底部。離心后，去除籃和拭子，并且在同一管中進(jìn)行試驗(yàn)。力口入沙目艮衣原、體(C.^ac/zowa"s)(102~105/ml，BiodesignInternational)的人尿液通過5(im注射濾器(Minisart)。0.5毫升等份試樣在1.5mL微離心管中、以10,000RCF離心2分鐘，棄除上清液，并且通過將試管的邊緣抵于干凈紙巾而吸走殘余上清液。通過旋轉(zhuǎn)振蕩重懸沉淀物，加入0.5mL測試培養(yǎng)基，并且以10，000RCF再次離心才羊品2分鐘。如上所述進(jìn)4于CANARY試-驗(yàn)。在特制的肝素化血漿分離管內(nèi)收集0.5毫升全血，并且以3500RCF離心90秒。通過倒置測試管內(nèi)收集含病原體血漿，具有在50250pL范圍內(nèi)的回收體積。50微升血漿與0.5mL測試培養(yǎng)基混合，并且如上述CANARY試驗(yàn)中所述進(jìn)行處理。為了稀釋人血漿中存在的活化劑，向50|iL血漿中加入450|iL。為了通過吸附去除活化劑，50pL血漿與50(iL(2xl()5個(gè)細(xì)胞)親本B細(xì)胞系一M12g3R在室溫下孵育10分鐘。通過以1500RCF離心1分鐘沉淀細(xì)胞以^吏細(xì)胞成^求，將血漿轉(zhuǎn)移至干凈管中，并以最大速度離心2分鐘。為了構(gòu)建用于血液中的細(xì)胞內(nèi)病原體的裝置，將200pLFICOLLTMHYPAQUEtm溶液置于Capiject血液收集管(T-M，TemmoMedicalCorp.)中。由CPT得到的聚酯凝月交(BectonDickinson)被置于FICOLL的頂部。為了發(fā)生血細(xì)胞的正確分離，全血應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)以至少6:1的比率被稀釋；因而lOO^L的PBS被置于凝膠上。肝素化全血(600^L)被置于管內(nèi)，倒置該管以混合血液和PBS,并且將該裝置以3500RCF離心90秒。用試驗(yàn)管代替該裝置頂部內(nèi)的紅塞，并且通過倒置在試驗(yàn)管內(nèi)收集血漿和白細(xì)胞。通過向i式馬全管內(nèi)力口入600|iLM-Per細(xì)月包溶解"i式劑(PierceBiotechnology,Inc.)釋放細(xì)胞內(nèi)病原體，并且利用周期性旋轉(zhuǎn)振蕩在室溫下孵育5分鐘。以18，000RCF離心樣品1分鐘，用500(iL測試培養(yǎng)基代替上清液，旋轉(zhuǎn)振蕩混合，并且重復(fù)離心。如上所述分析樣品中的病原體的存在。用沙眼衣原體細(xì)胞系測試以下生物的交叉反應(yīng)性綠膿桿菌、酉良膿纟連球菌、糞腸球菌、淋球菌、卡他布蘭漢球菌、腸炎沙門式菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、奇異變型桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、表皮葡萄糖球菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、微小棒狀桿菌、嗜酸乳酸菌、無乳鏈球菌、腐生葡萄球菌、D群鏈球菌、變形鏈球菌、陰道力口德纟內(nèi)菌、麻滲孿生^求菌(Gemellamorbillorium)。沙眼衣原體的血清變型乂人BiodesignInternationa獲lf。^景CANARY利用已被遺傳工程化以產(chǎn)生水母發(fā)光蛋白的B細(xì)胞，所述水母發(fā)光蛋白為一種最初在發(fā)光水母(」e《wore"v/"or/")中發(fā)現(xiàn)的4丐敏生物發(fā)光蛋白。該系統(tǒng)工作如下(l)B細(xì)胞可以被暴露于氣體樣品、血樣、或其它來源的可疑生物劑或其它病原體。(2)B細(xì)胞具有對特定生物劑特異性的抗體。如果這些抗原物質(zhì)之一存在于樣品中，則其將結(jié)合B細(xì)胞表面上的抗體。(3)由生物劑導(dǎo)致的B細(xì)胞的抗體交聯(lián)引發(fā)了釋放細(xì)胞內(nèi)鈣的細(xì)胞內(nèi)酶級聯(lián)。(4)當(dāng)鈣存在時(shí)，水母發(fā)光蛋白發(fā)射469nm的藍(lán)-綠光。(5)可以使用光電倍增管或其它光檢測器檢測激活B細(xì)胞發(fā)出的光。我們具有經(jīng)遺傳工程表達(dá)(1)細(xì)菌和病毒病原體特異性的抗體、和(2)水母發(fā)光蛋白的B細(xì)胞系。功能性水母發(fā)光蛋白由前水母發(fā)光蛋白(apoaequorin)及其底物腔腸素(coelenterazine)組成，腔腸素為一種能夠自發(fā)穿過細(xì)胞膜、并且結(jié)合前水母發(fā)光蛋白的化合物。結(jié)合4丐離子后，水母發(fā)光蛋白發(fā)生導(dǎo)致腔腸素氧化和發(fā)射光的構(gòu)象變化。當(dāng)暴露于多價(jià)抗原時(shí)，激活的含水母發(fā)光蛋白B細(xì)胞(已用重組抗體的DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染使其對抗原具有特異性)發(fā)射光。當(dāng)被并入適當(dāng)?shù)膫鞲衅餍问絻?nèi)時(shí)，這些細(xì)胞對于醫(yī)學(xué)診斷、生物戰(zhàn)劑的檢測和食品、水和空氣的質(zhì)量的監(jiān)測是非常有益的。B細(xì)胞檢測系統(tǒng)本質(zhì)上是如此之快(在<1秒內(nèi)鑒定)，測試最初的延遲僅為使病原體與B細(xì)胞接觸所需的時(shí)間。該問題并不是微不足道的，因?yàn)椴≡w和B細(xì)胞本質(zhì)上是微小的粘彈性顆粒，其在流體環(huán)境中易于互相滑過。我們通過使用離心力將顆粒驅(qū)到一起對于細(xì)菌和大病毒已解決了該問題。當(dāng)抗原和B細(xì)胞僅被簡單地一起放置在懸浮液中時(shí)，信號反應(yīng)在時(shí)間上延遲、在強(qiáng)度上是低的。當(dāng)抗原和B細(xì)胞經(jīng)5秒的旋轉(zhuǎn)離心而成團(tuán)時(shí)，反應(yīng)的速度和強(qiáng)度都提高。然而，當(dāng)加入B細(xì)胞之前先使抗原預(yù)成團(tuán)時(shí)，速度和強(qiáng)度發(fā)生最大改進(jìn)。然后，通過附加5秒的離心驅(qū)使B細(xì)胞成團(tuán)。使用該離心形式獲得了對土拉熱弗朗西斯氏菌(Fraw"'"〃a^/a"fe/力和鼠疫耶爾森氏菌(l^M/m^/e幼X)的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)共同證明對任何已知抗原鑒定方法的極好的特異性以及速度和靈敏度(約3分鐘內(nèi)50cfu)的最佳組合。68對于可以以低速快速沉淀的如天花的較大病毒，本離心方法發(fā)揮了很好的作用。然而，我們也已經(jīng)對細(xì)胞系進(jìn)行工程化以產(chǎn)生對如FMD、登革熱和VEE的病毒特異性的抗體，它們太小難以在相同條件下被濃縮。盡管對于小病毒的LOD在1分鐘測試中約為500，000cfu,但是通過較長離心或親和純化可以將該數(shù)目提高100倍之多。錄^、^f敏婆;t侈^存品哞的病^體的C4A^i^S細(xì)應(yīng)傳感我們描述了一種已經(jīng)證明對任何抗原鑒定技術(shù)提供最好的速度和靈敏度的組合的新傳感器。我們的方案使用為天生為識別抗原而最優(yōu)化的免疫系統(tǒng)成員-B淋巴細(xì)胞。我們對B細(xì)胞系進(jìn)行工程化以表達(dá)細(xì)胞溶質(zhì)水母發(fā)光蛋白(鈣敏生物發(fā)光蛋白)以及對關(guān)注的抗原具有特異性的膜結(jié)合抗體。通過多價(jià)抗原導(dǎo)致的膜結(jié)合抗體的交聯(lián)誘發(fā)順序涉及酪氨酸激酶、磷脂酶C和肌醇-三磷酸酯(IP3)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。IP3激活鈣通道，從而從內(nèi)部庫和細(xì)胞外介質(zhì)增加細(xì)胞溶質(zhì)鈣，這激活水母發(fā)光蛋白，進(jìn)而發(fā)射光。該稱作CANARY的傳感器可以在<3分鐘內(nèi)(包括了濃縮樣品所需時(shí)間)內(nèi)檢測<50cfu的病原體。相反，即使最尖端的免疫試驗(yàn)分析也要花費(fèi)至少15分鐘并具有更高得多的檢測極限，而盡管PCR可能是高特異性和靈敏度的，但大多數(shù)報(bào)告采用〉30分鐘的流程。盡管已報(bào)道了在僅9分鐘內(nèi)檢測5cfu的超快PCR，但是即使與最快的樣品制備技術(shù)結(jié)合，整個(gè)試驗(yàn)還需要2030分鐘完成。因?yàn)槠洫?dú)特的速度和靈敏度的結(jié)合，CANARY能夠?yàn)獒t(yī)學(xué)診斷、生物戰(zhàn)爭防御、食品和水質(zhì)量檢測以及其它應(yīng)用中的病原體鑒定帶來革命。我們首先開發(fā)了能夠有效產(chǎn)生多種B細(xì)胞系的遺傳工程系統(tǒng)。我們從M12g3R(IgM+)B細(xì)胞系產(chǎn)生了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞溶質(zhì)水母發(fā)光蛋白的親本細(xì)胞系，選擇在表面IgM交聯(lián)時(shí)具有最大發(fā)光量的克隆。隨恒定區(qū)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染M12g3R-水母發(fā)光蛋白細(xì)胞。基于其對所述目標(biāo)物質(zhì)的反應(yīng)選擇第二轉(zhuǎn)染的克隆。為了提供使用CANARY可以鑒定的抗原物質(zhì)的范圍的概念，我們在下表中列出了已開發(fā)的所有24種細(xì)胞系。對于CANARY細(xì)胞系可以沖企測的目標(biāo)物質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>潛果C4A^4燈試發(fā)在不到3分鐘的總測試時(shí)間內(nèi)檢測到了少至50cfu鼠疫耶爾森氏菌，該細(xì)菌引起瘋疫。然而，對相對大量的不相關(guān)的病原體(土拉熱弗朗西斯氏菌)無反應(yīng)。此外，即使極大量的不相關(guān)抗原也不妨礙對50cfu之少的鼠疫耶爾森氏菌的反應(yīng)。事實(shí)上，對于大多數(shù)大小足以在微離心管中被濃縮的細(xì)菌或病毒，我們已觀測到了大約50cfu或pfu類似級別的靈敏度。當(dāng)在幾個(gè)月內(nèi)重復(fù)測試鼠疫耶爾森氏菌特異性細(xì)胞系的靈敏度時(shí)，CANARY傳感器能在62%的時(shí)間檢測20cfu(n=73)、在79%的時(shí)間才企測50cfu(n=38)、在99%的時(shí)間4企測200(n=74)牙口2000cfu(n=71)、以及在100%的時(shí)間#^測20,000cfu(n=66)。假陽性率僅為0.4%(n=1288)，結(jié)合接近于PCR的靈敏度以及不到3分鐘可以進(jìn)行的測試，使CANARY試-驗(yàn)稱為當(dāng)前發(fā)展的最有前景的病原體鑒定技術(shù)之一。因?yàn)閿U(kuò)散速率決定B細(xì)胞和不可沉淀的目標(biāo)物質(zhì)之間的相互作用，因此，CANARY試驗(yàn)對于小病毒的靈敏度高于對于細(xì)菌和大病毒的靈敏度。例如，當(dāng)被暴露于7xl()S個(gè)空斑形成單位(pfu)時(shí)，對口蹄疫病毒(FMDV)的A12系特異性的B細(xì)胞產(chǎn)生易區(qū)分的信號。類似地，用滅活前滴定的TC-83系測試委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)特異性B細(xì)胞系的靈敏度證明由7x1()Spfu產(chǎn)生可^r測信號。B細(xì)胞表達(dá)的抗體決定CANARY細(xì)胞的特異性，并且可以與可獲得的抗體一樣寬或窄。例如，當(dāng)FMDV細(xì)胞系對野生型A12病毒反應(yīng)時(shí)，加入等量A12變異抹(B2PD.3)后，未一全測到光，所述B2PD.3與野生型A12有三個(gè)氨基酸的不同，這種變化打斷了抗體表位相互作用。與僅對一個(gè)FMDV林反應(yīng)的FMDV細(xì)胞系的特異性相反，VEEB細(xì)胞系顯示了與親本單克隆抗體相似的特異性，和代表亞型IA(TC-83，TRD)、IB(PTF-39)、IC(P676)、ID(3880)和IE(MenaII)的VEE抹反應(yīng)。M12g3R親本系(對照B細(xì)胞)也被測試與不同VEE林的反應(yīng)性，并且，盡管其在TC-83和TRD抗原制劑(其是從幼鼠大腦、而不是從組織培養(yǎng)物提取的)存在時(shí)顯示非特異性信號，但是由特異性B細(xì)胞系產(chǎn)生的信號清楚區(qū)別于對照的信號(〉10倍)。我們也由1A4D-1雜交瘤制備了識別除MenaII系外的所有以上所列目標(biāo)物質(zhì)的VEEB細(xì)胞系。因此，給定適當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w，可以基于我們選擇表達(dá)的載體設(shè)計(jì)B細(xì)胞的特異性以具有寬或窄范圍的反應(yīng)性。通過根據(jù)應(yīng)用的不同而設(shè)計(jì)在屬、種、或亞種水平上區(qū)分生物體極大增加了該系統(tǒng)的靈活性。^/"^V、病毒^敏產(chǎn)的攻迷多種小病毒濃縮和沉淀的方法已被測試其提高CANARY細(xì)胞對這些抗原反應(yīng)的能力。使用曱醇、TCA或磷鎢酸鈉的沉淀并沒有提高靈敏度，硝酸纖維素的吸附也沒有提高靈敏度。各種廠家的離心濃縮器似乎非特異性結(jié)合CANARY試驗(yàn)中所使用的低濃度病毒。至今，兩種方法已顯示好的結(jié)果離心和親和純化。滅活的TC-83VEE被用于所有以下病毒濃縮試驗(yàn)。為了產(chǎn)生生理學(xué)相關(guān)的病毒樣品，通過穿過O.lpm注射濾器去除VEE聚集體。然后，將樣品離心不同時(shí)間，并且通過CANARY分析。離心l分鐘沉淀少量病毒，5分鐘得到中等結(jié)果，以及離心1030分鐘沉淀接近完71成。這種模式更符合單體VEE的理論沉淀速率，說明我們已制備了具有與現(xiàn)實(shí)樣品所預(yù)計(jì)的類似的沉淀特征的測試樣品。這也證明在樣史離心^L中離心單體VEE達(dá)1030分鐘增加了信號、并且因而增加靈敏度。進(jìn)一步的試驗(yàn)檢驗(yàn)了經(jīng)聲波處理聚集物質(zhì)以增加單體病毒的回收。與未處理樣品(50，000，000pfi^)相比，聲處理過的樣品(500,000pfu*)中的LOD增加，這反映了存在的和能夠穿過0.1|im濾器的單體病毒量的增加。在過濾前被聲處理的樣品產(chǎn)生高于未聲處理的樣品幾乎IOO倍的信號。利用聲處理制備的單體病毒的沉淀速率也與理論沉淀速率類似，說明聲處理并沒有打碎病毒至在這些測試中可察覺的程度。離心可以增加靈壽丈度IOO倍。第二種改進(jìn)CANARY對小病毒的靈敏度的有效方法為親和純化。抗VEE的單克隆抗體與G蛋白包被的磁性樣i球偶聯(lián)。然后，將這種親和樹脂與含VEE的培養(yǎng)基一起孵育，清洗樹脂以去除未結(jié)合的病毒，并且CANARY細(xì)胞用于檢測粘附于沉淀的樹脂的病毒。VEE與這些親和樹脂孵育短短15分鐘就明顯地增加了CANARY細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)度，并且提高了LOD10倍。親和純化和離心方法都導(dǎo)致CANARY對小病毒反應(yīng)的提高。選擇的方法依賴于被檢測的樣品的類型。含可沉淀或可溶解干擾物的樣品應(yīng)進(jìn)行利用磁性微球的抗原親和純化?？梢允褂秒x心方法測試含可溶性干擾物或完全無干擾物的樣品。鍵遽細(xì)應(yīng)工程病原體特異性CANARY細(xì)胞的產(chǎn)生需要可用的雜交瘤細(xì)胞系、涉及多個(gè)步驟、并且可能需幾個(gè)月。因此需要利用CANARY平臺(tái)開發(fā)出可以用于以快速(<1天)但特異性的方式產(chǎn)生新的病原體特異性細(xì)胞的通用細(xì)胞系。為了解決該問題，我們探索使用Fc受體作為將病原體特異性抗原連接于CANARY細(xì)胞的可能"接頭"分子。Fc受體為結(jié)合抗體或免疫復(fù)合物的膜表達(dá)蛋白質(zhì)家族。它們在包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的多種造血細(xì)胞上表達(dá)。存在多種Fc受體的亞類，包括為可溶性抗體的高親和性結(jié)合物的Fey受體I(FcyRI)。FcyRI結(jié)合免疫球蛋白G(IgG)的恒定區(qū)(Fc部分)，空下抗體的抗原結(jié)合區(qū)。通過特異性抗原導(dǎo)致抗體結(jié)合受體的交聯(lián)啟動(dòng)刺激鉤釋放的信號傳導(dǎo)途徑。人巨噬細(xì)胞系U937含有可以用FcyRI處理時(shí)^皮上調(diào)的內(nèi)源FcyRI。最初的試驗(yàn)證明U937細(xì)胞可以被工程化以對多種不同病原體或刺激物快速反應(yīng)。用IFNy(200ng/ml)處理U937纟田月包24小時(shí)以增加內(nèi)源FcyRI的表達(dá)，并且準(zhǔn)備用于CANARY測試。然后將細(xì)胞與以下抗體一起孵育鼠抗-炭疽桿菌孢子、兔多克隆抗-炭疽桿菌孢子、鼠抗-土拉熱弗朗西斯氏菌或鼠抗枯草芽孢桿菌。然后，在標(biāo)準(zhǔn)CANARY測試中試驗(yàn)細(xì)胞，其中，使用單克隆抗體檢測到少至1OOOcfu的炭疽桿菌孢子、用兔多克隆抗體檢測10,000cfu的孢子，以及10,000cfu的土拉熱弗朗西斯氏菌和1000cfu的枯草芽孢桿菌。盡管不像遺傳工程的B細(xì)胞一樣靈敏，但是我們已經(jīng)證明了需要幾天而不是幾個(gè)月的快速工程化的CANARY細(xì)胞的開發(fā)。/f試驗(yàn)我們已經(jīng)評估了在單個(gè)測試中結(jié)合多種不同B細(xì)胞系的可行性。這將允許用單個(gè)測試檢測多種抗原，盡管將不能辨別哪種抗原在樣品中。用單個(gè)細(xì)胞試劑檢測3種不同抗原表明對于炭疽桿菌的檢測極限為50cfuB.a.、鼠疫耶爾森氏菌為50cfuY.p.、以及土^^立熱弗朗西斯氏菌為500cfuF丄。以40nL1.25x1()S個(gè)細(xì)胞/mL的優(yōu)化細(xì)胞濃度和量，我們能夠證明可以結(jié)合4種細(xì)胞系，而沒有任何靈敏度損失。第二種多重方法為表達(dá)一種以上抗體、并且能對一種以上抗原反應(yīng)的細(xì)胞系。我們已制備了表達(dá)兩種抗體的細(xì)胞系，一種抗體為炭疽桿菌特異性的，另一種為鼠疫耶爾森氏菌特異性的。該細(xì)胞系被用于檢測僅50cfu的炭疽桿菌孢子或鼠疫耶爾森氏菌，證明我們能夠建立具有多重檢測能力、無靈敏度損失的細(xì)胞系。第三種提供多重測試的方法為發(fā)射不同波長的光的CANARY細(xì)胞。在發(fā)光水母中，水母發(fā)光蛋白天然地與綠色熒光蛋白(GFP)相關(guān)。當(dāng)水母發(fā)光蛋白結(jié)合鈣并氧化腔腸素時(shí)，水母發(fā)光蛋白將其能量轉(zhuǎn)移給GFP,并且激發(fā)綠光發(fā)射(Xmax,509nm)。該自然發(fā)生的化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(CRET)活性可以通過融合水母發(fā)光蛋白和GFP在體外復(fù)制。GFP可以進(jìn)行遺傳修飾以產(chǎn)生包括藍(lán)綠色熒光蛋白和黃色熒光蛋白的多種熒光蛋白。水母發(fā)光蛋白與不同GFP構(gòu)建體融合可以產(chǎn)生多種能夠產(chǎn)生不同波長的光的水母發(fā)光蛋白。表達(dá)這些水母發(fā)光蛋白-GFP蛋白的CANARY細(xì)胞提供了多重測試，其中一種或多種波長的檢測使得能夠在單測試中識別多種病原體。這種類型的多重測試具有幾種優(yōu)點(diǎn)，包括在樣品量受到限制時(shí)在單個(gè)測試中識別多種病原體、當(dāng)使用單通道傳感器時(shí)同時(shí)檢測多個(gè)病原體的能力、以及通過增加重復(fù)數(shù)目降低多通道傳感器中的假陽性率的可能性。EGFP-水母發(fā)光蛋白構(gòu)建體被轉(zhuǎn)染至M12g3R鼠B細(xì)胞內(nèi)，并且通過對抗IgM刺激的反應(yīng)篩選克隆。在流式細(xì)胞器上分析陽性克隆，其中表達(dá)EGFP(Xmax，509nm)的細(xì)胞可以在測量515545nm綠色光i普中的光的FL1通道中被檢測到。為了進(jìn)一步證實(shí)表達(dá)EGFP-水母發(fā)光蛋白的細(xì)胞發(fā)射與表達(dá)野生型水母發(fā)光蛋白的細(xì)胞不同的波長的光，我們用兩個(gè)具有480nm和510nm的不同帶通濾波器的光電4咅增管(PMT)分析光輸出。用抗IgM刺激細(xì)胞，并且利用兩種PMT同時(shí)測量光。因?yàn)樗赴l(fā)光蛋白和EGFP-水母發(fā)光蛋白的發(fā)射光譜重疊，因此結(jié)果表達(dá)為綠/藍(lán)光的比例。由表達(dá)EGFP-水母發(fā)光蛋白的細(xì)胞發(fā)射的綠光的量顯著高于由表達(dá)野生型水母發(fā)光蛋白的細(xì)胞發(fā)出的量。有趣的是，與在缺少任何輔因子時(shí)發(fā)射熒光的野生型EGFP不同，EGFP-水母發(fā)光蛋白在觀察到熒光之前需要水母發(fā)光蛋白輔因子——腔腸素的存在。侈^品^/試在許多應(yīng)用場合快速抗原識別技術(shù)是非常有價(jià)值的。例如，快速測試能確保在即時(shí)治療直到非常重要作用的感染早期階段對病人進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的治療，如在吸入性炭疽病的情況中。因此，我們研究了CANARY試驗(yàn)在檢測臨床相關(guān)樣品中的病原體中的應(yīng)用。在樣品74制劑可以被檢測之前，向鼻拭子中加入少至50cfu的炭疽桿菌《包子。在該流程中，用400i!l測試培養(yǎng)基將拭子置于含5^im濾器的籃中。通過離心2分鐘、在1.5ml微離心管中收集洗出液，離心也用于將孢子集中至管底部。離心后，去除籃和拭子，并且在同一管中進(jìn)行試驗(yàn)?？倻y試時(shí)間不到5分鐘，并且因此，CANARY試驗(yàn)為可能已暴露于氣溶膠化炭疽桿菌孢子的人們提供極好的初篩，因而實(shí)現(xiàn)即時(shí)治療。另一個(gè)例子為需要快速即時(shí)診斷檢驗(yàn)以確保疾病的治療和控制的情況，如所述疾病為具有高的藥物治療不順應(yīng)率的通過性傳播的疾病。沙眼衣原體為高流行度的性傳播疾病，可能導(dǎo)致盆腔炎癥性疾病和生育問題，并且因?yàn)槎鄶?shù)無癥狀情況從而未被診斷。過去，利用需相當(dāng)時(shí)間和專家的檢測已從宮頸和尿道涂片診斷該疾病。盡管該生物的原生小體(EB)可以在微創(chuàng)收集的樣品尿液中被發(fā)現(xiàn)，但其以極低量存在以至于直到最近具有足夠有效的靈敏度的測試為擴(kuò)增核酸的測試。在最近的報(bào)道中，使用定量連接酶鏈反應(yīng)確定感染患者的尿液中沙眼衣原體的濃度范圍為30至2x105EB/ml，定量連4妾酶《連反應(yīng)為需要進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)的測試(Abbott)。由于CANARY試驗(yàn)的快速進(jìn)行，我們能夠達(dá)到在不到5分鐘的時(shí)間內(nèi)檢測尿液中的500沙眼衣原體EB。因此，CANARY試驗(yàn)作為在無創(chuàng)測試中診斷沙眼衣原體感染的快速、靈敏測試也是有用的。全血因?yàn)槠洳煌该餍院屯瑫r(shí)存在CANARY測試的活化因子和抑制因子從而是難以測試的基質(zhì)。我們已經(jīng)研制的方法依賴于血漿分離管(PST)和差異離心。該方法使用具有在血漿和血細(xì)胞的密度之間的密度的觸變凝膠，其在離心過程中在血漿和細(xì)胞之間形成屏障。離心后，任何血液中存在的任何細(xì)菌或病毒保留在血漿相中，然后其可以被收獲、并且在CANARY中測試。利用市售成品("COTS，，)部件裝配的設(shè)備，我們已證明了以三個(gè)快速簡單步驟分離全血樣品。在肝素化血漿分離管內(nèi)收集0.5mL全血(步驟1),并且離心90秒(步驟2)。通過倒置在測試管中收集分離的含病原體血漿(步驟3),回收體積在50250pL范圍內(nèi)。50(iL血漿與0.5mL測試培養(yǎng)基混合(如以下更詳細(xì)解釋，一種降低血漿中存在的CANARY細(xì)胞活化因子的作用的過程)，并且離心混合物以沉淀病原體。然后用抗原特異性CANARY細(xì)力包測試樣品。,人血液收集到病原體纟企測所需總時(shí)間為5分鐘。使用PST方法，LOD為1000cfu活的無毒鼠疫耶爾森氏菌/mL全血。通過使用從0.5mL全血回收的200jiL血漿中的50pL,我們檢測限達(dá)到少至125cfu(假定充分回收)/全血樣品。這些結(jié)果在迄今測試的各供血者中是一致。如前提及，人血漿包含干擾CANARY測試的B細(xì)胞活化因子，使得難以從低濃度抗原獲得可以與背景區(qū)分的清晰信號。活化因子產(chǎn)生的信號晚于病原體誘導(dǎo)信號到達(dá)峰值，并且信號強(qiáng)度是供者依賴性的，從幾乎難于察覺到幾個(gè)數(shù)量級的強(qiáng)度。我們已經(jīng)研制了三種有效去除活化因子的樣品制備方法。方法1利用了活化因子為可溶性的、并且可以通過用測試緩沖液置換血漿而被去除的事實(shí)。該技術(shù)對于可以在置換前被離心沉淀的細(xì)菌和大顆粒是有效的，但是不能用于小病毒或可溶性蛋白質(zhì)。方法2涉及通過向血漿樣品中加入過量的CANARY測試培養(yǎng)基削弱活化因子的作用。該方法是最快速簡單的，但是需要進(jìn)一步測試以確保其對各種血樣、尤其含高水平活化因子的血樣的有效性。方法3用起到活化因子吸附劑作用的B細(xì)胞預(yù)處理血樣。為了檢測白血球中的細(xì)胞內(nèi)病原體，研發(fā)了對檢測血漿中病原體的原型設(shè)備進(jìn)行改進(jìn)的方法。這些改進(jìn)基于市售可得的血液采集管(bloodvacutainertube)，細(xì)胞制備管(CPT)。該管被設(shè)計(jì)收集全血、以及通過在單個(gè)管中結(jié)合聚酯凝膠和密度梯度細(xì)胞分離培養(yǎng)基分離單核白血球。在單離心步驟過程中發(fā)生細(xì)胞分離。市售管的缺點(diǎn)為其需要至少6mL血和最少15分鐘離心。通過將CPT凝膠和密度梯度培養(yǎng)基結(jié)合到上述特制的處理設(shè)備中，血液的量被降至0.5mL,并且離心時(shí)間4又為90秒。為了使血細(xì)胞發(fā)生正確分離，全血應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)以至少6:1的比率被稀釋；因而100(iL的PBS被置于凝膠上。這樣，該設(shè)備已準(zhǔn)備好處理血樣。將肝素化的全血(600pL)置于管內(nèi)，倒置管，以混合血和PBS。離心90秒后，血液分離為其各種組分。用測試管替代該i殳備頂部內(nèi)的紅塞(redplug)，并且通過倒置在測試管內(nèi)收集血漿和白血球。通過向測試管內(nèi)加入M-Per細(xì)胞溶解劑、并且利用周期性4t轉(zhuǎn)l展蕩在室溫下孵育5分鐘實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)病原體的釋放。將樣品離心1分鐘以沉淀病原體，用500pL測試培養(yǎng)基置換上清液，通過^^轉(zhuǎn)振蕩混合，并且重復(fù)離心。從血液收集到抗原檢測的總時(shí)間為12分鐘。實(shí)現(xiàn)了每mL全血細(xì)胞1000cfu活鼠疫耶爾森氏菌(600cfu/測試)的斥企測。該方法對可以通過低速離心濃縮的細(xì)胞內(nèi)病原體(即細(xì)菌和大病毒)的檢測是有很好效果的。驗(yàn)證進(jìn)行了其中使用沙眼衣原體細(xì)胞系對交叉反應(yīng)性和靈敏度進(jìn)行檢測的驗(yàn)證。22種類型的被測細(xì)菌中的僅兩種并且僅在極高濃度(107/mL)下觀測交叉反應(yīng)性。當(dāng)肺炎鏈球菌(Wre^ococcM;^ewwom'ae)產(chǎn)生陽性反應(yīng)時(shí)，僅細(xì)菌的單體多糖出現(xiàn)在肺炎患者的尿液中，并且單體抗原不刺激CANARYB細(xì)胞。另一交叉反應(yīng)的細(xì)菌——麻滲孿生球菌(Gemellamorbillorum)為可能污染尿樣的正常腸內(nèi)微生物，但是不可能為如此高濃度。根據(jù)測試的沙眼衣原體的血清型不同，沙眼衣原體細(xì)胞系的靈敏度在10150EB的范圍內(nèi)(對于血清型D、H和K分別為10、50和150)。然而，由于不同批次產(chǎn)生稍不同的結(jié)果，所以，靈敏度的范圍可能歸因于定量的精準(zhǔn)性而不是細(xì)胞系的差異反應(yīng)。在任一情況下，通過驗(yàn)證確定的LOD在10，s100's范圍內(nèi)。茲論基于CANARYB細(xì)胞系的生物傳感器利用了與其它識別技術(shù)相比具有多種優(yōu)點(diǎn)的高度發(fā)展的病原體識別系統(tǒng)。利用CANARY試驗(yàn)可能在不到5分鐘內(nèi)提供識別，并且利用這些足以在微離心機(jī)中被濃縮的大病原體，我們已證實(shí)了接近于PCR的靈敏性水平。與此對比，77目前發(fā)展水平的免疫試驗(yàn)需要至少14分鐘，并且具有較高的檢測極限(6x104cfu或6x104pfu)。盡管PCR為極靈敏的(l~5cfu)、高度特異性的、并且具有已降低擴(kuò)增和信號檢測時(shí)間的喜人技術(shù)突破，但是該試驗(yàn)需至少7分鐘(但典型地為2030分鐘)，不包括提取和純化DNA所需時(shí)間。從這種技術(shù)受益的應(yīng)用包括復(fù)診率低但社會(huì)影響大的疾病(如性傳播疾病)的即時(shí)診斷。此外，CANARY試驗(yàn)對進(jìn)口港的農(nóng)業(yè)病原體的檢測、生物戰(zhàn)爭襲擊后的鼻拭子癥狀前檢測或易腐食品供應(yīng)的篩查是有利的。事實(shí)上，CANARY試驗(yàn)為在任何時(shí)間緊迫情況下實(shí)現(xiàn)高度傳染病原體的檢測和識別的快速、靈敏方法。刀fV、顆「4^求^的雙^泳引言CANARY測試可以使用離心作為在將用于識別和信號產(chǎn)這種手段在細(xì)菌和具有大于500nm粒徑的病毒目標(biāo)物質(zhì)的快速4全測中是非常成功的；然而，一些病毒目標(biāo)物質(zhì)小得多，則更難以以這種方式濃縮并且可能需要具有極高速度的更強(qiáng)的離心和/或附加步驟(如目標(biāo)顆粒與微球的中間結(jié)合)以提高復(fù)合顆粒的沉淀。為了判定沉淀給定粒徑的顆粒需要的離心速度，我們可以使用沉淀的斯托克斯定律(式1)計(jì)算隨流體粘性和旋轉(zhuǎn)參數(shù)變化的顆粒在流體中的速度。v.9-、〃乂、60乂V廣顆粒速度r^顆粒半徑|^=流體粘性D二離心半徑N二旋轉(zhuǎn)速度作為例子，使用現(xiàn)有具18，800rpm最大速度的臺(tái)式CANARY離心機(jī)，VEE病毒顆粒(直徑70nm)在微離心管內(nèi)通過50pL的典型樣品體積的濃縮需約15分鐘。使用具有最高100,000rpm轉(zhuǎn)速的超離心機(jī)能將沉淀時(shí)間減少至不到1分鐘，但是隨之具有所需設(shè)備的相關(guān)復(fù)雜性。我們已研發(fā)了用于小顆粒濃縮的非基于離心的方法，一種是動(dòng)電學(xué)的或基于電場的方法。這些技術(shù)中最公知的為電泳，其在基于液體和凝膠的介質(zhì)中處理和分離包括DNA和蛋白質(zhì)的帶電顆粒和大分子方面已非常成功地應(yīng)用多年。其依靠向顆粒存在其中的介質(zhì)兩端施加電場；在該(恒定)電場的作用下，帶電顆粒將朝向一個(gè)電才及遷移。顆粒移動(dòng)的方向和速度取決于其電荷和大小、以及介質(zhì)的性質(zhì)(包括其pH和離子強(qiáng)度)。電泳以相對不精密的方式處理帶電顆粒，是非常有用的技術(shù)。然而，為了將顆粒集中至特定位置且另外這些顆粒不是必須帶電的而是可極化的，則使用所謂雙向電泳的技術(shù)。雙力^泳--差4術(shù)語雙向電泳(DEP)首先由Pohl使用，Pohl能夠通過使用非均一電場在不帶電顆粒中產(chǎn)生電荷分離(極化、產(chǎn)生偶極)而誘導(dǎo)多種細(xì)胞類型的移動(dòng)和分離。如圖181所示，有正、負(fù)兩種DEP才莫式；通過顆粒相對于周圍介質(zhì)的相對極性確定采用哪種模式。在這兩種情況下，顆粒和介質(zhì)在施加的非均一電場的作用下發(fā)生電荷分離。如果顆粒比介質(zhì)更易極化，則凈偶極導(dǎo)致顆粒被吸引向最高電場區(qū)域；這被稱作正DEP。如果顆粒較介質(zhì)不易極化，則流體介質(zhì)向高電場遷移，這將顆粒推向電場最小處；這為負(fù)DEP。注意如果改變電場的極性，則誘導(dǎo)的電荷和偶極也改變極性，從而顆粒仍沿相同方向移動(dòng)；這使交流(AC)電場能夠用于操縱顆粒。AC電場使得能夠利用按照頻率變化的顆粒的極性；這意味著根據(jù)所施加電場的頻率的不同，同一顆粒可以既發(fā)生正DEP也發(fā)生負(fù)DEP。AC電場也是比DC更有利的，因?yàn)锳C電場其不導(dǎo)致由于電泳電解而在電極處產(chǎn)生顯著明顯的凈氣(netgas)。一般地，在低頻率下，由于在各循環(huán)中有足夠的時(shí)間使顆粒中的電荷相對于介質(zhì)中的電荷進(jìn)行分離，因此顆粒將經(jīng)歷正雙向電泳。在4交高頻率下，顆粒內(nèi)的電荷分布不能"維持"，因而顆粒相對于介質(zhì)變得較不易極化，使其進(jìn)入負(fù)雙向電泳狀態(tài)。正DEP可以被用于在電極處集中顆粒，而負(fù)DEP在遠(yuǎn)離電極的電場"井，，中捕捉他們。使顆粒從正轉(zhuǎn)向負(fù)DEP的頻率-爾作分隔頻率(crossoverfrequency)。式2顯示影響雙向電泳力(FDEP)的因素；該力與所施電壓(F)的平方和顆粒半徑(r)的立方成比例，并且與電極間距(d)成反比。其也為顆粒Up*)和介質(zhì)(sm*)的相對介電常數(shù)的函數(shù)，其中，如其對克勞修斯一莫索提(Clausius-Mossotti)因子尺(co)的影響所示，顆粒和介質(zhì)的介電常數(shù)均為頻率(co)依賴的。有許多使用正、負(fù)DEP操縱和捕捉細(xì)胞和較大(〉l(im)顆粒的范例。新近，隨著能形成更小幾何結(jié)構(gòu)電極的制備方法的發(fā)展，DEP已被用于捕獲大病毒甚至如蛋白質(zhì)和DNA的大分子。我們正使用DEP濃縮直徑不到100nm的顆粒，這是如式2清楚所示的一個(gè)挑戰(zhàn)性的問題，即隨顆粒粒徑降低，需要大大地增大所施加的電場(可能產(chǎn)生電解)和/或降低電極間距及幾何尺寸(其使制備工藝復(fù)雜)。彬，和才法DEP芯片的設(shè)計(jì)一組具有各種幾何結(jié)構(gòu)的叉指電極的設(shè)備被制造。各設(shè)備包括一組鍍在正方形石英芯片上的鉑線，所述芯片的尺寸為25mmx25mmx0.5mm，電極布圖使用常規(guī)的剝離(liftoff)工藝形成，其中，使用光敏聚合物光蝕刻地形成金屬布圖的負(fù)像，之后，使用電子束蒸鍍方法鍍柏、并且通過溶解下面的光聚合物去除過量鉑(圖182)。圖183顯示基本電極圖形和完成的設(shè)備芯片。除線性雙電極布圖外，也制備80了少量螺旋四電極結(jié)構(gòu)；這些可以被用于實(shí)現(xiàn)行波雙向電泳，其中在相位中均勻分隔的四個(gè)AC信號被施與電極以使顆粒沿所述結(jié)構(gòu)步進(jìn)到螺旋的中心。兩種設(shè)置被用于應(yīng)用DEP芯片，一種是芯片被水平放置而另一種中芯片被垂直放置。注意，盡管模擬使用雙芯片結(jié)構(gòu)，但是，最初的試驗(yàn)僅使用單組電極以分別經(jīng)正、負(fù)DEP顯示測試顆粒的吸引和排斥。在水平和垂直的兩種配置中，通過在含電極芯片和平面石英芯片之間夾入125pm厚的硅橡膠墊圏形成流體槽。該設(shè)備被置于兩種類型的夾具之一內(nèi)，并且通過與含電極芯片上的叉指電極連接的金屬墊接觸的銅聘魚夾獲得電通路。使用Hewlett-PackardHP237信號發(fā)生器通過在兩個(gè)電極上施加110V(峰值至峰值)強(qiáng)度、1Hz10MHz頻率的方波產(chǎn)生微球運(yùn)動(dòng)。測試顆粒包括在蒸餾水中懸浮的各種直徑的熒光標(biāo)記的聚苯乙烯微球(Bangs實(shí)驗(yàn)室、在655nm發(fā)光)。在水平配置中，通過用在流體中懸浮的微球填充槽道、施加電場、以及使微球的運(yùn)動(dòng)成像以靜態(tài)模式觀察微球的運(yùn)動(dòng)。在垂直配置中，通過在槽的一端施加少量吸收材料以起管吸作用而產(chǎn)生流體流動(dòng)。使用與具有各種熒光濾片配備的奧林巴斯BX60熒光顯微鏡連接的CCD照相機(jī)捕獲顆粒的圖像，并且在DVD錄像才幾中記錄。潛果該研究的目的是顯示使用DEP定位小顆粒的能力。因而，以正或負(fù)DEP模式評估該設(shè)備的這項(xiàng)能力。在低頻率下，微球顯示正DEP,其中微球向電極定位；隨激發(fā)頻率增加，在某一時(shí)間點(diǎn)，微球從電極表面被釋放，并且開始移動(dòng)離開電極。使用水平配置，我們能夠利用具有5pm線寬的電極顯示2.7nm和0.3pm直徑微球的吸附和排斥，但是，由于測試設(shè)置中芯片被水平放置而從上方觀察的配置，不能確定排斥距離。隨后制造具2pm線寬電極的設(shè)備并以垂直配置測試。潛論使用具2|im線寬的叉指金屬電極，我們能證明300nm和更大顆粒的正、負(fù)雙向電泳移動(dòng)。在負(fù)DEP方案中，顆粒被從電極平面推動(dòng)直至20pm的距離。也使用50nm顆粒顯示負(fù)DEP的作用，但僅有5fim的排斥距離。該研究的最終目的為濃縮直徑小于100nm的顆粒，并且進(jìn)一步能夠?qū)⑵渫苿?dòng)至離開驅(qū)動(dòng)電極適當(dāng)距離，以能夠使顆粒的濃縮面與其它的樣品流體分離。在^t流槽中，至少lOO(im的排斥距離才有助于這種分離，但是，在我們的設(shè)備中，我們能實(shí)現(xiàn)不到20pm的排斥距離。如果我們查看控制有效DEP力的參數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)與電極線寬的立方呈反比。這暗示對于給定驅(qū)動(dòng)電壓和顆粒直徑，線寬減小10倍將得到增大1000倍的DEP力，而排斥距離相應(yīng)增加。^使用先進(jìn)光蝕刻系統(tǒng)可以制備具有0.2pm線寬的電極，而這些設(shè)備使50nm顆粒的濃縮成為可能。冉^C4A^WF的毒素一i^/方法和材料OST-^7VrZ4及E7/c,逾體4這;^銷化在質(zhì)粒pGEX-4T3中有編碼BoNT/AHc和BoNT/EHc的cDNA。根據(jù)廠商的說明，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BL21(DE3)pLys(Invitrogen)中。從隔夜培養(yǎng)物稀釋持(harboring)質(zhì)粒的細(xì)菌，并且生長至OD600約為0.5，加入IPTG達(dá)到400i!M終濃度，然后在30。C繼續(xù)孵育4小時(shí)。收獲細(xì)菌，并且各升重懸在30mL具3(VLbenzonase核酸酶(Novagen)的BugBuster中，并且管在室溫下旋轉(zhuǎn)20分鐘。溶解產(chǎn)物在4。C以21，000RCF離心30分鐘，將溶解蛋白質(zhì)輕倒在用PBS、lmMEDTA平衡的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(AmershamBiosciences)上。漿液在4。C旋轉(zhuǎn)2小時(shí)，并注于20mL—次性柱子(BioRad)上。用PBS/EDTA洗柱子，并且以溶有10mM谷胱甘肽的100mM、pH8.0的Tris洗脫重組蛋白。1/7體積的7XHNa(560mMNaCl，1.4MHepespH7.9,以及抗體包被的微球)被加入到摻有抗原的溶液中。在12分鐘結(jié)合步驟結(jié)束時(shí)，加入190jiL測試培養(yǎng)基，管在》茲體上it置30秒，然后棄去上清。在50|aL測試培養(yǎng)基中重懸微球，加入20pL細(xì)胞，管子旋轉(zhuǎn)5秒以沉淀微球和CANARY細(xì)胞，并且在光度計(jì)上監(jiān)測光輸出。使雜交瘤適應(yīng)雜交瘤SFM培養(yǎng)基(Gibco)+lx非必要氨基酸(Gibco，100|iM丙酮酸鈉和100!iML-谷氨酰胺)。某些雜交瘤最初需要10%血清，但是所有的抗體最終在含0%血清的培養(yǎng)基中產(chǎn)生。在無血清的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的雜交瘤上清液在臨床離心機(jī)中以3700RPM離心，并且上清液通過0.2!im濾器過濾。向上清液中加入lmLPBS平衡的G蛋白瓊脂糖4快速流(ProteinGSepharose4FastFlow(GEHealthcare)),并且在室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)3~4小時(shí)或在4。C緩慢旋轉(zhuǎn)過夜。將樹脂注入一次性柱子中，用PBS清洗，并且lmL用lOOmMKP04pH2.7洗脫的片段被直接加到IOOjiL1MHepespH8.5中。使用NAP-5柱子將緩沖液交換至PBS。與Gf冷^^^Jt炎在50mMNaOAc，pH5.0中清洗微球(DynalDynabeadsG蛋白)。雜交瘤上清液的pH調(diào)至約5.0，BSA被加至0.P/。，并且溶液通過0.2iim濾器過濾。將100(iL的微球加入10mL雜交瘤上清液中，并且管在室溫下旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。孩i球在pH8.0的0.2M硼酸鈉中清洗，并且在lmL含20mMDMP的硼酸鹽中重懸。管子在室溫下旋轉(zhuǎn)30分鐘，加入250jiL的1MTris，pH8.0,并且孵育15分鐘。在PBS+0.05%tritonX畫IOO中洗微球，并且在lmL液體中重懸。對于大多數(shù)試驗(yàn)，每個(gè)CANARY試驗(yàn)使用約0.4|iL的微球。蘭參#艾聯(lián)在偶聯(lián)前，使用Nanosep30KOmega離心濃縮機(jī)將抗體濃縮至~lmg/mL。生物素(磺基-NHS-LC-LC-生物素，Pierce)在PBS中重懸達(dá)到10mM。生物素加入摩爾量超出抗體(在PBS中平tf)20倍，83并且在室溫孵育30分鐘。Tris(pH7.5)被加入達(dá)到lOOmM,并且用PBS交換緩沖液。生物素化抗體以足夠飽和結(jié)合位點(diǎn)(每mg微球20jig抗體)的濃度#皮力。到M-280Dynabeads(Dynal)中，并且在室溫下孵育30分鐘。收集微球，并且在PBS+0.05%TritonX-100中洗滌并儲(chǔ)存。典型地，樣"求被稀釋至其原始儲(chǔ)存濃度的1/10，并且每CANARY試驗(yàn)使用0.4pL的微球。CANARY試驗(yàn)已經(jīng)證明了在檢測病毒和細(xì)菌中的優(yōu)越性能。毒素的檢測提出了不同問題。檢測毒素的困難在于盡管在B細(xì)胞表面上表達(dá)的抗體能夠結(jié)合兩個(gè)毒素分子，但是各毒素分子僅能結(jié)合一個(gè)抗體。這意味著可溶性、單體毒素不能導(dǎo)致抗體被交聯(lián)，結(jié)果不會(huì)啟動(dòng)導(dǎo)致光發(fā)射的細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)?？朔搯栴}的有效方法為在微球上捕獲毒素。然后，這些毒素修飾的微球可以交耳關(guān)CANARY細(xì)胞表面上的多個(gè)抗體，并且刺激光發(fā)射。捕獲微球的使用也促進(jìn)了可溶性蛋白質(zhì)毒素從細(xì)胞不相容溶液(含CANARY細(xì)胞的非特異性刺激因子或抑制因子)轉(zhuǎn)移至CANARY細(xì)胞相容溶液中。該項(xiàng)重要能力極大地?cái)U(kuò)展了CANARY可以潛在地用于斗企測毒素的基質(zhì)的類型。毒素形式根據(jù)試驗(yàn)的目的和毒素試驗(yàn)的成熟度，使用多種類型的肉毒毒素A(BoNT/A)抗原。在E.coli.中產(chǎn)生BoNT/A重鏈(BoNT/Hc)的GST融合。該重組蛋白質(zhì)被用作表達(dá)BoNT/A抗體的細(xì)胞的CANARY細(xì)胞的篩選工具。GST融合使得抗原易于與微球連接、以及能夠?qū)ANARY細(xì)胞進(jìn)行篩選。重組BoNT/EHe被用作對照以證明CANARY細(xì)胞的反應(yīng)是BoNT/A特異性的(抗體不結(jié)合BoNT/E)。然而，GST蛋白質(zhì)具有在溶液中二聚化的特性，因而不是證明CANARY檢測單體蛋白質(zhì)的能力的適當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)。，#Bo/V77好C。該BoNT/A的無毒部分從天然毒素中被分離，并且必須使用抗BoNT/A抗體從溶液中捕獲。這是檢測可溶性蛋白質(zhì)的好的模式，但是BoNT的重鏈部分不像全毒素一樣穩(wěn)定，并且這種不穩(wěn)定性使得難于利用該抗原進(jìn)行靈敏的檢測。重要地，其也未實(shí)際證明檢測活性BoNT/A的能力。5oATZ4。^f吏用購自商業(yè)來源(Metabiologics)的活性BoNT/A進(jìn)行大多數(shù)試驗(yàn)。BoNT/A復(fù)合物。由肉毒桿菌(C/oWnWwmk^w"m^2)產(chǎn)生的BoNT/A與多種其它蛋白質(zhì)復(fù)合。這些相關(guān)的蛋白質(zhì)阻礙一些抗體的結(jié)合，從而有必要證明使用這些抗體研發(fā)的CANARY試驗(yàn)不僅能夠檢測BoNT/A,而且還能夠檢測BoNT/A復(fù)合物。在#大多數(shù)試驗(yàn)使用源自6E10-10、6C2-4和6B2-2雜交瘤的抗體。這些抗體結(jié)合BoNT/A上的獨(dú)立表位。大多數(shù)以下描述的試驗(yàn)使用表達(dá)6B2-2抗體的CANARY細(xì)胞以檢測與微球結(jié)合的6E10-10抗體上捕獲的BoNT/A抗原。其它試-驗(yàn)也4吏用CR1、Raz、和S25抗體，各該抗體在BoNT/A蛋白質(zhì)上結(jié)合3個(gè)單獨(dú)的表位。這些抗體被用于判斷抗體親和性對CANARY試驗(yàn)靈敏度的影響。微碌谷胱甘肽瓊脂糖凝膠被用于捕獲重組BoNT/AHc以在篩選和初始檢測中呈遞于CANARY細(xì)胞。G蛋白包被的微球(瓊脂糖或順磁性)被交聯(lián)以捕獲抗體，并用于在溶液中捕獲可溶性BoNT/A產(chǎn)物以呈遞于CANARY細(xì)胞。鏈霉親和素包被的順磁微球:帔生物素標(biāo)記的抗體覆蓋。這些微球是具有可再生性的，并且因?yàn)樗鼈兪琼槾判缘?，也允許無需離心而進(jìn)行樣品制備(毒素捕獲和微球清洗)。潛^;BoA^TZ4#的試驗(yàn)編碼BoNT/AHc(6B2-2和6E10-10)上不同表位的抗體的基因被克隆，并且在單獨(dú)的B細(xì)胞系中表達(dá)以評估其功能。所得的細(xì)胞系都對與谷胱甘肽瓊脂糖微球結(jié)合的BoNT/AHc-GST融合蛋白質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)。為了測試CANARY細(xì)胞功能，在谷胱甘肽農(nóng)i球上捕獲重組抗原，在測試培養(yǎng)基中清洗微球，并且將捕獲的抗原呈遞給表達(dá)6E10-10抗體的CANARY纟田胞。通過將孩i球結(jié)合的BoNT/AHc-GST與6B2-2抗體一起醉育2.5小時(shí)或過夜能夠使6B2-2CANARY細(xì)胞反應(yīng)被部分消除。在谷胱甘肽微球上捕獲的BoNT/AHc-GST不刺激細(xì)胞，證明CANARY反應(yīng)是通過與抗病的相互作用被激活的，而并非由孩O求或毒素非特異性激發(fā)的。GST蛋白質(zhì)在溶液中二聚化，并且因此不能被用于證明CANARY檢測可溶性單體蛋白質(zhì)的能力。為了顯示從溶液中捕獲可溶性單體蛋白質(zhì)，我們使用從天然BoNT/A(Metabiologics)中純化的BoNT/AHc。6E10-10抗體與G蛋白標(biāo)記的微球偶聯(lián)，并且將這些樣爻球與不同濃度的BoNT/AHc—起賻育。將CANARY細(xì)胞力口入BoNT/AHc修飾的微球，并且混合物離心5秒以共沉淀孩么球和細(xì)胞。捕獲的抗原以800pg(80ng/ml)的表觀靈敏度按照劑量特異性方式有效地激發(fā)CANARY細(xì)胞。該試驗(yàn)的總試驗(yàn)時(shí)間<5分鐘，包括微球結(jié)合、細(xì)胞添加和光輸出測量。然而，在儲(chǔ)存過程中BoNT/AHc聚集使試驗(yàn)靈敏度的精確測量變得困難。未冷凍的BoNT/AHc比曾經(jīng)凍結(jié)的BoNT/AHc產(chǎn)生較高的反應(yīng)。離心的冷凍-解凍BoNT/AHc的上清液甚至顯示更低的活性，表明在冷凍-解凍過程中已經(jīng)形成凝聚物。除了儲(chǔ)藏特性外，批次變異性也影響我們準(zhǔn)確測定靈敏度的能力。因?yàn)樽C實(shí)CANARY試驗(yàn)?zāi)軌驒z測可溶性蛋白質(zhì)是重要的，所以我們典型地測試?yán)鋬鰞?chǔ)存并且在解凍時(shí)進(jìn)行離心以去除凝聚物的BoNT/AHc。如桔汁或水的某些溶液與CANARY試驗(yàn)不相容，因此，必須用測試培養(yǎng)基交換含毒素模擬物的原始溶液。此外，一些基質(zhì)被發(fā)現(xiàn)不僅影響細(xì)胞，也影響通過抗體包被微球?qū)Χ舅氐牟东@。例如，桔汁因?yàn)槠涞蚿H(pH=3.5)而是有問題的。我們的方案是設(shè)計(jì)單緩沖抗原，當(dāng)該單緩沖抗原被加入多種溶液時(shí)，其使pH標(biāo)準(zhǔn)化并且產(chǎn)生最低的鹽濃度以使得能夠特異性捕獲抗原。對于這些試驗(yàn)，我們創(chuàng)造了加入到所有液體中的濃縮緩沖液(7xHNa)以升高鹽到至少80mM終濃度，并且緩沖如桔汁的酸溶液的pH值至約6.5。微球可以儲(chǔ)藏在該緩沖液中，從而，毒素檢測仍僅需向樣品中添加單一溶液(7xHNa+捕獲微球)?？贵w包被的微球在溶液中醉育12分鐘，用測試培養(yǎng)基清洗，并且在CANARY試驗(yàn)中使用。桔汁和PBS-Tx-100中的BoNT/AHc的LOD為80ng/ml，確定為背景的3倍。盡管CANARY試驗(yàn)對桔汁和PBS-Tx-100中的BoNT/AHe的靈敏度與對照相當(dāng)，^f旦是牛奶被證明是抑制性的(約對照的20%),表明必須改變樣品制備以獲得在該基質(zhì)中的理想靈敏度。最初的結(jié)果顯示增加牛奶中的鹽濃度可以提高靈敏度。許多醫(yī)學(xué)相關(guān)的基質(zhì)也已被測試，并且各需要特定的樣品制備方法。所研發(fā)用于檢測鼻腔樣品的方法使樣品在拭子上被收集、修剪掉拭子的桿并將拭子末端置于配置在埃彭道夫管上方的5pm濾筐內(nèi)。加入含BoNT/AHc的測試培養(yǎng)基，給該裝置加蓋并離心。在埃彭道夫管中收集過濾的洗脫液，并且采用上述微球捕獲程序進(jìn)行測試。實(shí)際的和具有BoNT/AHc模擬拭子的信號是非常相似的，表明鼻腔樣品中無抑制因子出現(xiàn)。當(dāng)無抗原(鼻拭子)時(shí)沒有CANARY對鼻拭子的反應(yīng)表明在鼻拭子樣品中沒有非特異性刺激因子存在。Bo7V77^#素和C4A^iy^/試^敏產(chǎn)為了證明CANARY不僅檢測BoNT/AHc毒素模擬物，而且還檢測活性BoNT/A毒素，測試市售的BoNT/A并使用6E10-10微球捕獲的毒素進(jìn)行分析和使用6B2-2CANARY細(xì)胞進(jìn)行檢測。在該測試中的檢測極限為約8ng/ml或80pg毒素，其比BoNT/AHc毒素模擬物提高了約10倍。含16pg毒素(1.6ng/ml)的樣品激發(fā)細(xì)胞反應(yīng)至約高于背景3倍，但是具有不適于目前檢測算法的動(dòng)力學(xué)特征。這種測試靈敏度的提高表明活性BoNT/A毒素在儲(chǔ)存過程保持可溶性，或者抗體與全毒素的結(jié)合好于與重鏈的結(jié)合。在實(shí)際樣品中BoNT/A毒素檢測也被證明。在尿液中的BoNT/A毒素的檢測被進(jìn)行，其中，檢測極限為16ng/ml。CANARY試驗(yàn)對于全血中的BoNT/A的檢測也是有效的。將BoNT/A加入全血中，并且通過聚合物對血進(jìn)行短暫離心以促進(jìn)細(xì)胞與可溶性物質(zhì)分離。將876E10-10微球加入所得上清液中，孵育2分鐘，并且使用6B2-2CANARY細(xì)胞測試。如檢測牛奶中的毒素才莫擬物時(shí)所觀察的，該試-瞼的一全測極限——16ng/mL比使用對照培養(yǎng)基所觀測的靈敏度低約5倍?？赡苁沁@兩種基質(zhì)中的高蛋白質(zhì)濃度抑制溶液中微球結(jié)合抗體和濃度中的BoNT/A之間的特異性相互作用。為提高高蛋白質(zhì)溶液中的靈敏度，測試了添加鹽和非離子清潔劑的情況。鹽(NaCl)、非離子清潔劑(Tween-20或TritonX-100)或兩者的組合被加入到血漿中的48ng/mLBoNT/A中，并且將結(jié)果與添加水對比。添加TritonX-100改進(jìn)了信號，然而添加Tween并沒有。單獨(dú)添加鹽具有更劇烈的影響，將信號強(qiáng)度從1700RLU增加至約4800RLU。向含鹽的樣品中添加清潔劑并未產(chǎn)生相加效應(yīng)。這暗示添加鹽可能降低非特異性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用并且增加BoNT/A結(jié)合抗體包被微球的速率。BoNT/A測試的靈敏度被預(yù)計(jì)依賴于各孩i球上的抗原密度，而抗原密度又依賴于用于捕獲溶液中毒素的微球的數(shù)目。使用大量微球確保了最大捕獲效率，但是如果毒素的濃度低，則在各微球上出現(xiàn)的抗原可能太稀疏以至于不能引起有效的細(xì)胞反應(yīng)。因此，微球數(shù)目和各微球上的抗原密度之間的平衡必須達(dá)到。為了優(yōu)化這些參數(shù)，進(jìn)行了用不同體積的1.6ng/mLBoNT/A測試各種微球濃度的系列試驗(yàn)。在一個(gè)這種試驗(yàn)中，將不同數(shù)目的微球加入到各個(gè)樣品中，并且孵育2分鐘。當(dāng)在小體積中孵育時(shí)，大量的微球激發(fā)細(xì)胞不如小數(shù)目微球激發(fā)細(xì)胞好。這暗示在含少量毒素的樣品中，使用大量微球的捕獲導(dǎo)致極稀疏的抗原分布，以至于不能有效地激發(fā)CANARY細(xì)胞。盡管延長捕獲時(shí)間顯著地提高LOD至0.32ng/ml的BoNT/A，但是，我們也觀察到微球數(shù)目的影響變得更明確。例如，對于在100|iL0.32ng/ml的BoNT/A中孵育過夜的微球，將微球的數(shù)目從300,000降至3，000提高了信號。微球的數(shù)目越少意味著各個(gè)微球?qū)⒕哂性蕉嗟亩舅?，隨微球數(shù)目降低而提高信號。生物素化抗體、改進(jìn)結(jié)合和清洗條件以及優(yōu)化微球數(shù)目的組合導(dǎo)致在6分鐘測試中提高靈敏度至16pg(1.6ng/ml)。16pg的毒素代表由55kg(120lb)的人吸入的LD50的約0.000029(1/34,370)。這約為通過注射的LD50的0.00023和通過攝食的LD50的0.00000029。以該靈敏度水平，試-瞼可以;險(xiǎn)測在34mL液體中存在的約1個(gè)LD50的量。So7V7Z4的趁果盡管與對照相比信號強(qiáng)度稍有降低，但是尿液中摻入的BoNT/A可以被檢測(圖158)。在該試驗(yàn)中，未使用預(yù)處理，并且6E10-10包被的微球被直接加入到摻有BoNT/A的尿液中。與在平行試驗(yàn)中毒素^皮直接稀釋至測試培養(yǎng)基中的3.2ng/mL相比，尿液中的BoNT/A的才企測才及限為16ng/m。CANARY試驗(yàn)對于使用它處所描述的樣品制備方法在全血中篩選BoNT/A也是有效的(圖159)。全血被摻有BoNT/A,并且將血液通過聚合物短暫離心以促進(jìn)細(xì)胞與可溶性物質(zhì)的分離。6E10-10抗體包被的微球被加至所得上清液中，孵育2分鐘，并且使用6B2-2CANARY細(xì)胞測試。該試3全的4企測極限為16ng/mL,約比使用對照培養(yǎng)基觀察到的靈敏度低5倍。該樣品制備方法比先前在無聚合物時(shí)通過離心制備的血漿的試驗(yàn)荻得顯著改進(jìn)。在牛奶和血清中，通過CANARY試驗(yàn)的毒素檢測極限比對照高約5倍。由于在這兩種基質(zhì)中的高蛋白質(zhì)濃度抑制了溶液中微球結(jié)合的抗體和BoNT/A之間的特異性相互作用，因而這是可能的。在努力提高高蛋白質(zhì)溶液的靈敏度的過程中，添加鹽和非離子清潔劑的情況被測試(圖160)，鹽(NaCl)、非離子清潔劑(Tween-20或TritonX-100)或兩者的組合一皮加入到血漿中的48ng/mLBoNT/A中，并且將結(jié)果與添加水的情況對比。添加TritonX-100改進(jìn)了信號，然而添加Tween并沒有。單獨(dú)添加鹽具有更劇烈的影響，將信號強(qiáng)度從1700RLU增加至約4800RLU。向含鹽的樣品中添加清潔劑并未產(chǎn)生相加效應(yīng)。這暗示添加鹽可能降低非特異性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、并且增加BoNT/A結(jié)合抗體包被微球的速率。我們已經(jīng)顯示了CANARY試驗(yàn)?zāi)軌蛴行У貦z測活BoNT/A,但是如果毒素從特定肉毒桿菌菌抹分離，則毒素將與添加的蛋白質(zhì)復(fù)合，產(chǎn)生抗原性差異目標(biāo)物質(zhì)——BoNT/A復(fù)合物。重要的是，CANARY試驗(yàn)以BoNT/A相同反應(yīng)水平檢測BoNT/A復(fù)合物(圖161)。等摩爾量的BoNT/A和BoNT/A復(fù)合物(各5fmo1)被加入到6E10-10包被微球中，并且使用6B2-2細(xì)胞檢測捕獲的毒素。兩者的CANARY反應(yīng)相同，暗示由這些抗體結(jié)合的BoNT/A上的表位沒有被BoNT/A復(fù)合蛋白質(zhì)封閉。我們已經(jīng)選擇致力于研制非?？焖俚臋z測。較長的孵育對于判斷測試的極限是有利的，^旦是對于診斷或檢測目的是不利的。我們發(fā)現(xiàn)對捕荻抗體生物素化并將其連附于鏈霉親和素微球更容易的，并且或多或少地得到更好的結(jié)果。生物素化抗體、改進(jìn)結(jié)合和清洗條件、以及優(yōu)化微球數(shù)目的組合導(dǎo)致在一段時(shí)間內(nèi)改善靈敏度。在lO(iL摻有BoNT/A的可疑溶液的檢測中,靈敏度為16pg(1.6ng/ml)(圖162)。包括添加纟敖球、結(jié)合2分鐘、磁性捕獲和樣i球清洗、細(xì)胞添加及光輸出檢測的總實(shí)驗(yàn)用時(shí)約6分鐘。,g潛總之，我們已研制了使用抗體包被微球捕獲可溶性毒素的肉毒毒素檢測方法。這些毒素修飾的微球被用于將固定毒素呈遞給CANARY細(xì)胞。重要的是，微球也促進(jìn)毒素從任何種類的細(xì)胞不相容基質(zhì)轉(zhuǎn)移至測試培養(yǎng)基中。這使得能夠進(jìn)行血液、尿液、鼻拭子、桔汁、牛奶、水和PBS-Triton中的毒素檢測。某些基質(zhì)導(dǎo)致CANARY測試中反應(yīng)下降，尤其對于那些含有高濃度蛋白質(zhì)的基質(zhì)(血漿和牛奶)。這種抑制可以通過加入鹽以降低非特異性蛋白質(zhì)相互作用而被部分克服。該測試在速度方面已被優(yōu)化，并且可以在6分鐘內(nèi)4全測16pg(1.6ng/ml)BoNT/A。靈敏度似乎依賴于捕獲抗體的親和性，但是使用較高親和性抗體并未改進(jìn)檢測極限。增加微球捕獲步驟的孵育時(shí)間確實(shí)導(dǎo)致更好的靈敏度(不到0.32ng/ml)。即使在困難的基質(zhì)中，測試也能在6分鐘內(nèi)檢測到LD50的小部分的量。C4A^WF試一發(fā)的硬伴矛發(fā)'才才泮+和方法磁性抗原樣￡球和磁性B細(xì)胞系4敖球試驗(yàn)B細(xì)胞結(jié)合的微球使用Dynabeads⑧小鼠PanB(B220),貨號為114-41D，不進(jìn)4亍進(jìn)一步改變。抗原結(jié)合微球根據(jù)廠商說明用捕獲抗體使甲苯磺?；罨?、貨號為142-03的DynabeadsM-280功能化。測試流程在1.5ml管中，將用抗原抗體包被的磁性微球(Dyna1/貨號142-03)與樣品在室溫下一起孵育5分鐘。用磁體將捕獲的抗原和磁性微球向下拖至管的底部。向管中加入B細(xì)胞磁性微球(Dynal/貨號144-41D),并且通過暴露于強(qiáng)稀土磁體10秒將其拖至管的底部。將管置于光度計(jì)內(nèi)，并讀取信號。側(cè)向流帶材料樣品墊；微孔玻璃纖維墊G041/GFCP103000。管吸墊^L孔纖維素吸收樣品墊C082/CFSP173000。捕獲膜Pall0.45|imGH聚丙烯膜(貨號GHP4550001/Pall)方法裝配側(cè)向流帶如下。將0.25英寸x0.25英寸微孔管吸墊放置在包裝帶上。將0.4英寸x0.1英寸的Pall0.45pmGH聚丙烯膜置于管吸墊之上使1/3的膜在管吸墊頂上。將0.25英寸x0.5玻璃纖維濾膜置于PallGH聚丙烯膜。單通道傳感器開發(fā)此處描述了能夠進(jìn)行最佳CANARY試驗(yàn)的被改進(jìn)的單通道石更件。我們采取兩種平行途徑(1)研制能夠旋轉(zhuǎn)和分析CANARY樣品的單一裝置的特別設(shè)計(jì)概念，以及(2)檢測能夠被修改、或優(yōu)選地?zé)o需修改就能夠使用以進(jìn)行單一CANARY測試的COTS光度計(jì)和91小型離心機(jī)。該方法的成果為改進(jìn)CANARY測試方法和性能的廉價(jià)COTS硬件的確認(rèn)。最佳硬件組合包括與配有特制轉(zhuǎn)子的VWR小型離心機(jī)聯(lián)合使用的Berthold檢測系統(tǒng)FB12光度計(jì)，該特制轉(zhuǎn)子能夠以最適合的構(gòu)造旋轉(zhuǎn)多至8個(gè)CANARY樣品。使用單通道傳感器的過程開始為在常規(guī)吊斗微離心機(jī)(如果可能)、或者在VWR小型離心機(jī)中以〉6000RCF預(yù)旋轉(zhuǎn)約2分鐘。向樣品中加入一滴B細(xì)胞，置于小型離心機(jī)內(nèi)，并且旋轉(zhuǎn)5秒。在信號到達(dá)最高之前有足夠的時(shí)間將樣品轉(zhuǎn)移至用于信號讀取和CANARY鑒定的光度計(jì)中。整個(gè)CANARY測試過程可以在3分鐘內(nèi)完成，<吏由單個(gè)使用者操作運(yùn)行的該單通道CANARY傳感器利用平行樣品預(yù)旋轉(zhuǎn)能夠每小時(shí)處理多至25個(gè)樣品。16通道傳感器開發(fā)在其最簡單的形式中，CANARY測量包括在透明管中制備樣品、向管中引入等份特別制備的B細(xì)胞、利用快速離心旋轉(zhuǎn)將B細(xì)胞驅(qū)至管底、以及用光子計(jì)數(shù)傳感器測量管的光輸出。在實(shí)驗(yàn)室中，大多數(shù)CANARY是順序進(jìn)行的，即每次一個(gè)樣品；在自動(dòng)BAWS/CANARY生物氣溶膠鑒定傳感器中，同時(shí)測量四個(gè)樣品，各樣品具有其自己的光采集通道。各光采集通道典型地包括光子傳感器、高壓電源、脈沖鑒別電路和可能的數(shù)字計(jì)數(shù)器。前一系統(tǒng)需要更多時(shí)間，然而后者需要更復(fù)雜(且昂貴)的硬件。降低測量多個(gè)樣品的時(shí)間(同時(shí)使硬件需求最小)的新途徑被成功測試。制造了傳感器試驗(yàn)臺(tái)使其能夠使用單光采集通道同時(shí)測量多達(dá)16個(gè)樣品。該傳感器包括支承有16個(gè)圍繞其圓周水平、均勻分布的1.5ml管子并且由可變速馬達(dá)繞垂直軸驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)子。單固定光子檢測部件(在這里為PMT)被置于轉(zhuǎn)子的平面內(nèi)剛好在管子旋轉(zhuǎn)過程中的軌跡之外。這樣，各個(gè)管順序、反復(fù)地緊密接近PMT,使其光輸出在各次通過時(shí)被采樣。此外，由光源(紅外LED)和檢測器(光電晶體管)組成的光開關(guān)被用于控制檢測到的光子的計(jì)數(shù)和16個(gè)域內(nèi)的數(shù)據(jù)的再組織，各域分別與特定的樣品相關(guān)。單測量包括1、在單獨(dú)的1.5ml管中制備16個(gè)樣品(和/或?qū)φ?；2、向各個(gè)試管內(nèi)引入等份的B細(xì)胞；3、將管安裝于位于暗箱內(nèi)的轉(zhuǎn)子中；4、通過以高RCF(2000g)短暫(5秒)離心旋轉(zhuǎn)將B細(xì)胞定位至管底部；5、在測量過程中(12分鐘)降低轉(zhuǎn)子的速度至60rpm，各管每秒采樣一次；6、產(chǎn)生各個(gè)樣品的光子計(jì)數(shù)的時(shí)間序列用于顯示和/或輸入用于評估的計(jì)算機(jī)算法。旋轉(zhuǎn)的同時(shí)運(yùn)行測試，由測試讀數(shù)分析信號收集特征，以判斷在信號開始重疊前，試驗(yàn)床內(nèi)的16位轉(zhuǎn)子如何能夠被充分填充。隨轉(zhuǎn)子被充分填充，所有的樣品產(chǎn)生具有可以與在單信號通道傳感器內(nèi)觀察的信號相比的信噪比的信號，并且，如果提供足夠的阻隔以限制光的傳送角度，則觀察不到通道之間的發(fā)射光的可檢測的道間干擾(crosstalk)。16通道試驗(yàn)床的數(shù)據(jù)的例子顯示與單管方法相當(dāng)?shù)腖OD。盡管該傳感器被設(shè)計(jì)為測量16個(gè)樣品，但是，雖然取樣的物理大小和統(tǒng)計(jì)最終形成實(shí)際的限制，更多樣品數(shù)目也是可能的。便攜式16通道原型傳感器的設(shè)計(jì)中包含旋轉(zhuǎn)形式。該設(shè)計(jì)的最初目的是在最長尺寸不到12英寸的小型自主便攜裝置中引入CANARY測試的旋轉(zhuǎn)和讀取所必須的硬件。此外，還制定規(guī)則以確保能量消耗足夠低，以使電池能夠包含在用于電池供電運(yùn)行的范圍內(nèi)。通過將傳感器組件制成不透水和不透光的小COTS運(yùn)送箱、以及通過使用能夠利用24VDC電源旋轉(zhuǎn)的較小馬達(dá)和控制器實(shí)現(xiàn)這些目的。手持傳感器開發(fā)簡化測試開發(fā)以臨床、即時(shí)和前線部署應(yīng)用為目的的緊湊型手持傳感器是受到特別關(guān)注的。我們已致力于使替代須'j試方法的操作能夠減少或去除離心步驟的需求，因?yàn)殡x心步驟目前是能量消耗和儀器復(fù)雜的主要原因。我們實(shí)驗(yàn)性地評估了多種采用降低離心需求、微流通道、側(cè)向流裝置、過濾、或磁性微球捕獲的測試形式的途徑。在這些途徑中，以下較詳細(xì)地描述離心需求的降低、側(cè)向流裝置的使用和磁性微球捕狄。鼻^",瓶溥心,4f的標(biāo)^艱式。已觀察了無離心步驟時(shí)高濃度抗原的反應(yīng)信號，因此，為了達(dá)到性能平衡，我們進(jìn)行了使用不同離心設(shè)置的系列試驗(yàn)。試驗(yàn)表明減少離心和測試次數(shù)(從每次試驗(yàn)3分鐘至每次試驗(yàn)1分鐘)將使靈敏度降低約1個(gè)數(shù)量級。#/^7^形4'。我們已經(jīng)在利用管吸和過濾材料完成樣品流體輸送和抗原定位的設(shè)備中完成了CANARY測試性能而無需離心。在圖184和圖185中顯示了該設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)和證明其定位孢子大小的顆粒的能力的圖片。圖186顯示從使用相同抗原和細(xì)胞樣品的標(biāo)準(zhǔn)離心測試和側(cè)向流測試所得的CANARY信號。雙f磁'^^微碌^/試。我們已經(jīng)完成了利用兩套磁性孩i球的測試。一套是CANARYB細(xì)胞特異性的，而另一套是特定抗原特異性的。在圖187中，使用相同B細(xì)胞和抗原稀釋系列，標(biāo)準(zhǔn)CANARY測試與雙重磁性微球測試并行。鼠疫耶爾森氏菌特異性的磁性微球與鼠疫耶爾森氏菌劑的稀釋系列混合5分鐘。5分鐘后，磁性微球與任何結(jié)合的鼠疫耶爾森氏菌一起被拖至測試管底部，并且，去除上清液。然后，將^f茲性標(biāo)記B細(xì)胞加入樣品中，并且拖至管底。迄今，用^1性微:球定位抗原和B細(xì)胞已證明提供了與離心類似的靈敏度。手持傳感器硬件開發(fā)手持傳感器硬件研制開發(fā)首先設(shè)計(jì)能夠在無離心時(shí)進(jìn)行的單CANARY測試的筒。該筒被設(shè)計(jì)為含有在其尖部具有小但強(qiáng)的磁體的拭體、和與磁性微球連接的B細(xì)胞嚢(圖188)。在使用拭體對表面采樣后，其將被引入含B細(xì)胞的嚢中，并且磁體將微球結(jié)合的B細(xì)胞吸引至拭體表面上的抗原。然后，整個(gè)筒將滑入特別改制的電池供電的光度計(jì)中以記錄光發(fā)射。該手持傳感器可以在野外使用以判斷人或表面暴露于特定病原體。該設(shè)計(jì)的基本原理基于多種因素。通過使用磁體將微球結(jié)合的B細(xì)胞吸引至液體樣品中的抗原(通過離心制備的)，我們已證實(shí)了用磁性微球代替離心的能力。我們也已經(jīng)顯示B細(xì)胞可以以嚢包裝，如其在筒內(nèi)那樣，以及或冷凍數(shù)周或在室溫保藏48小時(shí)而無靈敏度損失。最后，盡管磁體對光電倍增管可能有不良影響，但是我們已能夠顯示磁性拭體和光度計(jì)內(nèi)的光電倍增管之間的距離可被調(diào)整以防止這些不良影響。最初的試-瞼已顯示無抗原時(shí)祐:吸引至球形釹磁體的微球結(jié)合B細(xì)胞發(fā)射瞬時(shí)光信號。這最可能是由于細(xì)胞上的機(jī)械應(yīng)力。確定了多種可能的補(bǔ)救方法，包括使用較弱磁體(釹磁體是非常強(qiáng)的)、"調(diào)諧"磁體(在拭體尖端處的磁性材料，被進(jìn)一步遠(yuǎn)離拭體內(nèi)安裝的釹磁體磁化)和可縮回》茲體(其在B細(xì)胞吸引到拭體表面后可以被立即移開)。磁操控和處理的復(fù)雜性抬高了操作成本，因而消除這種復(fù)雜性降低了消耗。將磁性樣品和細(xì)胞操控所需的部件轉(zhuǎn)換到手持讀取設(shè)備中增加很少的設(shè)備總成本。此外，該途徑使測試可以在COTS樣i離心管內(nèi)進(jìn)行，并且確保了最大靈敏度和可靠性?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)了具有可本身完成磁性測試操作的特征的手持光度計(jì)。光傳感器和支持電子設(shè)備基于那些在由BerholdDetectionSystems制造的、市售可得的光度計(jì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的裝置，該制造商還生產(chǎn)安裝在單通道CANARY傳感器內(nèi)的COTS光度計(jì)。所得設(shè)計(jì)如圖189所示。基于該設(shè)計(jì)的完整傳感器如圖190所示。手持CANARY傳感器(圖190)的特征為光電陰極距離測試管的底部<lmm定位的PMT、具有4妄觸墊的讀耳又屏、可充電的電池組和滑動(dòng)樣品門。樣品門含有稀土磁體，該稀土^茲體^皮定位以使如圖189所述的管插入導(dǎo)致捕獲的目標(biāo)物質(zhì)和^f茲性標(biāo)記B細(xì)胞共同定位。該測試程序首先向樣品中加入磁性微球、然后混合并孵育5分鐘。然后，將樣品/微球懸浮液在門上的磁性管支架內(nèi)放置1分鐘以在管底部定位捕獲的目標(biāo)物質(zhì)。已去除了目標(biāo)物質(zhì)的樣品被移走、并用含B細(xì)胞的測試緩沖液替代，并且將管送回磁性支架。5秒鐘后，將管置于門上的讀:f又位置，門關(guān)閉，并且記錄PMT信號。傳感器的遺傳工程化B細(xì)胞的系統(tǒng)。我們使用這些細(xì)胞進(jìn)行的測試證明了已知速度和靈敏度(在不到3分鐘內(nèi)，〈50顆粒的滅活鼠疫耶爾森氏菌，對于實(shí)驗(yàn)室樣品具有0.4%的錯(cuò)誤警報(bào)率)的最佳組合，并且因?yàn)锽細(xì)胞是可以自我復(fù)制的，因此，材料的成本極低。除24種我們已制備的包括裂谷熱(RiftValleyFever)、登革熱病毒(Denguevirus)和其它對臨床診斷意義重大的遺傳工程化B細(xì)胞系外，我們已經(jīng)產(chǎn)生了其特異性可以在數(shù)天而不是數(shù)月內(nèi)被工程化的CANARY細(xì)胞系。我們已經(jīng)開發(fā)了用于臨床相關(guān)樣品的5分鐘測試，顯示了從鼻拭子中檢測50cfu炭疽芽胞桿菌(S力W/7rac^)孢子、在尿液中4全測到500沙眼衣原體(CUrac/7om"to)EB、以及檢測到1000cfu鼠疫耶爾森氏菌/mL全血。我們也已證明通過在單個(gè)試驗(yàn)中組合多達(dá)3種細(xì)胞系、或者通過工程化對不只一種病原體反應(yīng)的細(xì)胞，CANARY測試可以被多重化。可選擇地，我們已顯示了發(fā)射不同波長的光的B細(xì)胞的制備，使得能在兩種或多種病原體之間進(jìn)行區(qū)分的單一測試成為可能。我們已將CANARY的能力延伸至包括蛋白質(zhì)毒素，證明在6分鐘的測試內(nèi)檢測少至16pg(1.6ng/mL)的肉毒毒素A。16pg的毒素代表55kg(120lb)的人吸入LD50的約0.000029(1/34,370)。這約為注射LD50的0.00023和才聶食LD50的0.00000029。以該7Jc平的靈敏度，該測試可以;險(xiǎn)測在34升液體中出現(xiàn)的約1個(gè)LD50的量。該靈敏度是否足以使用病人的血清樣品診斷BoNT/A是不清楚的(缺少關(guān)于血清濃度的公開數(shù)據(jù))，但是對于食品污染、氣溶膠化物質(zhì)或吸入暴露(鼻拭子)當(dāng)然是極好的篩選方法。盡管^^用多片COTS設(shè)備可以以單通道形式進(jìn)行CANARY測試，但是我們已開發(fā)了每小時(shí)可以處理約100個(gè)樣品、同時(shí)保持細(xì)菌或大病毒的50cfu/pfu的最佳LOD的具整合旋轉(zhuǎn)馬達(dá)和PMT的16通道傳感器。我們也研制了利用非離心雙磁性途徑的手持傳感器。基于CANARYB細(xì)胞的生物傳感器利用了用于病原體筌定的高度發(fā)展的系統(tǒng)，其提供了多種好于其它鑒定技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。利用CANARY，可能在包括樣品制備的約5分鐘內(nèi)提供鑒定，并且，利用那些足夠在微離心機(jī)內(nèi)被濃縮的大病原體，我們已證實(shí)接近PCR的96靈敏度水平。相反，當(dāng)前技術(shù)水平的免疫測試需要至少14分鐘，并且具有較高的檢測極限(6x104cfu或6x106pfu)。盡管PCR是極靈敏的U5cfu)、高度特異性且具有已降低擴(kuò)增和信號檢測時(shí)間的喜人技術(shù)突破，但是該試驗(yàn)需至少7分鐘(但典型地為2030分鐘)，不包括提取和純化DNA所需時(shí)間。從如CANARY的纟支術(shù)受益的應(yīng)用領(lǐng)域包括對于治療的復(fù)診率低、但社會(huì)影響大的疾病(如性傳4番疾病)的即時(shí)診斷。此外，CANARY對生物戰(zhàn)爭襲擊后鼻4式子的癥狀前檢測、進(jìn)口港的農(nóng)業(yè)病原體的檢測、或易腐爛食品供給的篩查是有價(jià)值的。事實(shí)上，CANARY是一種在任何時(shí)間緊迫情況下能檢測和識別高度傳染病原體的快速、靈敏方法。細(xì)胞工程化和測試方法實(shí)施例A、細(xì)力包工程化方法M12g3R細(xì)胞在37°C、在5。/。C02的濕潤空氣中、在補(bǔ)充有10%胎牛血清、lmM丙酮酸鈉、2mML-谷氨酰胺、lOO(iM非必須氨基酸、50[iM2-巰基乙醇、50嗎/ml鏈霉素和50U/mL青霉素、250ng/ml兩性霉素B(LifeTechnologies)的RPMI1640中維持。用pCMV.AEQ.IRES.NEO通過電穿孑L(270V,950jiF)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并且在lmg/mlG418中選擇2周。篩選對抗IgM反應(yīng)的G418抗性克隆。那些當(dāng)表面IgM交聯(lián)時(shí)具有最大光子發(fā)射增加的克隆被用于后續(xù)轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生對特定病原體特異性的B細(xì)胞系。通過與輕、重鏈的表達(dá)載體、以及與編碼賦予。票呤霉素抗性基因的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染(通過電穿孔)實(shí)現(xiàn)具有工程化特異性的抗體的表面表達(dá)?；谄鋵乖姆磻?yīng)選擇。票呤霉素抗性池和克隆。輕鏈表達(dá)載體VKExpress包括處于人延伸因子-la(EF-la)啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)(MCS)的人k基因下游的恒定區(qū)。通過修飾pDisplay(Invitrogen)、保留巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列、但是用鼠IgM的膜結(jié)合恒定區(qū)的基因取代血小板源生長因子(PDGF)受體跨膜域、并且去除MCS兩側(cè)的標(biāo)簽獲得重鏈表達(dá)載體。使用PCR將適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)加入到抗體可變區(qū)，并且在克隆至表達(dá)構(gòu)建體之前所有PCR產(chǎn)物的序列都被確認(rèn)。通過利用隨機(jī)寡核苷酸引物的反轉(zhuǎn)錄(RT)和PCR從cDNA或雜交瘤中克隆用于產(chǎn)生重組抗體的可變區(qū)。根據(jù)廠商的說明，利用Trizol試劑(LifeTechnologies)才是耳又RNA,并且4吏用Retroscript試劑盒(Ambion)進(jìn)行第一鏈合成。使用被設(shè)計(jì)為在5，端與輕或重鏈[S.T.Jones和M.M.Bendig,Bio/Technology9，88(1991)]的前導(dǎo)序列退火、并且在3'端與鼠k基因或IgG2的恒定區(qū)退火的引物組完成PCR。5、/,FAffi)r的蘭務(wù)發(fā)^B細(xì)應(yīng)^A:制備用pCMV.AEQ.IRES.NEO質(zhì)粒和識別FMDV的A12才朱的重組抗體的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的M12g3R細(xì)胞系用于如下發(fā)光測試在第一天解凍細(xì)胞。解凍后24小時(shí)細(xì)胞的制備對于最大活性和可靠性是關(guān)鍵的。冷凍/解凍步驟將B細(xì)胞的反應(yīng)提高100倍之多。在第二天，106個(gè)細(xì)胞在室溫下、在被箔遮蓋的含50|iM腔腸素(MolecularProbes,尤金，俄勒岡)的測試培養(yǎng)基[不依賴C02的培養(yǎng)基，10%FBS、50嗎/ml鏈霉素、50U/m青霉素、和250ng/mL兩性霉素B(LifeTechnologies)]內(nèi)孵育2小時(shí)，清洗兩次，并且用測試培養(yǎng)基以5x105個(gè)細(xì)胞/mL的終濃度重懸。將細(xì)胞在1.5ml的微離心管內(nèi)、在室溫下保持離心過夜，并且1520小時(shí)后進(jìn)行測試。對于測試，將25(iL細(xì)胞與抗原(5|liL濃度為1.4x108pfu/ml的wtA12RMC35菌抹、10pL濃度為7.5x107pfu/ml的A12突變體，B2PD.3)混合，并且在光度計(jì)(LumatLB9507,PerkinElmer)中測量反應(yīng)。C、炎^^,和義病毒的蘭參發(fā)'^^/試傳感器設(shè)備和方法可以被用于快速4全測細(xì)菌以及病毒病原體。對細(xì)胞系進(jìn)行工程化以應(yīng)答細(xì)菌(土拉熱弗朗西斯氏菌)，兔熱病的病源物質(zhì)。然而，4吏用與FMD和VEE病毒相同的方案^r測時(shí)，信號'隄而且?guī)缀跖c背景難以區(qū)別，暗示B細(xì)胞和抗原之間的低相互作用速率(O秒預(yù)旋轉(zhuǎn)/0秒旋轉(zhuǎn))。先前用抗原-微球模擬物進(jìn)行的試驗(yàn)已經(jīng)表明通過濃縮抗原和B細(xì)胞可以增加靈敏度和速度(未顯示數(shù)據(jù))，因而重新構(gòu)造光度計(jì)以包含位于光電倍增管(PMT)上方的離心^/L。當(dāng)抗原物質(zhì)和細(xì)胞被混合到一起、然后通過離心5秒鐘被濃縮時(shí)，信號提98高，并且反應(yīng)更快(0秒預(yù)旋轉(zhuǎn)/5秒旋轉(zhuǎn))。當(dāng)在加入細(xì)胞之前離心較慢沉降的土拉熱弗朗西斯氏菌(60秒預(yù)旋轉(zhuǎn)/5秒旋轉(zhuǎn))時(shí)，觀察到最佳結(jié)果。這種形式確保了在短時(shí)間內(nèi)大量細(xì)胞與抗原發(fā)生物理接觸，從而造成靈敏度和速度的大幅改進(jìn)。在測試方案進(jìn)一步優(yōu)化后，現(xiàn)在，我們能夠不到3分鐘內(nèi)(包括預(yù)旋轉(zhuǎn)抗原所用時(shí)間)檢測到少至60集落形成單位(cfu)的土拉熱弗朗西斯氏菌，但是對于滅活的土拉熱弗朗西斯氏菌未見反應(yīng)，土拉熱弗朗西斯氏菌為導(dǎo)致瘟疫的細(xì)確認(rèn)該檢測極限(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，傳感器設(shè)備顯示出在檢測涉及7個(gè)數(shù)量級的濃度時(shí)的大的檢測范圍。如上所述制備B細(xì)胞。50|iL含標(biāo)示量的鼠疫耶爾森氏菌或土拉熱弗朗西斯氏菌的才羊品以6500xg離心60秒，然后加入20pL纟田月包，并且在離心光度計(jì)中再旋轉(zhuǎn)5秒。用HamamatsuHC-125光電倍增管檢測光子，并且用斯坦福研究系統(tǒng)SR400門控光子計(jì)數(shù)器(StanfordResearchSystemsSR400GatedPhotonCounter)監(jiān)測4言號。核酸檢測實(shí)施例表達(dá)地高辛抗體的發(fā)射體細(xì)胞的特征編碼抗地高辛抗體的質(zhì)粒(Daugherty等(1998)ProteinEngineering11(9):825-832)被引入發(fā)射體細(xì)胞中，并且使用與地高辛化學(xué)偶聯(lián)的蛋白(BAS)(Dig-BSA)篩選這些細(xì)胞。選擇12個(gè)獨(dú)立池，得到1224個(gè)獨(dú)立細(xì)胞系。第一個(gè)試驗(yàn)測試這些細(xì)胞是否能夠;險(xiǎn)測DNA交聯(lián)的地高辛抗原(Dig-DNA)。三種類型的市售Dig-DNA用于測試與Dig抗體表達(dá)CANARY細(xì)胞的反應(yīng)性(圖26A~C):每20個(gè)堿基對連有一個(gè)地高辛的質(zhì)粒DNA(圖26A);每200個(gè)堿基連有地高辛的DNA分子量標(biāo)志物(圖26B);以及各末端連接一個(gè)的地高辛的DNA分子量標(biāo)志物(圖26C)。這些標(biāo)準(zhǔn)物中的每一種激發(fā)發(fā)射體細(xì)胞至不同程度，其中最靈敏反應(yīng)為對Dig標(biāo)記的質(zhì)粒DNA的反應(yīng)。平均相隔20石咸基間隔的抗原比相隔200個(gè)^咸基間隔的抗原激發(fā)細(xì)胞強(qiáng)100倍(基于每個(gè)地高辛，而不是基于每微克DNA)的事實(shí)暗示了200個(gè)堿基對于激發(fā)理想的反應(yīng)距離太大。為了激發(fā)導(dǎo)致4丐釋i文和水母發(fā)光蛋白光發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)，相鄰抗體必須足夠近地固定以引發(fā)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。也注意到就在光輸出才企測之前進(jìn)行的離心——其為使用常規(guī)CANARY檢測可溶性和不溶性抗原的慣用手段，可能實(shí)際降低CANARY對可溶性Dig-DNA抗原的靈敏度。在所示試驗(yàn)中(圖27A和27B),通過DNA溶液離心細(xì)胞似乎將檢測極限降低了將近IO倍。該結(jié)果可能反應(yīng)了DNA檢測和其它非沉淀抗原的檢測之間的差異。使用發(fā)射體細(xì)胞檢測雜交寡核苷酸探針該試-驗(yàn)設(shè)計(jì)為才企測地高辛標(biāo)記(Dig-lageled)的探針與耙DNA的雜交。用于這些試驗(yàn)的靶DNA源自噬菌體pBluescriptII。該3100個(gè)石咸基對長的環(huán)形噬菌體可以被誘導(dǎo)生成雙鏈DNA(dsDNA)或兩種單鏈DNA(ssDNA)之一。該兩種ssDNA鏈被稱為(+)鏈或(-)鏈。設(shè)計(jì)了特異性結(jié)合(+)鏈的10個(gè)地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>寡核苷酸以其沿pBluescript噬菌體DNA的位置順序^皮編號。對于每一個(gè)顯示了寡核苷酸DNA序列、在噬菌體上該序列的位置、和該寡核苷酸的解鏈溫度(Tm)(結(jié)合親和力的近似值)。這些寡核苷酸的Tm的小范圍說明他們每一個(gè)都具有類似的結(jié)合特征。這些寡核苷酸的每一個(gè)都具有與第一個(gè)殘基連接的地高辛(Dig)分子，并且各個(gè)具有相當(dāng)?shù)陌蠨NA結(jié)合特性，如其類似的計(jì)算解鏈溫度(Tm)所反映的。該組10個(gè)地高辛標(biāo)記寡核苷酸與靶DNA的(+)鏈的雜交產(chǎn)生了每20個(gè)堿基具有一個(gè)Dig分子的雙鏈DNA延伸200堿基。質(zhì)粒的其余2900個(gè)堿基保持單鏈。該固定的地高辛抗原的集合交聯(lián)發(fā)射體細(xì)胞表面上的地高辛抗體，并且激發(fā)光產(chǎn)生。第11個(gè)寡核苷酸(NEG3)為對照。設(shè)計(jì)NEG3直接與3號寡核苷酸結(jié)合，產(chǎn)生在各端具有單Dig的20個(gè)核苷酸長的dsDNA短片段。表達(dá)地高辛抗體的發(fā)射體細(xì)胞能夠檢測80千萬億分之一摩爾的輸入寡核普酸(圖28)。該對照證明選擇的雜交條件至少足以支持在該Tm范圍內(nèi)的兩個(gè)寡核苷酸的結(jié)合。更重要地，該對照證明在20個(gè)堿基的互補(bǔ)DNA之間的結(jié)合是足夠強(qiáng)以交聯(lián)抗體和從發(fā)射體細(xì)胞引發(fā)信號。寡核苷酸-寡核芬酸雜交發(fā)生極快(圖29)。將寡核苷酸NEG3加入雜交液中，隨后加入01igo3。立即在培養(yǎng)基稀釋該溶液，加入發(fā)射體細(xì)胞，并且將反應(yīng)物置于光度計(jì)中(從加入01igo3起消耗的時(shí)間為15秒)。這種簡化的雜交方案沒有劇烈影響試驗(yàn)的靈敏度(比較圖29和圖28)。其次，多Dig標(biāo)記的寡核香酸與單鏈DNA靶雜交。測試該復(fù)合體激發(fā)發(fā)射體細(xì)胞的能力。圖30顯示了不同濃度的Dig-寡核苷酸探針組與給定量的ssDNA的一系列雜交。在該試驗(yàn)中產(chǎn)生最好信號的ssDNA:寡核苷酸探針的比例為1:2至1:4之間。在具有較高濃度的探針的情況下，未結(jié)合的Dig-標(biāo)記的寡核苷酸表現(xiàn)出抑制信號。在這些試驗(yàn)中，0.63pmole的寡核苷酸在許多測試條件下工作良好。劑量反應(yīng)曲線給出約50ng或約50fmole的單鏈DNA的檢測極限(圖31)。重要的是注意到在這些試驗(yàn)中的任一個(gè)中都未沖全測到(-)鏈DNA,表明Dig-標(biāo)記的寡核普酸的雜交和隨后的發(fā)射體細(xì)胞發(fā)出信號是依賴于靶DNA序列的。溫度和緩沖液組分影響Dig-寡核苷酸與靶DNA的雜交。在47°C和51。C之間、在PBS(圖32A)或TBS(圖32B)中雜交給出最高反應(yīng)。在較高或較低溫度下進(jìn)行的雜交降低信號的強(qiáng)度。緩沖液組分的改變將明顯影響理想雜交溫度。耙DNA捕獲生物素標(biāo)記的寡核普酸與鏈霉親和素包被的磁性或非磁性微球的表面結(jié)合。設(shè)計(jì)這些"捕獲"寡核苷酸以從遠(yuǎn)離Dig標(biāo)記的寡核苷酸的位置處的位置結(jié)合靶DNA。靶DNA與可沉淀的載體的結(jié)合將允許在加入發(fā)射體細(xì)胞之前更大量的清洗DNA,因而提高測試的靈敏度。靶DNA沉淀的一種策略如圖33所示。在該方案中，生物素標(biāo)記的捕獲寡核苷酸粘附到鏈霉親和素包被的聚苯乙烯或磁性微球上。地高辛標(biāo)記的寡核香酸與靶雜交，并且通過離心或施加^茲場沉淀復(fù)合體。然后，用微球重懸和沉淀發(fā)射體細(xì)胞，并且將反應(yīng)管置于光度計(jì)內(nèi)。沉淀對檢測靶DNA的影響如圖34所示。與其中DNA未被沉淀的典型結(jié)果相比，在此情況下LOD被提高至高的阿托摩爾(attomole)范圍。加入市售封閉試劑(RocheAppliedScience,貨號1096176)進(jìn)一步改進(jìn)信號。圖35顯示在雜交/捕獲步驟過程中加入不同濃度的封閉試劑的結(jié)果。在該試驗(yàn)中，加入1%至10%之間的封閉試劑才是高了測試靶在所有濃度下的信號與背景比率。Fc受體發(fā)射體細(xì)胞Fc受體為結(jié)合抗體或免疫復(fù)合物的膜表達(dá)蛋白家族。其在包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的多種造血細(xì)胞上表達(dá)。存在多種Fc受體的亞類，包括為可溶性抗體的高親和性結(jié)合物的Fey受體I(FcyRI)。FcyRI結(jié)合免疫球蛋白G(IgG)的恒定區(qū)(Fc部分)而空下該抗體的抗原結(jié)合區(qū)。由特異性抗原導(dǎo)致的抗體結(jié)合受體的交聯(lián)啟動(dòng)刺激鈣釋放的信號通路。人巨謹(jǐn)細(xì)胞系U937含有內(nèi)源FcyRI。如圖36A所示，用IFNy處理這些細(xì)胞增加了FcyRI的表達(dá)。用4丐離子載體離子霉素處理這些細(xì)胞表明，用水母發(fā)光蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞產(chǎn)生功能性水母發(fā)光蛋白。如圖36B所示，這導(dǎo)致激發(fā)水母發(fā)光蛋白發(fā)射光的快速且短暫的釣上升。然后，測試U937,以判斷是否水母發(fā)光蛋白被通過Fc受體交聯(lián)引發(fā)的鈣升高激發(fā)。U937細(xì)胞與人IgG在室溫下孵育15分鐘。清洗細(xì)胞以去除未結(jié)合的IgG,并且用羊抗人IgG處理。如圖36C所示，觀察到了鈣的快速升高。試驗(yàn)證明U937可以被快速工程化以應(yīng)答多種病原體或模擬物。U937細(xì)胞用IFN(200ng/ml)處理24小時(shí)以增加內(nèi)源FcyRI的表達(dá)，并且被制備用于發(fā)射體細(xì)胞測試。將細(xì)胞與以下抗體一起孵育鼠抗-炭疽桿菌孢子(圖37A)、兔多克隆抗炭疽桿菌孢子(圖37B)、鼠抗土拉熱弗朗西斯氏菌(圖37C)、或鼠抗枯草芽孢桿菌(圖37D)。然后，細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)測試中使用，其中它們用單克隆抗體檢測少至1000cfu的炭疽芽胞桿菌孢子、用兔多克隆抗體檢測到少至10，000cfu的孢子、以及10，000cfu土拉熱弗朗西斯氏菌和1000cfu枯草芽孢桿菌。下一組試驗(yàn)證明測試的特異性由使用的抗體決定。U937細(xì)胞與鼠抗土拉熱弗朗西斯氏菌抗體一起孵育，并且測試其對105cfu炭疽桿菌孢子的反應(yīng)。如圖38A所示，細(xì)胞未對105cfu的炭疽芽胞桿菌孢子反應(yīng)，但對106cfu土拉熱弗朗西斯氏菌產(chǎn)生反應(yīng)。可選擇地，如圖38B所示，用鼠抗炭疽桿菌孢子抗體負(fù)載的細(xì)胞未對土拉熱弗朗西斯氏菌反應(yīng)，但對106cfu的炭疽芽胞桿菌孢子產(chǎn)生反應(yīng)。此外，如圖38C所示，在缺少土拉熱弗朗西斯氏菌抗體時(shí)，細(xì)胞未顯示對106cfu土拉熱弗朗西斯氏菌的任何反應(yīng)。CANARY:放射學(xué)檢測CANARY儀器也可以被用于檢測放射物質(zhì)。通過加入閃爍液代替B細(xì)胞、并且測量閃爍液響應(yīng)放射性衰變發(fā)射的光進(jìn)行放射性測量。CANARY硬件已顯示檢測a、|3、和y源的信號，并且這些測量比得上使用基于實(shí)驗(yàn)室的閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行的測量(圖163)。在該試驗(yàn)中，等量的各種類型的發(fā)射體被加入市售、水性閃爍液中?；蝿?dòng)試管以混合，并且置于商用閃爍計(jì)數(shù)器或常規(guī)臺(tái)式CANARY光度計(jì)內(nèi)。使用與常規(guī)CANARY測試相同的軟件、在相同的便攜式計(jì)算機(jī)上監(jiān)測光輸出。CANARY硬件的反應(yīng)與商用閃爍計(jì)數(shù)器的反應(yīng)極相似。由于一個(gè)傳感器可以被設(shè)置成能夠檢測各種基質(zhì)(空氣、液體、表面擦拭物、粉末等)中的所有化學(xué)、生物、放射、核、以及爆炸(CBRNE)物質(zhì)，因此該能力(加上化學(xué)和爆炸物檢測)使CANARY傳感器具有極廣泛地用途。參見圖163,分析等量的覆蓋所有三種發(fā)射體類型(cc、(3、和y)的各種放射物質(zhì)。CANARY的反應(yīng)比得上商用的基于實(shí)驗(yàn)室的儀器。^r測化學(xué)物質(zhì)和爆炸物的其它方法背景細(xì)胞周質(zhì)結(jié)合蛋白用于化學(xué)戰(zhàn)劑的化學(xué)物質(zhì)和/或爆炸物(此處也稱為"CWA/E")對于CANARY來說太小而不能通過直接的抗體結(jié)合檢測。然而，細(xì)菌被適當(dāng)?shù)匮b備以檢測和識別營養(yǎng)物質(zhì)，其中許多為在CWA/E尺寸范圍內(nèi)的小化學(xué)物質(zhì)。CANARY可以利用部分細(xì)菌營養(yǎng)物質(zhì)4全測途徑，并且#皮改變以;險(xiǎn)測CWA/E。細(xì)菌是能動(dòng)的生物體，并且因而主動(dòng)向營養(yǎng)物質(zhì)移動(dòng)。為了確定營養(yǎng)物質(zhì)的位置，細(xì)菌利用細(xì)胞周質(zhì)結(jié)合蛋白(PBP)以監(jiān)測其環(huán)境。該P(yáng)BP家族具有許多成員，其中每一個(gè)都結(jié)合特定營養(yǎng)物質(zhì)。通過X射線晶體照相術(shù)，研究人員證明該蛋白質(zhì)類似于維納斯捕蠅草(Venus'Flytrap)，包括2個(gè)通過鉸鏈連接的裂片。營養(yǎng)物質(zhì)在2個(gè)裂片之間形成的口內(nèi)結(jié)合，并且響應(yīng)于營養(yǎng)物質(zhì)在蛋白質(zhì)的"口"中的結(jié)合，所述蛋白質(zhì)閉合(更精確地說，其平衡狀態(tài)改變，從而當(dāng)存在目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)時(shí)，其主要處于閉合構(gòu)象)。該戲劇性的形狀改變被用于引導(dǎo)細(xì)菌朝向營養(yǎng)物質(zhì)的移動(dòng)。這些和其它結(jié)構(gòu)研究表明PBP使用相對少的氨基酸以實(shí)際結(jié)合其目標(biāo)物質(zhì)。通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)，人們可以預(yù)知如何使這些氨基酸突變從而使PBP結(jié)合完全不同于其原始目標(biāo)的化學(xué)物質(zhì)，如爆炸性TNT、104索曼模擬PMPA(頻哪基曱基膦酸)和神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(Allert等，A^/.101:7907-7912(2004);Looger等，Computationaldesignofreceptorandsensorproteinswithnovelfunctions.AW""423:185-190(2003))。大量的這些突變PBP已經(jīng)在細(xì)菌中產(chǎn)生，并且顯示出對其新的目標(biāo)物質(zhì)的牢固地且特異性的結(jié)合。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以設(shè)計(jì)產(chǎn)生高親和性CWA/E結(jié)合蛋白。如果需要，該設(shè)計(jì)可以以多種不同親本PBP開始，計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)所有這些PBP都與給定目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合、并且測試各獲得的親和性。例如，選擇3種不同PBP作為開發(fā)TNT結(jié)合蛋白的起點(diǎn)阿拉伯糖-結(jié)合蛋白(ABP)、組氨酸-結(jié)合蛋白(HBP)和核糖-結(jié)合蛋白(RBP)。公開的報(bào)告顯示單克隆抗體可以容易地被設(shè)置成抗HBP的閉合(目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合)形式(Wolf等，丄Ao/.C/7纖.269:23051-23058(1994);Wolf等，/腸/.C7z艮271:21243-21250(1996))。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)主要為閉合構(gòu)象時(shí)，在組氨酸存在時(shí)這些抗體結(jié)合HBP快得多。因而本質(zhì)上，這樣抗體結(jié)合HBP蛋白的速率為目標(biāo)物質(zhì)(組氨酸)濃度的量度。所有PBP都經(jīng)歷開放和閉合形式之間的大的構(gòu)象變化。因而，可以產(chǎn)生抗各PBP的閉合構(gòu)象的抗體。也需要注意，經(jīng)突變以改變給定PBP的特異性的氨基酸被限于結(jié)合口(bindingpocket)。這樣，可以設(shè)想例如抗RBP的閉合形式的單個(gè)抗體也將結(jié)合與TNT或PMPA結(jié)合的RBP突變體的閉合形式。TNT結(jié)合突變體可以被置于傳感器的"通道l"中，并且PMPA結(jié)合突變體在"通道2"中，但是對RBP的閉合形式作出反應(yīng)的單CANARY細(xì)胞系可以被用于檢測在通道1和通道2兩者中結(jié)合的目標(biāo)物質(zhì)。因?yàn)樵趥鞲衅鞯母鱾€(gè)通道內(nèi)使用不同目標(biāo)特異性的PBP，所以目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)的身份將被得知。這意味著傳感器需要的CANARY細(xì)胞系的數(shù)目遠(yuǎn)少于其可以鑒定的化學(xué)物質(zhì)的數(shù)目，極大地簡化了用于額外的CWA/E試劑的研制。遞這潛合吝個(gè)^fW^f,農(nóng)設(shè)^的尸5尸的C4A^i^乂,化夢參l邊/f^^V:(1)細(xì)胞周質(zhì)結(jié)合蛋白已經(jīng)計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)為結(jié)合多種化學(xué)物質(zhì)。這些蛋白質(zhì)已在細(xì)菌中產(chǎn)生、分離、并且檢測其對包括TNT和PMPA的新目標(biāo)物質(zhì)的親和性。(2)當(dāng)使用對閉合構(gòu)象特異性的抗體可以測量的配體存在時(shí)，這些PBP發(fā)生構(gòu)象改變。(3)CANARY已經(jīng)證明了使用抗體結(jié)合檢測阿托摩爾(attomole)級的蛋白的能力。因而，CANARY測試可以適用于檢測閉合構(gòu)象的PBP(參見圖164)。該閉合構(gòu)象將指示CWA/E的存在。在檢測氣體中的化學(xué)物質(zhì)和爆炸物時(shí)，有至少兩種用于蒸氣取樣的可能方法。第一種方法為沖擊，其中氣體通過液體起泡，從而捕獲蒸汽和微粒。這是一種用于氣體取樣的久經(jīng)試驗(yàn)的方法?？商娲氖占桨笧楣滔嗵崛?SPE)或固相微提取(SPME)。該技術(shù)在干的功能化樹脂上直接從空氣體中捕集蒸汽。典型地，使用熱的或有機(jī)溶劑洗脫這些樹脂。16通道傳感器實(shí)施例減少測量多個(gè)樣品的時(shí)間(同時(shí)使硬件需求最小)的途徑已被成功測試。已設(shè)計(jì)允許利用單光采集通道同時(shí)測量16個(gè)樣品的實(shí)驗(yàn)性傳感器。該傳感器包括轉(zhuǎn)子，該轉(zhuǎn)子支承有16個(gè)圍繞其圓周水平、均勻分布的1.5ml管子，并且由繞垂直軸的可變速馬達(dá)驅(qū)動(dòng)(圖39)。單固定光子檢測部件(如PMT)被置于轉(zhuǎn)子的平面內(nèi)正好在管旋轉(zhuǎn)過程中的路徑外邊。這樣，各管子順序、反復(fù)地緊密接近PMT使其光輸出在各次通過時(shí)被采樣。最終，由光源(紅外LED)和檢測器(光電晶體管)組成的光開關(guān)被用于控制檢測到的光子的計(jì)數(shù)和16個(gè)域內(nèi)的數(shù)據(jù)的再組織，各域分別與特定的樣品相關(guān)。單次測量包括1、在各個(gè)1.5ml管中制備16個(gè)樣品(和/或?qū)φ?；2、向各試管內(nèi)引入等份的發(fā)射體細(xì)胞；3、將管安裝于位于暗箱內(nèi)的轉(zhuǎn)子中；4、通過以高RCF(2000g)的短暫(5秒)離心旋轉(zhuǎn)將發(fā)射體細(xì)胞定位至管底部；5、在測量過程中(12分鐘)降低轉(zhuǎn)子的速度至60rpm,各管每秒鐘一皮采樣一次；6、產(chǎn)生各個(gè)樣品的光子計(jì)數(shù)的時(shí)間序列，以進(jìn)行顯示和/或輸入到用于評估的計(jì)算機(jī)算法。如圖40所示的16通道測量的數(shù)據(jù)的例子顯示了可與單管方法相比的LOD。盡管該16通道傳感器按照設(shè)計(jì)將測量16個(gè)樣品，但是，通過增加通道的數(shù)目從而測量更多樣品數(shù)目也是可能的，雖然取樣的物理大小和統(tǒng)計(jì)最終導(dǎo)致實(shí)際的限制。類似地，通過降低傳感器上負(fù)載的樣品的數(shù)目、或者通過降低傳感器上通道的數(shù)目，更少的樣品數(shù)目是可能的。16通道便攜式傳感器設(shè)計(jì)的CAD制圖如圖41所示。該16通道設(shè)計(jì)的進(jìn)一步實(shí)施稱為TCAN傳感器。TCAN(觸發(fā)的CANARY)生物傳感器為將氣溶膠收集和B細(xì)胞液體輸送組合為集成的徑向盤形式的自動(dòng)生物傳感器。該TCANCANARY盤(CD)(圖42)與將空氣分成獨(dú)立的通道的管線裝置連接。氣溶膠收集裝置(圖43)使用干式?jīng)_擊技術(shù)以將氣流中的顆粒定位于干凈塑料管的底部。氣溶膠顆粒沖擊后，CD與管線裝置連接以致動(dòng)位于盤內(nèi)的閥。該盤快速旋轉(zhuǎn)，這又導(dǎo)致發(fā)射體細(xì)胞液體利用離心力輸送至單個(gè)管內(nèi)(圖44)。然后，使用光學(xué)檢測器基于與氣溶膠顆粒相互作用的發(fā)射體細(xì)胞的光子輸出鑒定潛在的生物劑。該氣溶膠收集和發(fā)射體細(xì)胞輸送的過程可以在一個(gè)盤中重復(fù)多次。這種特征允許在多個(gè)觸發(fā)事件后進(jìn)行多次CANARY測試，而無需改換CD。氣溶膠收集技術(shù)專門設(shè)計(jì)用于CANARY傳感器的干式氣溶膠收集技術(shù)已被研制以充分利用CANARY潛在速度的優(yōu)勢。與許多其它需要潤濕劑和復(fù)雜射流技術(shù)空氣收集系統(tǒng)不同，干式?jīng)_擊系統(tǒng)直接從氣體收集顆粒到干表面上，因而去除了過程中的幾乎所有消耗品。除該沖擊系統(tǒng)的低材料消耗外，其不會(huì)發(fā)生基于液體收集系統(tǒng)所經(jīng)歷的低溫結(jié)冰的問題。該簡單收集方法通過利用顆粒相對高的動(dòng)量以迫^吏顆粒撞擊在千表面上從而將更稠密的病原體顆粒與氣流分離，在所述干表面處，部分被沖擊的顆粒非特異性結(jié)合并且被留置。該基本概念和我們的收集器原型之一如圖23所示。理想的氣溶膠沖擊器顯示很少或不收集極小顆粒(其可以跟隨轉(zhuǎn)向的氣流)、收集幾乎100%的大顆粒(其動(dòng)量將他們帶出氣流)、和捕獲效率在這些極限的粒徑之間平滑過渡。沖擊器典型地以發(fā)生50%收集效率的粒徑為特征。圖165顯示對于該原型管式?jīng)_擊器，以每分鐘5升的流速、約lpm直徑產(chǎn)生50%收集效率(D5Q)。通過增加取樣速度或取樣時(shí)間以增加被取樣空氣的總體積，很容易地實(shí)現(xiàn)收集更多總數(shù)的顆粒。CANARY傳感器已被用于鑒定使用干式?jīng)_擊收集的生物劑而無需進(jìn)一步處理，因?yàn)樵摲椒▽⑸飫┒ㄎ挥诠鼙砻?，免去了為了獲得最大性能而預(yù)旋轉(zhuǎn)樣品的需要。這使得用于干樣品鑒定的CANARY測試流程比液體樣品所用流程更快和操作更簡單(和自動(dòng)的)。因?yàn)樗惺占念w粒在沖擊過程中被粘附于管底部而無論氣溶膠顆粒內(nèi)包含的單個(gè)病原體的大小，因此，干樣品的鑒定也具有為不易在液體測試中沉淀的小病毒或其它病原體提供更好的整體靈敏度的可能性。將干式?jīng)_擊與CANARY整合的概念的證明為了證明干式?jīng)_擊收集對于CANARY傳感器應(yīng)用的功效，利用柯立森霧化器(CollisonNebulizer)將單獨(dú)的枯草芽孢桿菌孢子氣溶膠化，并且以每分鐘5升的流速在以上所示原型中收集30秒。直接向含樣品管中加入B細(xì)胞，置于便攜式CANARY設(shè)備中，旋轉(zhuǎn)5秒，然后通過PMT定量光信號。結(jié)果如圖166所示，并且顯示直接沖擊技術(shù)產(chǎn)生與在分析前無需樣品制備的預(yù)旋轉(zhuǎn)液體樣品在動(dòng)力學(xué)方面類似的B細(xì)胞反應(yīng)。在該概念驗(yàn)證試驗(yàn)中通過1夯鐘之短的整體反應(yīng)時(shí)間(30秒收集，隨后達(dá)到最大光子密度，不到30秒的分析時(shí)間)，CANARY證明將生物氣溶膠鑒定的綜合速度和靈敏度比其它所有自動(dòng)生物氣溶膠鑒定傳感器提高了超過一個(gè)數(shù)量級。該顯著的性能改進(jìn)使CANARY傳感器能夠填補(bǔ)在3分鐘之內(nèi)提供靈敏檢測的傳感器性能方面的長期存在的技術(shù)空缺，該靈敏檢測是警告、并保護(hù)人群免于暴露于有威脅的生物氣溶膠時(shí)所需要的。CANARY傳感器第一次(且仍然是唯一的)在生物鑒定傳感器中提供了檢測-警告(或者稱為檢測-保護(hù))生物防御能力的潛力的證明。該能力的獨(dú)一無二的實(shí)現(xiàn)推動(dòng)了自動(dòng)生物氣溶膠傳感器的快速發(fā)展，以使該技術(shù)能夠離開實(shí)驗(yàn)室、并且在實(shí)際環(huán)境中操作，從而建立CANARY在現(xiàn)實(shí)世界的應(yīng)用。自動(dòng)CANARY生物氣溶膠傳感器發(fā)展為了證明在生物氣溶膠防御應(yīng)用中的檢測-警告能力，CANARY鑒定技術(shù)與干式氣溶膠收集體系結(jié)構(gòu)在兩個(gè)第一代傳感器一一BCAN和TCAN中無縫整合。BCAN傳感器被設(shè)計(jì)為在重新加載之前以足以檢測低濃度處理的靈敏性提供30個(gè)自動(dòng)取樣和分析循環(huán)，并且在多種環(huán)境中進(jìn)行廣泛測試，以建立在各種現(xiàn)實(shí)環(huán)境中實(shí)現(xiàn)CANARY性能和假陽性率的ROC曲線。由BCAN傳感器證明的優(yōu)良性能特征提供了在單獨(dú)程序下促進(jìn)TCAN發(fā)展的基礎(chǔ)，以證明設(shè)計(jì)為滿足室內(nèi)生物氣溶膠檢測所預(yù)期的較低需求條件的簡化CANARY傳感器。BCAN傳感器開發(fā)和測試基于概念驗(yàn)證結(jié)果開發(fā)任何自動(dòng)CANARY傳感器的第一步是設(shè)計(jì)將干式收集與旋轉(zhuǎn)增強(qiáng)的CANARY測試結(jié)合的可靠途徑。此外，由于在該液體收集試劑輸送結(jié)構(gòu)體系(如其在所有其它生物氣溶膠鑒定傳感器)中不需要射流系統(tǒng)，因此，我們將我們的設(shè)計(jì)方向集中于沒有射流裝置的細(xì)胞滴儲(chǔ)藏和輸送上。該以自動(dòng)形式將無試劑氣溶膠收集與基于細(xì)胞的生物傳感器結(jié)合的獨(dú)特方法能夠徹底去除主要導(dǎo)致其它生物氣溶膠鑒定傳感器平臺(tái)的高成本、大尺寸和復(fù)雜性增加、以及可靠性降低的核心系統(tǒng)。BCAN傳感器實(shí)現(xiàn)的最終解決方案利用了包含適當(dāng)?shù)臍馊苣z收集技術(shù)和在COTS嚢中儲(chǔ)藏的獨(dú)立等份B細(xì)胞的簡單載體，其中所述COTS嚢在收集后的短暫旋轉(zhuǎn)過程中自動(dòng)釋放其內(nèi)容物。該設(shè)計(jì)的關(guān)^t細(xì)節(jié)已在圖167中描述。各BCAN載體含有提供四種CANARY分析所必須的四種核心功能的4個(gè)平行裝置(或通道)，所述四種核心功能為細(xì)胞儲(chǔ)存、氣溶膠耳又樣、細(xì)胞輸送和向PMT的信號傳輸。BCAN試驗(yàn)臺(tái)在重新加載之間包含并自動(dòng)處理多至25個(gè)這些載體。使用柯立森霧化器產(chǎn)生的枯草芽孢桿菌孢子氣溶膠作為炭疽熱和其它生物氣溶膠的模擬物確定BCAN的速度和靈敏度特征，并且證明該首創(chuàng)傳感器對于每升空氣>100含抗原顆粒(ACPLA)濃度的生物氣溶膠、以包括自動(dòng)氣溶膠收集和分析的3分鐘總反應(yīng)時(shí)間能夠提供〉96%的鑒定的可能性。此外，可以在各種室內(nèi)和室外場所運(yùn)行該傳感器。在跨大范圍背景條件的9個(gè)不同場所內(nèi)完成超過3,000個(gè)測試，結(jié)果表明該傳感器在現(xiàn)實(shí)環(huán)境中給出的異常陽性信號(假陽性)的頻率與在實(shí)驗(yàn)室中觀察到的假陽性的頻率類似。這些結(jié)果共同證明該首創(chuàng)傳感器在不到3分鐘內(nèi)的快速、靈敏鑒定生物氣溶膠的實(shí)用性。此外，其證明生物氣溶膠陽性鑒定所需的收集時(shí)間與存在的生物氣溶膠的濃度成比例，從而不到90秒的總反應(yīng)時(shí)間對于足夠高濃度的生物氣溶膠是可能的。沒有其它基于抗體或核酸的傳感器平臺(tái)證明在自動(dòng)生物氣溶膠傳感器中具有這種反應(yīng)速度。通過將表達(dá)多種抗體的多種B細(xì)胞系或單一B細(xì)胞系置于獨(dú)立管或通道中，可以實(shí)現(xiàn)測試數(shù)目的增加。該利用細(xì)胞系或抗體結(jié)合的系統(tǒng)使硬件復(fù)雜性(以及尺寸)最小，并且對于單抗原物質(zhì)襲擊情況，可以獨(dú)立檢測2"個(gè)抗原(其中，n為通道的數(shù)目)。使用三種不同B細(xì)胞系的混合物達(dá)到每通道使用多種細(xì)胞類型的CANARY測試的實(shí)際限制。當(dāng)每管多于三種細(xì)胞類型被使用時(shí)，低濃度目標(biāo)物質(zhì)的信號強(qiáng)度由于正確靶B細(xì)胞相互作用的可能性減小而降低到低于檢測極限。除了增加對于給定數(shù)目的通道可以鑒定的抗原的數(shù)目，使用該方法引起測試冗余已經(jīng)被用于去除不相關(guān)的假陽性(其中對于給定抗原不是所有同步測試都給出陽性結(jié)果的測試)，因而顯著降低假陽性率。大量的測量和實(shí)地測試證明BCAN在少至90秒的時(shí)間內(nèi)沖企測生物相關(guān)濃度的生物氣溶膠的能力。該反應(yīng)時(shí)間比任何其它集成生物氣溶膠鑒定傳感器快一個(gè)數(shù)量級，并且為與生物防御的檢測-保護(hù)操作110需求速度一致的唯一證明?；蛟S甚至更重要地，在現(xiàn)實(shí)環(huán)境中的CANARY測試確定的低假陽性率(對于單測試在0.2%和0.3%之間，并且，對于2倍或更多冗余，為0.1%或更低，同時(shí)保持>96%的鑒定概率)顯示該能力可以在用于需要低假警報(bào)率和優(yōu)良速度的生物氣溶膠鑒定系統(tǒng)中實(shí)際應(yīng)用。盡管BCAN被設(shè)計(jì)為有效的證明試驗(yàn)臺(tái)，但是其它傳感器結(jié)構(gòu)體系提供用于特定應(yīng)用的潛在優(yōu)勢。由BCAN的早期成功推動(dòng)，TCAN傳感器開發(fā)開始作為平行的傳感器發(fā)展研究，以使用特定的傳感器設(shè)計(jì)建立對于建筑物保護(hù)的CANARY能力。TCAN傳感器開發(fā)和測試TCAN為一種發(fā)展為用于在室內(nèi)建筑物環(huán)境中實(shí)時(shí)監(jiān)測生物氣溶膠的簡單、經(jīng)濟(jì)的裝置的基于CANARY的生物傳感器。將該特定傳感器設(shè)計(jì)為將氣溶膠收集和B細(xì)胞輸送結(jié)合為集成徑向盤形式。該盤設(shè)計(jì)為與將負(fù)載微粒的氣流分離到四個(gè)單獨(dú)通道內(nèi)的管線連接。然后使用慣性碰撞技術(shù)將這些微粒定位于干凈的一次性管的底部。在收集氣溶膠顆粒后，安裝在盤內(nèi)的閥被打開，并且將該盤以2000RPM快速旋轉(zhuǎn)5秒。該旋轉(zhuǎn)步驟利用離心力快速驅(qū)動(dòng)B細(xì)胞液體與收集的顆粒接觸。然后使用單光電倍增管基于隨著盤旋轉(zhuǎn)與氣溶膠顆粒相互作用的B細(xì)胞的光子輸出鑒定潛在的生物劑。該氣溶膠收集和B細(xì)胞輸送的過程可以重復(fù)多次，使得能夠在單盤中進(jìn)行多重CANARY測試。該CANARY傳感器可以在不到3分鐘內(nèi)提供可疑顆粒的高度可信的鑒定。PANTHER傳感器研制和測試在所述兩種第一代自動(dòng)CANARY傳感器的成功和教訓(xùn)的基礎(chǔ)上，我們已將CANARY技術(shù)整合至所謂PANTHER(威脅環(huán)境排》文物的病原體分^斤4義(PathogenAnalyzerforThreateningEnvironmentalReleases))的靈活生物氣溶膠傳感器平臺(tái)內(nèi)。氣溶膠收集和CANARY分析的核心功能設(shè)計(jì)為具16通道的簡單盤，其形成特定任務(wù)生物氣溶膠鑒定傳感器的第二代PANTHER家族的核心。最終的PANTHER傳感器設(shè)想為單獨(dú)使用或形成網(wǎng)絡(luò)以提供場所/建筑物保護(hù)、緊急響應(yīng)、快速掃描和環(huán)境監(jiān)測。使用第一個(gè)PANTHER傳感器已證明在不到2分鐘內(nèi)對極低濃度生物氣溶膠的高可信度鑒定，所述第一個(gè)PANTHER為371b.重、1行3大小、并且能夠最終以不到$20K#:制造的稱作CUB的便攜裝置。該測試的設(shè)計(jì)是簡單且可靠的。其沒有射流部件、無液體消耗、移動(dòng)部件最少、象CD播放器一樣加載并且自動(dòng)收集和分析樣品。CUB傳感器為最初致力于研制能夠?qū)崿F(xiàn)由美國陸軍投入的現(xiàn)有生物氣溶膠傳感器一聯(lián)合生物戰(zhàn)劑點(diǎn)探測系統(tǒng)(JointPointBiologicalDetectionSystem,或JBPDS)的所有自動(dòng)收集和分析功能的基于CANARY傳感器的計(jì)劃的副產(chǎn)物。PANTHER盤被設(shè)計(jì)為該傳感器的核心，并且能夠在單氣溶膠上同時(shí)進(jìn)行16個(gè)測試。CUB的開發(fā)跟隨了該最初的設(shè)計(jì)方向，并且實(shí)現(xiàn)了與傳感器復(fù)雜性和性能譜的要求相對的產(chǎn)品能夠自動(dòng)處理單一PANTHER盤的小型、廉價(jià)、便攜傳感器。所得的CUB傳感器已被設(shè)計(jì)、制備和測試。最初的結(jié)果已證實(shí)CUB以更小和更廉價(jià)的傳感器提供了速度和靈敏度的改進(jìn)，低于10ACPLA的濃度的孢子氣溶膠的檢測和包括收集和鑒定的不到2分鐘的反應(yīng)時(shí)間。在相同環(huán)境中用于鑒定BCAN生物氣溶膠傳感器的其它環(huán)境測試已證明PANTHERCUB在現(xiàn)實(shí)環(huán)境中也具有極低的4艮陽性率。PANTHERCUB盤i殳計(jì)和功肯巨在PANTHER傳感器中使用的盤實(shí)行兩種基本功能1)其提供使得能夠從被吸引通過盤的空氣中收集氣溶膠顆粒、并且使它們在適合使用CANARY直接分析的聚焦位置沉積的特定幾何特征；以及2)其在使得能夠無需人工處理而將試劑分配于收集的氣溶膠顆粒上的密封儲(chǔ)存庫內(nèi)儲(chǔ)存CANARYB細(xì)胞。載體主體和蓋這兩個(gè)部件被設(shè)計(jì)為可注塑和可超聲波熔接的，以形成具有l(wèi)mm的大致均一壁厚的直徑120mm、且高6mm的完整盤(圖173)。用于該盤的優(yōu)選聚合物為聚丙烯均聚物，因?yàn)槠湟炎C明與B細(xì)胞長期儲(chǔ)存的優(yōu)良相容性，但是任何其它具有足夠透明度(用于從B細(xì)胞至光感應(yīng)原件的信號傳輸)和B細(xì)胞相容性的聚合物也都是適合的。載體主體具有配置垂直壁的連續(xù)底部，從而在熔接盤內(nèi)形成用于氣溶膠加速和收集、以及用于液體試劑儲(chǔ)存和輸送的多個(gè)相關(guān)特征設(shè)置，其繞中心軸徑向安置。這些特征可以是相同的，或者他們可以被單獨(dú)設(shè)計(jì)以使能夠由單一盤提供收集器和測試的許多功能。壁的內(nèi)部設(shè)置(圖173A-特征l)使氣流指向在沿盤的外周形成的裂縫并加速氣速的氣溶膠顆粒的有效收集的寬度和距外壁的間隔。壁的外部設(shè)置(圖173A-特征2)形成繞盤的邊緣的連續(xù)圓周，并且提供具有有助于收集通過壁的內(nèi)部設(shè)置加速的顆粒到多個(gè)顯示增加顆粒密度的局部區(qū)域的位點(diǎn)上的限定幾何特征的單獨(dú)顆粒收集位點(diǎn)。位于壁A和B之間的壁的另一設(shè)置(圖173A-特征3)在熔接盤內(nèi)產(chǎn)生多個(gè)隔間，其能容納在隨后的旋轉(zhuǎn)或多次旋轉(zhuǎn)過程中釋放和分布到收集的顆粒上的液體試劑和其它物質(zhì)。壁可以設(shè)計(jì)壁為單旋轉(zhuǎn)輸送所有隔間的被儲(chǔ)存的CANARY細(xì)胞，或者多次旋轉(zhuǎn)可以根據(jù)需要輸送單獨(dú)室或部分室的內(nèi)容物。所述蓋為具有兩組關(guān)鍵特征的lmm厚的盤的形式。第一組特征包括多種孔，以將液體試劑(圖173B-特征3)和氣溶膠樣品(圖173B-特征1入口和圖173-特征2出口)引入裝配的盤內(nèi)，并且提供通過光傳感器可以被才全測的分度特征(J圖173B-特征4)，從而在讀耳又過程中檢測盤的定位。第二組特征包括兩邊的凸起結(jié)構(gòu)，使蓋能夠提供降低盤內(nèi)相鄰?fù)ǖ乐g的光轉(zhuǎn)移的屏障(圖173B-特征5)(當(dāng)用于形成盤的聚合物含有適當(dāng)顏料使其不透明時(shí))、提供增強(qiáng)盤半體的超聲熔接的特征、以及3)減少形成具有管線的氣密所需的接觸面積，所述管線將氣溶膠輸送至所述盤且在顆粒在盤內(nèi)收集后去除廢棄空氣(恰好在氣體出口內(nèi)側(cè)和外側(cè)的圓環(huán))。圖174說明熔接盤內(nèi)特征A和B如何共同工作，以引導(dǎo)氣溶膠流和顆粒收集。使用一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)拇碉L(fēng)機(jī)或泵向兩個(gè)圓形脊之間的盤蓋上的三角形口的陣列施加部分真空將被取樣的氣溶膠通過大的中心孔吸到盤內(nèi)?？諝獗环植嫉蕉鄠€(gè)通道內(nèi)，并且隨通道逐漸變細(xì)向外徑向流動(dòng)，從而隨其接近盤的圓周而加速氣溶膠。然后，氣流在通過三角形口被吸出之前在盤的外圓周處被迫形成急轉(zhuǎn)。在空氣樣品中攜帶的氣溶膠顆粒的動(dòng)量阻止顆粒隨空氣轉(zhuǎn)向，它們反而在可以通過調(diào)整盤外壁的幾何特征而被特別設(shè)計(jì)的焦點(diǎn)處沖擊盤的內(nèi)表面。大部分在目的大小范圍內(nèi)的顆粒(典型地在1和25pm之間)粘附于其沖擊的表面，并保持以進(jìn)行后續(xù)的CANARY分析。使用lpm熒光球形聚苯乙烯顆粒確定在盤中的收集分布特征。這些顆粒被氣溶膠化，然后氣體通過盤以30L/min/通道的速度被吸入，并且所得的顆粒分布在紫外線光照下可見。這證明了收集顆粒的分布可以被特別設(shè)計(jì)從而收集顆粒在具有由在收集表面上的壁片段交叉的位置所確定的位置處兩條濃密線內(nèi)。當(dāng)交叉被定位于盤的最大半徑處時(shí)，其導(dǎo)致用于光信號激發(fā)和檢測的收集的顆粒與輸送的CANARY細(xì)胞的可靠共定位。調(diào)整通過噴嘴的流速可以使在該盤中收集的顆粒的粒徑范圍根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。圖175說明了通過盤被有效輸送、并且被引導(dǎo)在收集面上沖擊的顆粒的流速和粒徑之間的關(guān)系。在高流速下(如30L/min)，直徑》l^im的顆粒具有足夠的動(dòng)量以接觸收集面，然而對于該流速的實(shí)際粒徑上限為8pm，因?yàn)橹睆絕8(im的顆粒具有太大的動(dòng)量以至于當(dāng)氣溶膠從中心入口進(jìn)入處于盤的面內(nèi)的徑向空氣通道時(shí)不能發(fā)生最初的90°轉(zhuǎn)向。減少氣流逐漸增加了對于具有足夠動(dòng)量沖擊表面的顆粒的臨界直徑，但是也使較大的顆粒能夠在盤內(nèi)進(jìn)行最初的轉(zhuǎn)向。例如降低流速到4L/min調(diào)整收集的顆粒的粒徑范圍到2.5nm-25pm,使得大得多的氣溶膠顆粒能夠被收集和分析。圖176說明熔接盤中的特征C如何共同工作以提供液體試劑的儲(chǔ)存和釋放。試劑儲(chǔ)存區(qū)的壁被定向以用于形成具有面向盤的外徑的開口的袋，從而蓋中適當(dāng)定位的孔提供了該袋的通路和出口，用于加載l)粘性塞，以封閉對盤其余部分的開口，然后，2)通過加載端口添加液體試劑(如B纟田月包)，同時(shí)空氣通過出口逸出。加入將加載口與出口分隔的伸入試劑儲(chǔ)存區(qū)內(nèi)的短壁確保了在加載過程中所述袋的完全填充。一旦粘性塞和液體試劑的加載完成，使用膠帶覆蓋通路孔以將液體密封在保持不透氣和液體的袋內(nèi)，直至需要釋放。為了釋放液體試劑，旋轉(zhuǎn)盤至足夠的RPM(典型地4，000rpm),從而徑向加速力足以將粘性塞從其位置移開，從而朝向盤的外側(cè)打開袋，并且使液體能夠流向盤的外徑和覆蓋收集的氣溶膠顆粒。對于含B細(xì)胞的液體，被用于分配液體試劑的5秒鐘旋轉(zhuǎn)也是足以將懸浮的B細(xì)胞沉淀于盤的外壁之上，并且使其共定位于氣溶膠顆粒被收集的位置。在輸送B細(xì)胞和任何其它液體試劑后，減慢旋轉(zhuǎn)(典型地至30120rpm)以使單光子感應(yīng)部件(如光電倍增管(PMT)、通道光電倍增器(CPM)或其它光子計(jì)數(shù)設(shè)備)能夠隨各通道經(jīng)過光傳感器前面而順序記錄其光發(fā)射的水平。盤連續(xù)旋轉(zhuǎn)，同時(shí)光輸出被監(jiān)測達(dá)2分鐘，然后，通過用于處理盤的傳感器或者通過連接的計(jì)算機(jī)處理并儲(chǔ)存數(shù)據(jù)。PANTHER傳感器i兌明已被制造為自動(dòng)處理CANARY盤的緊湊型傳感器的整體圖如圖177所示。傳感器主體為12"高x12"寬xl4"厚、重約37lbs,并且具有所有必須的部件，且使用單個(gè)手工加載CANARY盤控制自動(dòng)收集和分析氣溶膠樣品。通過打開抽拉盒(圖177-特征1)、將盤放置于平臺(tái)上并且關(guān)閉抽拉盒實(shí)現(xiàn)盤的加載。當(dāng)傳感器接受信號以收集和分析樣品時(shí)，傳感器開始經(jīng)進(jìn)氣口(圖177-特征2)將空氣吸入、引導(dǎo)空氣通過盤、然后將去除顆粒的空氣通過出口(圖177-特征3)排出。在氣溶膠收集后由預(yù)定參數(shù)或由從外部控制器收到的信號決定的一段時(shí)間，傳感器以足以輸送CANARY試劑(典型地4000rpm)的速度旋轉(zhuǎn)盤并且開始分析階段。在分析過程中，旋轉(zhuǎn)被減慢至能夠隨盤中的各個(gè)獨(dú)立通道經(jīng)過單光子計(jì)數(shù)組件前方而使其光子發(fā)射被測量。以下核心組件(圖178所示)被裝配至第一傳感器內(nèi)，并且足以進(jìn)行所有收集和分析功能的所有功能，且賦予如下性能。CANARY盤(圖178-特征4)被置于馬達(dá)裝置(不帶電刷的DC馬達(dá)Faulhaber，部件弁3564K012BK1155，圖178特征-5)上，然后關(guān)閉門以將盤加載于特制的不透光盒(圖178-特征7)內(nèi)。兩個(gè)Ametek送風(fēng)機(jī)(部件#150193，圖178-特征1)與特制的管線(圖178-特征6)連接，所述管線提供與CANARY盤的連接并且當(dāng)入口流和出口流進(jìn)入和離開盤時(shí)分離和引導(dǎo)入口流和出口流。當(dāng)送風(fēng)才幾被開啟時(shí)，盤自動(dòng)升高進(jìn)入管線下方的位置，送風(fēng)機(jī)產(chǎn)生的真空使其保持在該位置并且提供確保適當(dāng)?shù)臍馊苣z流過盤的足夠密封力。在送風(fēng)機(jī)關(guān)閉后，盤自動(dòng)落至馬達(dá)裝置上，其旋轉(zhuǎn)盤至4000rpm5秒鐘以輸送細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)速降至60rpm。該速度維持2分鐘，同時(shí)通道光電倍增組件(PerkinElmer部件弁MCP1984,圖178-特征2)測量各個(gè)單獨(dú)通道的光輸出。通過機(jī)載計(jì)算機(jī)(具有特制接口板的金剛石系統(tǒng)的PC104-部件#ATH660-128，圖178-特征3)調(diào)控該完整過程。PANTHER傳感器性能驗(yàn)證為了確定傳感器的靈敏度，測試氣溶膠通過碰撞霧化枯草芽孢桿菌孢子的濃縮原液的稀釋液被制備，取樣1分鐘以及在CUB中使用孢子特異性的細(xì)胞進(jìn)行分析。在圖179的圖例中顯示了由各稀釋液產(chǎn)生的近似ACPLA水平。1:8000的稀釋液每升產(chǎn)生許多顆粒，其與當(dāng)向霧化器中加入DI水時(shí)產(chǎn)生的室背景是難以區(qū)分的，但是基于一般趨勢，濃度應(yīng)該為每升空氣約5個(gè)孢子的級別。即使在該極低濃度下，以30L/min的一分鐘樣品始終產(chǎn)生具有比陰性對照大三倍還多的最大強(qiáng)度的易檢測信號。然后，腔室研究的模擬識別數(shù)據(jù)與使用鼠疫耶爾森氏菌和炭疽桿菌特異性的細(xì)胞系在一周期間內(nèi)(〉1000個(gè)測試)、在典型的室內(nèi)環(huán)境內(nèi)進(jìn)行的背景測量組合。所得數(shù)據(jù)的分析證明PANTHERCUB傳感器對于>50ACPLA的濃度提供具~0.1。/。相應(yīng)錯(cuò)誤警報(bào)率的95%以上的檢測率。與第一代BCAN和TCAN傳感器性能相比，該性能提116供了能力的顯著改進(jìn)，并且利用硬件優(yōu)化和算法發(fā)展能夠被進(jìn)一步優(yōu)化。毒素檢測實(shí)施例可以使用多種方法實(shí)現(xiàn)可溶性蛋白的檢測。例如，在一種方法中，在同一發(fā)射體細(xì)胞中可以表達(dá)兩種抗體，其中，兩種抗體各自抗相同分子上的不同表位。然后通過單體抗原交聯(lián)所述抗體(圖48)。應(yīng)該指出分泌途徑的抗體的分選在圖48的示意圖中是理想化的。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體可以是雜官能的，即，一個(gè)抗體可以具有兩種不同的功能抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一實(shí)施例中，各抗體僅具有一種功能抗原結(jié)合位點(diǎn)。該方法取決于兩個(gè)因素(1)由相同的發(fā)射體細(xì)胞表達(dá)多個(gè)功能抗體，以及(2)兩個(gè)連接的表位足以激發(fā)發(fā)射體細(xì)胞(盡管激發(fā)給定細(xì)胞可能需要一個(gè)以上的這些配對)。在一個(gè)試驗(yàn)中，在相同的發(fā)射體細(xì)胞中表達(dá)多種功能性抗體(圖49)。表達(dá)抗炭疽桿菌和鼠疫耶爾森氏菌的抗體的單細(xì)胞系被制備。該克隆的細(xì)胞系以良好的靈敏性對兩種抗原發(fā)生反應(yīng)。應(yīng)該理解抗同一可溶性單體上的兩種表位的兩種抗體也可能被功能性表達(dá)。此外，兩個(gè)連接的表位足以激發(fā)發(fā)射體細(xì)胞。檢測可溶性單體抗原的第二種方法為交聯(lián)可溶性抗原以使其對發(fā)射體細(xì)胞表現(xiàn)為共價(jià)(圖50)。該交聯(lián)可以通過將蛋白質(zhì)經(jīng)標(biāo)簽一對于重組蛋白的情況、或者經(jīng)抗體一如對肉毒桿菌毒素Hc片段的情況所示，連接于微球而實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解有多種有效交聯(lián)抗原的其它可能方法，包括用三氯乙酸(TCA)、加熱或乙醇沉淀抗原，以及將抗原經(jīng)配體、抗體或其它化學(xué)官能團(tuán)連接于固體相。然后，使用表達(dá)識別在交聯(lián)抗原上仍存在的表位的抗體的發(fā)射體細(xì)胞可以;險(xiǎn)測該交聯(lián)的單體。使用作為可溶性單體目標(biāo)蛋白質(zhì)的A型肉毒毒素的重鏈(BoNT/AHc)和在Pless等InfectionandImmunity(2001)570-574中描述的抗體實(shí)際完成了該第二種方法。抗一種表位的單克隆抗體(6E10-10)與G蛋白包被的微球交聯(lián)。這些微球與BoNT/AHe在4。C孵育3小時(shí)、清洗、并且被用于激發(fā)表達(dá)識別不同BoNT/AHc表位的第二抗體(6B2-2)。BoNT/AHc裝飾的微球有效地激發(fā)發(fā)射體細(xì)胞，具有約6ng的LOD。表達(dá)與用于結(jié)合BoNT/A和微球的抗體相同的抗體的發(fā)射體細(xì)胞不被激發(fā)，表明目標(biāo)蛋白的聚集不導(dǎo)致發(fā)射反應(yīng)?；瘜W(xué)物質(zhì)檢測實(shí)施例在軍事和臨床方面化學(xué)物質(zhì)的檢測是重要的。某些化學(xué)物質(zhì)可能具有兩種抗體可以獨(dú)立結(jié)合的表位是可能的。在這種情況下，化學(xué)物質(zhì)檢測的方法與以上所述的毒素檢測方法相同。然而，在許多情況下，在目的化學(xué)物質(zhì)上不具有兩種獨(dú)立的表位。在該情況下，有必要修飾化學(xué)物質(zhì)從而其能夠激發(fā)發(fā)射體分子。以下描述這些修飾中的四種。1、將目的化學(xué)物質(zhì)固定于固體載體上。產(chǎn)生表達(dá)識別化學(xué)物質(zhì)保持可用的部分的抗體的發(fā)射體細(xì)胞。當(dāng)固體載體上被固定的化學(xué)物質(zhì)的密度足夠高時(shí)，發(fā)射體細(xì)胞表面上的抗體將被彼此足夠近地固定從而激發(fā)細(xì)胞。這與圖50中所示的毒素檢測的方案類似。2、首先，產(chǎn)生特異性結(jié)合化學(xué)物質(zhì)的肽。其次，制備特異性結(jié)合該化學(xué)物質(zhì)-肽復(fù)合物的抗體。如果化學(xué)物質(zhì)-肽復(fù)合物包括兩種或多種表位，則所述復(fù)合物能夠通過毒素檢測的部分中所描述的兩種抗體技術(shù)中任一被檢測。如果所述復(fù)合物僅包括一種特異性表位，貝'J，如地高辛的附加表位可以被合成加入肽(圖52)。然后該復(fù)合物將含兩個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)(l)通過肽-化學(xué)物質(zhì)復(fù)合物形成的表位，和(2)地高辛表位。僅當(dāng)化學(xué)物質(zhì)存在時(shí)，兩種表位才都存在。然后，可以通過在毒素^f全測的部分中所描述的兩種抗體4支術(shù)中任一^f全測這兩種表位。3、產(chǎn)生特異性結(jié)合化學(xué)物質(zhì)的兩種肽(或當(dāng)存在化學(xué)物質(zhì)時(shí)互相結(jié)合的兩種肽)。這些肽中的每一種都被合成地標(biāo)記，從而僅在化學(xué)物質(zhì)存在時(shí)兩種表位才互相結(jié)合，因而可被發(fā)射體細(xì)胞識別(圖53)?？蛇x擇地，可以制備抗肽-化學(xué)物質(zhì)復(fù)合物的一種或多種抗體，并且如上使用抗復(fù)合物的抗體的組合、或一種抗復(fù)合物的抗體和一種抗肽標(biāo)簽的抗體檢測化學(xué)物質(zhì)的存在。4、如上所述，產(chǎn)生特異性結(jié)合化學(xué)物質(zhì)的肽，并且產(chǎn)生特異性結(jié)合肽-化學(xué)物質(zhì)復(fù)合物的抗體。使化學(xué)物質(zhì)結(jié)合肽二聚化，從而如果二聚體結(jié)合到兩個(gè)化學(xué)物質(zhì)，則其將含有兩個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。該復(fù)合物可以通過表達(dá)抗化學(xué)物質(zhì)-肽復(fù)合物的抗體的發(fā)射體細(xì)胞被檢測。結(jié)合小分子的肽已從組合的庫中被分離。這些小分子包括卟啉(Nakamura等，BiosensorsandBioelectronics2001，16:1095-1100)、色氨酸(Sugimoto等，1999,677-678)和鎘(Mejare等，1998,ProteinEngineering11(6):489-494)。然而，4吏用蛋白質(zhì)代替肽可能產(chǎn)生4交高親和性結(jié)合體。已經(jīng)構(gòu)建了庫，其中，結(jié)合位點(diǎn)已被組合地限定，并且這些結(jié)合位點(diǎn)可以與結(jié)合小分子的結(jié)合位點(diǎn)分離。這種使用脂籠蛋白(lipocalin)作為起始蛋白的庫已被用于分離地高辛突變體的結(jié)合體(Schlehuber和Skerra，2002,BiophysicalChemistry96:213-228)。該途徑可以以任何數(shù)目的其它蛋白作為起始而被使用，但是尤其是那些可能預(yù)計(jì)已具有某目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)結(jié)合活性的蛋白(例如，在VX和沙林情況下的乙酰膽堿酯酶)。進(jìn)一步的實(shí)施例1核酸纟企測RNA檢測比DNA檢測在幾個(gè)方面是有利的。首先，每個(gè)細(xì)胞中(真核或原核)中具有比基因組副本更多的給定RNA的副本，從而每個(gè)細(xì)胞的信號被實(shí)質(zhì)地?cái)U(kuò)增。第二，RNA的存在經(jīng)常被用作生存能力的測試。第三，RNA的檢測不需要兩個(gè)互補(bǔ)鏈的變性，如在dsDNA的情況中。除了力口入Rnase抑制齊l)(RnasinPlus,PromegaCorporation)夕卜，以與ssDNA檢測類似的方式進(jìn)行試驗(yàn)(圖55)。地高辛標(biāo)記的寡核苷酸被加入到不同濃度的RNA中，在47。C孵育2分鐘。表達(dá)抗地高辛抗體的CANARY細(xì)胞被加入，管旋轉(zhuǎn)5秒，并且監(jiān)測光輸出?？蛇x4奪的流程CANARY也可以通過直接標(biāo)記目標(biāo)物質(zhì)而一企測核酸。例如，通過在地高辛標(biāo)記的核苷酸存在下進(jìn)行PCR,這樣產(chǎn)生延其長度具有多個(gè)抗原的PCR產(chǎn)物。同樣，滾環(huán)擴(kuò)增可以被用于將標(biāo)記并入隨后^皮CANARY檢測的目標(biāo)核酸內(nèi)。連接酶鏈反應(yīng)及其衍生物實(shí)質(zhì)上^f吏寡核苷酸二聚化并且如果兩個(gè)寡核苷酸各被一個(gè)抗原標(biāo)記，則CANARY可以被用于監(jiān)測該二聚化。毒素檢測基本形式的CANARY不能檢測單體抗原(圖56)，因?yàn)樵摽乖荒芙宦?lián)單克隆抗體如此處所述，測試必須被改進(jìn)。兩種通用策略被用于使用CANARY檢測毒素模擬物(1)使毒素抗原對于CANARY細(xì)胞表現(xiàn)為多價(jià)，或(2)使CANARY細(xì)胞表達(dá)的抗體多克隆化。例如，蛋白質(zhì)抗原可以通過將抗原吸附于微球、細(xì)胞或?qū)⑴c可溶性抗體交聯(lián)的抗原而對于CANARY細(xì)胞表現(xiàn)為多價(jià)。使用毒素模擬物(肉毒毒素A)重鏈(BoNT/AHe)進(jìn)行最初的試驗(yàn)。至今對通過CANARY的毒素模擬物檢測給出最好靈敏性和速度的測試改進(jìn)是在抗體包被的磁性微球上捕獲模擬物，并且使用CANARY細(xì)胞檢測模擬物修飾的微球(圖57)。識別BoNT/AHe毒素類似物上的非重疊表位的三種單克隆抗體，6E10-10、6B2-2和6C2-2(由Bavari博士和Ludwig博士捐贈(zèng)，USAMRIID)已被使用?？扇苄?E10-10抗體被偶聯(lián)于G蛋白標(biāo)記的磁性樣O求，同時(shí)6B2-2在CANARY細(xì)胞中表達(dá)。6E10-10抗體包被的微球在摻有BoNT/AHe的溶液中孵育2分鐘，產(chǎn)生毒素模擬物修飾的微球。加入CANARY細(xì)胞，并且將混合物旋轉(zhuǎn)5秒鐘以使微球和細(xì)胞成團(tuán)。這些微球?qū)⒐潭ǖ腂oNT/AHe呈遞于CANARY細(xì)胞，從而交聯(lián)抗體和激發(fā)光發(fā)射。該技術(shù)能夠在<5分鐘內(nèi)檢測800pg的BoN丁/AHe(80ng/ml)(圖58)。應(yīng)該注意測試的靈敏度取決于BoNT/AHc的質(zhì)量。市售BoNT/AHe的批次差異和儲(chǔ)存特性影響我們的表觀檢測極限(LOD)。其在確定測試以證明CANARY能夠檢測真正可溶性蛋白質(zhì)中是重要的。120新鮮的、未冷凍的BoNT/AHc比曾被冷凍(建議的儲(chǔ)存方法)的BoNT/AHc給出更高的反應(yīng)(圖59)。冷凍-解凍的BoNT/AHc的離心進(jìn)一步降低了反應(yīng)性，暗示在冷凍-解凍過程中聚集物形成。在這些測試中使用的曾被冷凍儲(chǔ)存的BoNT/AHc在解凍時(shí)通常被離心以去除聚集物。盡管這樣低估了測試靈敏度，但是測試間差異被降低。微球測試形式對于使用此處描述的全血制備方法在血制品中篩查可溶性抗原是有效的。全血被摻入BoNT/A重鏈，并且將血液通過聚合物短暫離心以促進(jìn)細(xì)胞與可溶性物質(zhì)分離。將6E10-10抗體包被的微球加入所得上清液中，并且使用6B2-2CANARY細(xì)胞測試。該測試的靈敏度與在對照培養(yǎng)基中進(jìn)行的測試類似，顯示大多數(shù)干擾物已被去除。在與血細(xì)胞分離后，用相同濃度的BoNT/AHc摻入血漿中給出相對于其中血液被直接摻入的樣品較低的信號。這種差異可能為血液樣品制備的人為結(jié)果，而不是在血漿中存在其它的CANARY抑制劑。盡管信號振幅稍微降低，但是4參入尿液中的BoNT/AHc抗原也可以被檢測(圖61)。在該試驗(yàn)中，未進(jìn)行預(yù)處理。6E10-10包被的微球被直接加入尿樣中，在C02I中清洗微球，并且加入6B2-2CANARY細(xì)胞。三種被摻入的尿樣(藍(lán)線)中的兩種顯示顯著反應(yīng)，然而第三種樣品未顯示反應(yīng)。為什么第三種尿樣是陰性的、或者為什么尿液樣品的信號振幅低于陽性對照(金線)從該有限的數(shù)據(jù)中還不能主-'主扭開,3疋°測試在檢測被摻入鼻拭子的可溶性抗原方面也是有效的。為了制備用于該測試的樣品，收集拭子，剪掉拭子的桿，并且將拭子末端置于裝配于埃彭道夫管上方的5微米濾筐內(nèi)(圖62)。加入對照或摻有BoNT/AHc的C02I培養(yǎng)基，并且對該裝置加蓋并離心。使用正常微球方法在埃彭道夫管中收集去除了大顆粒的過濾洗脫液，并進(jìn)行測試。摻有BoNT/AHc的實(shí)際和模擬拭子的測試結(jié)果非常類似，顯示在鼻腔樣品中無抑制劑存在(圖63)。對未摻入抗原(C02I)的鼻拭子缺少CANARY反應(yīng)顯示在鼻拭子樣品中沒有非特異性刺激因子存121在。如桔汁或PBS/Tx-100的許多溶液非特異性地激發(fā)CANARY細(xì)胞，因此有必要用測試培養(yǎng)基置換含毒素模擬物的原始溶液。除了交聯(lián)目標(biāo)物質(zhì)外，磁性微球的使用提供了用細(xì)胞相容的測試培養(yǎng)基置換含模擬物的溶液的簡單方法。在食品基質(zhì)的調(diào)查中，桔汁由于具有潛在的pH問題(pH=3,5)和水由于具有潛在的鹽問題(無)而表現(xiàn)突出。這些特征中任一都能影響抗體包被的微球結(jié)合毒素模擬物的能力。對于這些試驗(yàn)，1/7體積(1.4微升)的含560mMNaCl、1.4MHepes的溶液(pH7.9)被加入到所有摻有BoNTHc的基質(zhì)和抗體包被的纟鼓球中。這使水基質(zhì)達(dá)80mM的最終鹽濃度，桔汁的pH達(dá)到約6.5，并且同時(shí)加入誘導(dǎo)抗體結(jié)合的偶聯(lián)微球以引發(fā)結(jié)合步驟。在12分鐘結(jié)合步驟的最后，加入190|11測試培養(yǎng)基，將管子在磁體上放置30秒，并且去除上清液。在50|il測試培養(yǎng)基中重懸樣i球，加入20|il細(xì)胞，將管旋轉(zhuǎn)5秒以沉淀微球和CANARY細(xì)胞，并且在光度計(jì)上監(jiān)測光輸出(圖64)。在該圖表中，數(shù)值代表相對于背景數(shù)值(在不具有抗原的測試培養(yǎng)基中的CANRY細(xì)胞)標(biāo)準(zhǔn)化了的峰值光輸出，從而在極右側(cè)的紅色棒設(shè)定為1。所有其它的棒為相對于該對照的最大反應(yīng)。CANARY對在桔汁或PBS/Triton中稀釋的BoNT/AHe的反應(yīng)與在測試培養(yǎng)基中稀釋的BoNTHc(陽性對照)非常類似，對于所有3種這些基質(zhì)具有80ng/ml的LOD。牛奶抑制CANARY反應(yīng)超過5倍。通用的CANARY樣品制備方法可以被用于所有的液體食品基質(zhì)。證明測試不僅對毒素模擬物起作用、并且對活性BoNT/A毒素也起作用是明顯關(guān)鍵的。獲得市售BoNT/A,并且使用6E10-10微球和6B2-2CANARY細(xì)胞進(jìn)行測試(圖65)。測試BoNT/A的檢測極限為約3.2ng/ml或32pg毒素。還不清楚測試靈敏度的這種改進(jìn)是否是由于與BoNT/AHc相比BoNT/A的穩(wěn)定性、或者在兩種制劑之間是否存在抗原性差異。使用由UCSF的JamesMarks博士提供的替代抗BoNT/A抗體組已觀察到類似類型的BoNT/A檢測結(jié)果。迄今，這些抗體的最好組合為微球結(jié)合的S25抗體和表達(dá)Raz抗體的CANARY細(xì)胞(圖66)。目前，使用該不同抗體配對的較低靈敏度的原因還不清楚的。CANARY也可以才全測摻入全血內(nèi)的BoNT7A(圖67)。全血摻有各種濃度的BoNT/A且如前所述制備血漿。6E10-10抗體包被的微球被加入到血漿中，并且孵育2分鐘。在C02I中清洗微球一次，并且使用表達(dá)6B2-2抗體的CANARY細(xì)胞進(jìn)行測試。與對照培養(yǎng)基相比，血清中的檢測極限下降了約5倍，至約16ng/ml(160pg)。替代的微球結(jié)合化學(xué)球也已經(jīng)制備了抗體包被的微球。根據(jù)廠商的說明將可溶性抗體與生物素(PierceBiotechnologyInc)交聯(lián)。該生物素化抗體與磁性鏈霉親和素包被的微球(Dynal,DynabeadsM-280)結(jié)合。最初的試'瞼顯示與磺基-NHS-LC-LC-生物素偶聯(lián)的抗體產(chǎn)生稍好于與磺基-NHS-LC-生物素或磺基-NHS-生物素偶聯(lián)的抗體的信號(圖68)。以該方式產(chǎn)生的6E10-10孩i球能夠以與G蛋白孩i球相似的靈敏度一全測可溶性BoNT/A(圖69)。盡管至今為止，將多種抗體結(jié)合于相同微球的作用還是有限的，但是，使用該技術(shù)可以將多種抗體連接于相同的微球上(圖70)。較少微球與較長時(shí)間的孵育的結(jié)合確實(shí)改進(jìn)了靈敏度(圖71)?！豆那驈钠錁?biāo)準(zhǔn)濃度(每個(gè)測試約300,000)以10倍的系列從IX至0.0001X進(jìn)行稀釋。加入0.32ng/ml的BoNT/A，并且孵育過夜。從含標(biāo)準(zhǔn)(1X)量的微球的樣品中觀察到較差信號，但是具有0.1X和0.01X微球的樣品給出加強(qiáng)的信號。使用G蛋白包被的微球觀察到對BoNT/A靈敏度的類似改進(jìn)。毒素檢測的其它形式毒素的CANARY檢測的其它形式已被預(yù)見，并且進(jìn)行了可行性試驗(yàn)(參見圖72的概括)。這些變型中的幾個(gè)在交聯(lián)抗原呈遞于表達(dá)一種單克隆抗體的CANARY細(xì)胞方面與^:球捕獲是主題上類似的。在途徑2中，例如，抗體包被的微球用CANARY細(xì)胞替代，其本質(zhì)為活的抗體包被微球。表達(dá)抗相同毒素上的不同表位的抗體的兩種CANARY細(xì)胞系在含該毒素的溶液中孵育。一種或兩種細(xì)胞可能具有發(fā)射體分子。在一些例子中，兩種CANARY細(xì)胞包含發(fā)射體分子，其中發(fā)射體分子在不同CANARY細(xì)胞中是不同的。在另一些實(shí)施例中，兩種CANARY細(xì)胞包含相同的發(fā)射體分子類型。在測試中，用毒素修飾兩種細(xì)胞，但是由于毒素是單體的，因此細(xì)胞不被激發(fā)。將細(xì)胞離心至管的底部，其中2種不同CANARY細(xì)胞互相呈遞抗原。該方法比微球呈現(xiàn)毒素有效(LOD=50ng或l|ig/ml濃度)、但較不敏感。在用毒素修飾前，這些細(xì)胞中的一種進(jìn)行固定可能將抗體的運(yùn)動(dòng)更好地限制在膜內(nèi)，因此更好地激發(fā)相對的CANARY細(xì)胞?？蛇x擇的途徑是制備多克隆CANARY細(xì)胞(途徑4)。在單CANARY細(xì)胞系中表達(dá)兩種不同的抗體。因?yàn)檫@些抗體結(jié)合在相同毒素分子上的不同的非重疊表位，因此，可溶性抗原可以直接激發(fā)CANARY細(xì)胞。多重研究已顯示給定的CANARY細(xì)胞系可以表達(dá)多至三種不同的抗體而不影響細(xì)胞對抗原的靈敏度，暗示在相同CANARY細(xì)胞系中表達(dá)2種不同的抗BoNT抗體不應(yīng)該是問題。因?yàn)槲⑶蛱砑硬襟E不是必要的，從而這將筒化測試。然而，樣品制備需要用細(xì)胞測試培養(yǎng)基交換含毒素的溶液。最后的途徑使用相同的CANARY概念，但是不同的細(xì)胞系。在該實(shí)施方式中，制備了表達(dá)Fc受體和水母發(fā)光蛋白的單細(xì)胞系。Fc受體結(jié)合抗體的Fc部分，使抗原結(jié)合區(qū)域空下以結(jié)合目標(biāo)物質(zhì)。加入到這些細(xì)胞中的可溶性抗體在10分鐘內(nèi)產(chǎn)生對所添加的抗體具有特異性的"新"細(xì)胞系。向這些細(xì)胞中加入抗原交聯(lián)Fc受體，激發(fā)水母發(fā)光蛋白的光發(fā)射。該途徑利用抗炭疽桿菌的多克隆和單克隆抗體工作。對于毒素檢測，抗毒素的多克隆抗體(或者抗毒素的兩種單克隆抗體)可以被加入到細(xì)胞中，并且Fc受體通過可溶性抗原交聯(lián)?？蛇x擇的方案通過向測試中加入第三種可溶的抗體可以發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步的改進(jìn)。J.D.Mark博士的實(shí)驗(yàn)室公開的數(shù)據(jù)(Nowal(owski等PNAS(2002)99(17):11346-11350)顯示BoNT/A與一種單克隆抗體一起孵育將抗不同表位的第二種單克隆抗體的表觀親和性增加了約100倍。在該實(shí)施方式中，抗BoNT/A上的第三種表位的可溶性抗體利用抗體包被的微球被加入。第三種抗體與BoNT/A的結(jié)合改進(jìn)了BoNT/A結(jié)合樣O求的動(dòng)力學(xué)特征?？蛇x擇地，當(dāng)生物素化的抗體被引入觀'J試時(shí)不需要出現(xiàn)在樣吏球上?？扇苄陨锼鼗贵w和4連霉親和素^1球可以:坡分別加入。可能這將改善抗體與抗原的結(jié)合，并且生物素-鏈霉親和素相互作用的高親和性將很快使抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合到微球上。G蛋白微球或鏈霉親和素微球的使用是方便的。任何能夠交聯(lián)抗體的載體都可以被使用，如枝狀聚合物、管表面或膜?？梢杂媚軐⒖贵w吸引至表面的任何東西標(biāo)記抗體，抗體能夠從所述表面呈遞"多聚化"的抗原。進(jìn)一步的實(shí)施例2通過CANARY測試4直物病原體的方案植物組織是能夠通過非特異性抑制或激活B細(xì)胞對CANARY測試產(chǎn)生不利影響的復(fù)合基質(zhì)。因而，已發(fā)展了處理植物組織以提取用于通過CANARY檢測的抗原物質(zhì)的特定方法。細(xì)菌抗原物質(zhì)對于封閉木質(zhì)部的植物細(xì)菌病原體，例如但不限于青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum),以下方法被用于提耳又抗原物質(zhì)。*通過在土壤線處切割植物莖的基部回收冠組織。*壓縮的空氣或任何其它去除過量土壤的方法被用于清除莖*距基部切口lcm進(jìn)行第二次切割以產(chǎn)生橫截面塊*使用稍小于莖的直徑的圓形打孔機(jī)挖取截面的核心以去除外層(厚度<lmm)*將核心置于含lmL蒸餾水或CANARY細(xì)胞測試培養(yǎng)基(C02I)的適當(dāng)直徑管內(nèi)，并且浸泡5分鐘參從管中去除核心樣品，旋轉(zhuǎn)振蕩液體樣品的任何部分或所有樣品可以被測試如下在吊斗微離心機(jī)內(nèi)以10K-18KRCF離心樣品2分鐘如果蒸餾水被用于提取，則吸取上清液并棄除，向試管中加入0.5mLCO21,旋轉(zhuǎn)振蕩、并在吊斗微離心機(jī)內(nèi)以10K-18KRCF離心樣品2分鐘如果C02I被用于提取，無需置換步驟向測試管中加入0.02mLCANARY細(xì)胞，離心5秒，并且在光度計(jì)中讀取信號輸出參見圖100。圖表證明利用以上列出和圖101所示的流程檢測到天竺葵提取物中100cfu/mL(5cfu/CANARY測試)青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanaceamm)的情況。#/線#《些辨W由謹(jǐn)."卿」雷爾氏菌感染的組織需要相對較少的樣品制劑。由于細(xì)菌封閉了木質(zhì)部(植物的維管系統(tǒng))，因此，當(dāng)組織樣品置于水下時(shí)，導(dǎo)致出現(xiàn)"細(xì)菌流，，(即向莖的切割端外的細(xì)菌流)。這使得能夠從感染的組織回收雷爾氏菌而不必碾碎樣品，從而免除了乂人潛在的測試干護(hù)乙才直物碎屑中提取細(xì)菌的必要。為了測試植物樣品(在該情況下為天竺葵)，進(jìn)行以下步驟。剛好在土壤上方的莖的區(qū)域一冠部被沿橫截面切割，并且去除殘余土壤。在第一次切割上方lcm進(jìn)行第二次截面切割，并且取下剛稍小于莖的直徑的核心樣品。該方法保持木質(zhì)部完好，但去除了干擾CANARY測試的莖的外殼。然后，將核心樣品在提取培養(yǎng)基中放置5分鐘。因?yàn)樵贑ANARY測試培養(yǎng)基中進(jìn)行提取階段，因此，避免了使樣品與CANARY相容的額外清洗步驟，從而縮短了處理時(shí)間。我們能以與單獨(dú)提取介質(zhì)中的雷爾氏菌(即無植物組織存在)相同水平的靈敏度檢測萌芽的天竺葵提取物中的雷爾氏菌，顯示植物提取物的存在并沒有抑制雷爾氏菌特異性CANARY信號?？膳c背景(即無雷爾氏菌的天竺葵提取物)清晰分辨的信號在從樣品被放入光度計(jì)內(nèi)的時(shí)間開始30秒內(nèi)是明顯的。包括樣品制備的126整個(gè)過程可以在不到10分鐘內(nèi)被完成。該測試能夠檢測每個(gè)CANRY測試少至5cfu的雷爾氏菌。當(dāng)活性雷爾氏菌Rlbvl的8個(gè)不同分離菌被測試時(shí)，從CANARY測試獲得相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。馬鈴薯Y病毒組(Potyvimsgroup)包括最大的、且經(jīng)濟(jì)上最重要的植物病毒組。在CANARYB細(xì)胞上表達(dá)的廣i普反應(yīng)的單克隆抗體PTY1識別隱位(不是在病毒粒子表面上、而是在完整病毒粒子內(nèi)的外衣蛋白亞基上發(fā)現(xiàn)的表位)。這提出了CANARY的特殊問題，其需要病毒上的隱位被暴露以使B細(xì)胞可接近。此處描述的方法通過將馬鈴薯Y病毒與清潔的1-2微米聚苯乙烯微球結(jié)合而暴露隱位，參見圖156。該技術(shù)也利用磁性聚苯乙烯微球進(jìn)行工作。當(dāng)病毒結(jié)合^f效球時(shí)，其導(dǎo)致病毒外殼解開并暴露表位。微球也提供了CANARY測試的第二個(gè)優(yōu)勢。馬鈴薯Y病毒是長的彎曲、絲狀顆粒(12x680900nm)，其不能通過迅速的低速離心被沉淀。通過將病毒附于以低轉(zhuǎn)速非?？焖俚爻恋?、或利用磁體可以被濃縮的微球，CANARY測試對于馬鈴薯Y病毒的靈敏度得到極大提高。不需要特殊的設(shè)備或儀器進(jìn)行包含微球的樣品制備/CANARY測試。參見圖102。圖表顯示利用上述微球吸附方法檢測5ng/mL(0.05ng/CANARY測試)的BYMV(—種馬鈴薯Y病毒)的情況。該方法允許在不到7分鐘內(nèi)完成收集-檢測。關(guān)于6個(gè)其它馬鈴薯Y病毒抹的測試得到類似的檢測極限。^C《:^神(^/z,盧/70ra卿.」檢測經(jīng)濟(jì)上相當(dāng)重要的真菌樣植物病原體-疫霉菌的兩種B細(xì)胞系被研制。從Neogen公司提供的雜交瘤PH3812和PH4831中提取抗體的基因。抗體識別疫霉菌種的菌絲體部分。用于菌絲體提取的樣品制備稍復(fù)雜于用于前述其它兩種病原體的樣品制備。像被馬鈴薯Y病毒感染的組織一樣，其必須被碾碎以釋放生物體。盡管疫霉菌足夠大以能夠通過離心被沉淀，但是千擾測試的植物碎屑發(fā)生共沉淀。除了通過浸解植物組織產(chǎn)生的較大碎屑外，大量的小顆粒(如細(xì)粉)也污染樣品，并且不能通過過濾與疫霉菌分離而不造成病原體的伴隨損失。碎屑通過封閉光檢觀'J和在某些情況下導(dǎo)致非特異性信號干擾CANANRY測試。我們再次采取微球結(jié)合方法進(jìn)行從植物組織提取疫霉菌的樣品制備。與對聚苯乙烯具有天然親和性且無需任何特殊處理就與其快速結(jié)合的馬鈴薯Y病毒不同，疫霉菌不結(jié)合未處理的微球表面。因而，通過被第二疫霉菌特異性抗體(即，識別與在B細(xì)胞的表面上表達(dá)的抗體不同的表位的抗體)包被的磁性微球捕獲疫霉菌菌絲體，從而使病原體被拖離碎屑。使用^茲性"采集筆(pick-pen)",微球結(jié)合的疫霉菌可以容易地被移至測試管，然后CANARY測試可以如前所述進(jìn)行。在樣品制備中的限速步-驟為實(shí)現(xiàn)疫霉菌與抗體包被微球的充分結(jié)合所需的15分鐘。使用該技術(shù)，我們能夠證明對活馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthominfestan)和-束祐又疫霉菌(Phytophthoracapsici)菌絲體的劑量依賴反應(yīng)、以及在萌發(fā)馬鈴薯塊莖提取物中的馬鈴薯晚疫病菌的檢測。由于抗原制劑包括從活躍生長的疫霉菌培養(yǎng)物收獲的研磨菌絲體，因此對于使用疫霉菌的測試并沒有確定LOD。研磨菌絲體的10倍稀釋液被測試，直至信號返回基線(無疫霉菌)水平。遞迎C4iV/1/^^/試-血源病^沐的才案有許多影響CANARY檢測血源病原體的能力的參數(shù)。如同其它復(fù)雜基質(zhì)，血液含有CANARY測試的激活劑和抑制劑。因?yàn)槿遣煌腹獾?，并且病原體可能為細(xì)胞內(nèi)的或者在血樣的流體相內(nèi)，光傳輸被阻止。此外，不同供者的樣品之間的變異性使得開發(fā)出能夠不考慮供者的狀態(tài)的通用樣品制備方法成為必要。此處描述了克服了所有這些問題、并且仍允許檢測血液中的病原體而不犧牲CANARY測試的速度或靈敏度的全血樣品制備過程的方法和設(shè)備。該方法使用市售的血漿分離管(PST)和差異離心方法。該過程使用具有血漿和血細(xì)胞之間的密度的觸變凝膠，當(dāng)離心時(shí)，其在血漿和細(xì)胞之間形成屏障。在比凝膠的密度稍低的血液中出現(xiàn)的細(xì)菌和病毒在離心過程中保留在血漿(流體)相中。然后血漿可以被收獲并在CANARY中測試。用于流體相血源病原體CANARY檢測的設(shè)備和方法由能使全血樣品的分離以三個(gè)快速、簡單步驟進(jìn)行的改良的成品(COTS)部件組裝樣品設(shè)備(圖103)。該設(shè)備包括市售的肝素化毛細(xì)管PST血液收集管。在PST管蓋的上方安裝螺紋連接套環(huán)，PST管蓋頂部已被穿孔。然后塞子被置于套環(huán)的上半部。0.5毫升全血在肝素化的血漿分流管內(nèi)被收集(步驟1)、并且離心90秒(步驟2)。然后用螺紋的1.5mLCANARY測試管代替塞子。然后，通過倒置，在測試管內(nèi)收集分離的含病原體血漿(步驟3),具有50250nL范圍的回收體積。將血漿與0.5mL測試培養(yǎng)基混合(減少在血漿中存在的CANARY細(xì)胞激活劑的影響的方法)、并且將混合物離心以形成病原體球粒。然后，按照標(biāo)準(zhǔn)流程，用病原體特異性CANARY細(xì)月包測試樣品。從血液收集到病原體^f全測的總時(shí)間約為5分鐘。使用以上詳述的簡單的三步方法，使從血液收集到抗原檢測/鑒定的總時(shí)間在約5分鐘內(nèi)，在全血中的鼠疫耶爾森氏菌的檢測極限為1000cfu/mL(125cuf/CANARY測試)。參見圖103。用于細(xì)胞內(nèi)血源病原體的CANARY檢測的設(shè)備和方法對用于分離流體相病原體所研制的設(shè)備進(jìn)行改進(jìn)使得能夠在一個(gè)步驟中回收含細(xì)胞內(nèi)病原體的白細(xì)胞、血漿和流體相病原體。這通過在設(shè)備中加入白細(xì)胞分離培養(yǎng)基(Ficol-泛影葡胺)而被實(shí)現(xiàn)。目前沒有以如此小規(guī)格(即能分離僅0.5mL全血)制造的具有這種構(gòu)造的市售設(shè)備。因此，裝置被組裝如下。代替PST管，空的(無凝膠)毛細(xì)管血收集管被用作基礎(chǔ)管。然后以下組分按其所列順序被添加到該管(注意數(shù)量與設(shè)備正常發(fā)揮^4fe高度相關(guān))。*200jiLFicol-泛影葡胺(FD)*5mm聚酯凝膠*100pL磷酸鹽緩沖液(PBS)*500pL全肝素化或EDTA血液該管構(gòu)造參見圖104.管構(gòu)造與流體相分離所述的管相同，并且進(jìn)行了相同的改造以容納螺紋套環(huán)和前述測試管。一旦血液被加入到管中并且加蓋，將管倒置幾次以混合血液和PBS,然后離心90秒。在圖104中較低的線圖顯示離心后的組分的位置。用CANARY測試管代替塞子，并且通過設(shè)備的倒置收集細(xì)胞、血漿和任何游離的病原體。與流體相病原體回收試驗(yàn)相比，附加步驟在此處是有用的。含病原體的白細(xì)胞應(yīng)被裂解以使抗原物質(zhì)釋方文，從而其對于CANARY細(xì)胞是可以接近的。首先，管以11000RCF離心l分鐘，以使白細(xì)胞和任何游離的(流體相)病原體成團(tuán)。棄除液體，向CANARY測試管中加入市售裂解試劑，然后，旋轉(zhuǎn)振蕩測試管以混合細(xì)胞和裂解試劑。將試管在室溫下孵育5分鐘，偶爾旋轉(zhuǎn)振蕩，然后以11000RCF再離心1分鐘，以使病原體成團(tuán)。去除i^粒上方的裂解試劑，并且向管中加入0.5mLCANARY測試培養(yǎng)基，再次旋轉(zhuǎn)振蕩和離心試管?，F(xiàn)在，樣品已準(zhǔn)備用于CANARY測試，并且遵循標(biāo)準(zhǔn)的單樣品測試形式，即，加入B細(xì)胞，離心5秒，并且在光度計(jì)中記錄光輸出。從收集到檢測的該試驗(yàn)所需的總時(shí)間為12分鐘。鼠疫耶爾森氏菌的檢測極限為1000cfu/mL(參見圖105)。進(jìn)一步的實(shí)施例3CANARYB細(xì)胞沖擊技術(shù)本發(fā)明描述了用于將CANARYB細(xì)胞有效輸送至濕或干沖擊樣品而無需離心的技術(shù)。這些技術(shù)使基于移動(dòng)部件的最小化和時(shí)間間隔光子讀取的較小、較便宜的自動(dòng)CANARY成為可能?？偨Y(jié)性技術(shù)描述該設(shè)備包括使用微滴沖擊以使CANARYB細(xì)胞與調(diào)查的含抗原目標(biāo)物質(zhì)之間的快速相遇最大化的技術(shù)。描述了幾種變型形式(以下列出)，并且以下描述了相關(guān)試驗(yàn)和分析技術(shù)。技術(shù)1"B細(xì)胞噴霧"技術(shù)2"無需離心的CANARY測試"技術(shù)3"CANARYB細(xì)胞沖擊"技術(shù)4"TCAN-3B細(xì)胞輸送概念"技術(shù)5"關(guān)于B細(xì)胞沖擊和CANARY的更新"此處描述的技術(shù)指在抗原收集過程中通過沖擊器將氣溶膠化抗原或抗原溶液微滴撞擊在表面上。隨后，CANARYB細(xì)胞微滴被氣溶膠化并沖擊在相同的表面上。用于沖擊的方法包括從流體庫機(jī)械霧化或噴霧在沖擊的抗原微滴上(技術(shù)13)，或者通過由B細(xì)^^流體庫的快速穿刺而產(chǎn)生的壓力差異(技術(shù)4)。技術(shù)5描述了設(shè)計(jì)為驗(yàn)證B細(xì)胞在該霧化方案過程中的存活率的系列試驗(yàn)。在所有情況下，B細(xì)胞在透明面上快速遇到抗原，所述透明面的下方為光檢測器或光檢測器的光波導(dǎo)器。當(dāng)B細(xì)胞抗體與被沖擊的抗原結(jié)合時(shí)，光發(fā)射，并且通過光檢測器被檢測。通過使光波導(dǎo)器的幾何特征與沖擊嘴的幾何特征匹配，可以改進(jìn)系統(tǒng)的信號與噪音比，沖擊嘴幾何特征可以被用于聚焦收集的抗原和霧化B細(xì)胞溶液。此處描述的設(shè)備或方法可以被用于進(jìn)行CANARY測試而無需離心，從而降低了自動(dòng)識別儀器的復(fù)雜性、并且潛在地改進(jìn)了性能。其使用氣溶膠沖擊作為快速免疫測試的部分。CANARY測試為極快的免疫測試，其沒有當(dāng)前技術(shù)為了引起與抗原結(jié)合而離心B細(xì)月包溶液的所導(dǎo)致的初始時(shí)間延遲。該方法不4又引起時(shí)間延遲，而且更顯著地需要比此處建議的方法更復(fù)雜的設(shè)備(馬達(dá)、結(jié)合和脫離裝置、位置和速度編碼裝置等)。新的技術(shù)使用氣溶膠沖擊以使抗體和抗原接觸。降低的復(fù)雜性也能導(dǎo)致比現(xiàn)有的更小、更便宜的自動(dòng)識別傳感器，這樣提高其作為擴(kuò)散感應(yīng)系統(tǒng)的部分的應(yīng)用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，該設(shè)備可以應(yīng)用如下持續(xù)監(jiān)測或被引發(fā)的生物防御檢測/識別細(xì)胞；人的健康護(hù)理——臨床疾病和疾病狀態(tài)鑒定；環(huán)境取樣和背景植物群鑒定；食品檢測；動(dòng)物健康。寺支術(shù)1:B細(xì)胞噴霧131目的該試驗(yàn)的目的是確定是否利用噴霧器噴霧B細(xì)胞將是一種替代的B細(xì)胞輸送機(jī)制。測量被輸送的細(xì)胞容積、細(xì)胞生存力和活性。試驗(yàn)設(shè)計(jì)輸送可控體積的B細(xì)胞的可替代的方法纟皮研究。對于液體和干才羊品研究被噴霧的B細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)，并且與利用20.uLB細(xì)胞測試的樣品比較。這些試驗(yàn)被測試細(xì)胞數(shù)目、生存力、濃度內(nèi)的活性再現(xiàn)性和背景水平。輸送后旋轉(zhuǎn)細(xì)胞的作用和被噴霧的典型細(xì)胞體積也^L測試。將B細(xì)胞加載于3mL噴霧器Qosina噴霧瓶內(nèi)，并且被用于將細(xì)胞輸送至含Ba或Yp的樣品處。為了確定各噴霧的體積，用2mlC02I填充噴霧瓶，并且將一次噴霧被送至單獨(dú)的埃彭道夫管內(nèi)，直至噴霧弁瓦為空。埃彭道夫管以10，00(kpm離心30秒，并且用移液器測量體積。為了測量細(xì)胞數(shù)目，將BaB細(xì)胞加載于噴霧瓶內(nèi)，并且噴霧到5個(gè)單獨(dú)的埃彭道夫管內(nèi)。埃彭道夫管以10,000rpm離心30秒，并且用移液器測量體積。然后將lOpL細(xì)胞加載于血球計(jì)數(shù)器內(nèi)以進(jìn)行計(jì)數(shù)。將細(xì)胞計(jì)數(shù)與由細(xì)胞制劑的原始管直接計(jì)數(shù)的細(xì)胞比較。為了測量液體樣品的B細(xì)胞活性，用1.5mL埃彭道夫管內(nèi)的試劑制備50jiL樣品，并且以10,000rpm離心2分鐘。對于干樣品，在1.5mL埃彭道夫管內(nèi)制備的5pL試劑用水稀釋，以10，000rpm離心2分鐘，并且干燥過夜。典型地具有34土8pL/噴霧體積的1次噴霧的B細(xì)胞被直接噴到管內(nèi)。然后樣品在樣t離心機(jī)內(nèi)旋轉(zhuǎn)5秒，并且用Berthold光度計(jì)讀數(shù)。結(jié)果結(jié)果顯示各噴霧瓶可以被加載2mL的B細(xì)胞，并且能夠纟皮噴霧45~47次。各噴霧輸送34土8^L/噴霧(n=47)。盡管由原始管直接計(jì)數(shù)的細(xì)胞平均為3.2x105±8x1()4個(gè)細(xì)胞/mL(r^5),但是，噴霧的細(xì)胞顯示1.3x105±2.9x104個(gè)細(xì)胞/mL(i^5)的較低平均值。結(jié)果，輸送的細(xì)胞數(shù)目/樣品對于被噴霧的細(xì)胞為5392土954(n=5)，并且132對于用20(iL移液器輸送的細(xì)胞為5283±76(n=5)。圖106為具有細(xì)胞輸送的Ba標(biāo)準(zhǔn)品的曲線圖。在C02(1)培養(yǎng)基中制備的、并用20jilB細(xì)胞測試的50(1lBa樣品。結(jié)果顯示低背景和50cfuBa的LOD(n=2)。圖107為BaB細(xì)胞噴霧的曲線圖。在C02(I)培養(yǎng)基中制備的、并用不同數(shù)目的B細(xì)胞噴霧測試的50i!lBa樣品。結(jié)果顯示了與20nl細(xì)胞輸送相比，兩次噴霧增強(qiáng)背景。噴霧的數(shù)目并未影響50,000cfuBa(n=l)的峰強(qiáng)度。圖108為具有1-噴霧細(xì)胞輸送的Ba標(biāo)準(zhǔn)品的曲線圖。在C02(I)培養(yǎng)基中制備的、并用一次噴霧的B細(xì)胞測試的50[!lBa樣品。結(jié)果顯示具有20^1細(xì)胞輸送的類似背景和5，000cfu的LOD。50和500cfuBa顯示50。/。的檢測幾率(n=2)。圖109為Ba標(biāo)準(zhǔn)品的曲線圖使用20|tilB細(xì)胞的500cfuBa檢測。在C02(I)培養(yǎng)基中制備具有500cfuBa的50jalBa樣品，并且用20^1B細(xì)胞檢測。即使具有高于常規(guī)所見的背景，結(jié)果也顯示500cfu的100%檢觀'〗(n=3)。圖IIO為BaB細(xì)胞噴霧的曲線圖使用1-噴霧的B細(xì)胞的500cfuBa檢測。在C02(I)培養(yǎng)基中制備具有500cfuBa的50plBa樣品，并且用一次噴霧的B細(xì)胞檢測。結(jié)果顯示500cfu的50%檢測和2-3倍高的背景(n=14)。圖111為BaB細(xì)胞噴霧的曲線圖使用l-噴霧B細(xì)胞、并且無旋轉(zhuǎn)的500cfuBa檢測。在C02(I)培養(yǎng)基中制備具有500cfuBa的50(1lBa樣品，并且用一次噴霧的B細(xì)胞檢測。在讀數(shù)前，樣品未被旋轉(zhuǎn)5秒。結(jié)果顯示沒有細(xì)胞與試劑相互作用，導(dǎo)致500cfuBa的0%檢測(n=3)。圖112為YpB細(xì)胞噴霧的曲線圖使用20|ilB細(xì)胞的500cfuYp檢測。在C02(I)培養(yǎng)基中制備具有500cfuYp的50lalYp樣品，并用20[ilB細(xì)胞檢測。結(jié)果顯示典型背景和500cfuYp的100%檢測(n=4)。圖113為YpB細(xì)胞噴霧的曲線圖使用1-噴霧B細(xì)胞的500cfuYp才企測。在C02(I)培養(yǎng)基中制備50^1具有500cfuYp的Yp樣品，并用一次噴霧的B細(xì)胞4企測。結(jié)果顯示500cfuYp的100%檢測，具有略增加的背景(n=8)。圖114為Yp標(biāo)準(zhǔn)品的曲線圖使用20|ilB細(xì)胞的500cfuBa檢測。在C02(I)培養(yǎng)基中制備50|il具有500cfuYp的Yp樣品，并用20(ilB細(xì)胞檢測。結(jié)果顯示具有典型背景的500cfu的100°/4企測(n=7)。圖115為YpB細(xì)胞噴霧的曲線圖使用20jalB細(xì)胞的500cfu干Yp檢測。在dH20中制備5^1具有500cfuYp的Yp樣品，干燥過夜，并用20jilB細(xì)胞檢測。結(jié)果顯示500cfuYp的100%檢測(n=10)。圖U6為YpB細(xì)胞噴霧的曲線圖使用1-噴霧的B細(xì)胞的500cfu干Yp檢測。在dH20中制備5^1具有500cfuYp的Yp樣品，千燥過夜，并用l-噴霧B細(xì)胞檢測。結(jié)果顯示較高背景，但是500cfuYp具有100%檢測(n=10)。結(jié)論結(jié)果顯示噴霧B細(xì)胞為用于B細(xì)胞輸送的適當(dāng)方法。盡管利用噴霧細(xì)胞數(shù)目降低，但是較大體積使每樣品具有類似數(shù)目的細(xì)胞被輸送。噴霧BaB細(xì)胞繼續(xù)顯示具有50和500cfu的檢測能力，但檢測率為50%。優(yōu)化噴霧條件是可能的，可能通過B細(xì)胞的較高濃度或更新的細(xì)胞，該活性可以被恢復(fù)。BaB細(xì)胞噴霧試-驗(yàn)也顯示對于適當(dāng)?shù)腂細(xì)胞活性仍需要5秒鐘的旋轉(zhuǎn)步驟。有趣地，YpB細(xì)胞噴霧不像Ba檢測影響那么多的B細(xì)胞活性。背景水平保持相似，并且500cfuYp顯示100%;險(xiǎn)測。B細(xì)胞對液體和干才羊品的作用也^皮測試。首先，利用20jil細(xì)胞輸送對濕或干形式的500cfuYp的檢測未發(fā)生變化。盡管利用千樣品與20^1細(xì)胞輸送相比，對于被噴霧的細(xì)胞背景增加，但是千500cfuYP的檢測仍顯示100%檢測。這些結(jié)果表明在經(jīng)歷某些泵輸送裝置后，B細(xì)胞可以保持類似的LOD，并且能夠承受在毛細(xì)或小口環(huán)境中所見的某些壓力。噴霧B細(xì)胞輸送可有助于野外試驗(yàn)，其中儲(chǔ)存和輸送在同一個(gè)部分內(nèi)，并且不需要移液器。技術(shù)2:無離心的CANARY測試CANARY測試。CANARY為快速靈敏的生物測試。其<吏用當(dāng)結(jié)合抗原時(shí)發(fā)射萸光的B細(xì)胞的改進(jìn)系?？乖?xì)胞被離心或在表面上凈皮沖擊。然后，B細(xì)胞被離心到這些細(xì)胞上，并且通過光度計(jì)測量熒光。許多方案(如BCAN和TCAN)使用CANARY現(xiàn)場檢測病原體，將氣溶膠收集和沖擊與CANARY測試結(jié)合。原有CANARY系統(tǒng)在CANARY現(xiàn)場檢測器的當(dāng)前版中，笨重的離心設(shè)備和并奇細(xì)的光學(xué)設(shè)備必須在小空間內(nèi)被組合。這種需求使這些檢測器的設(shè)計(jì)和構(gòu)造變得麻煩。去除離心降低了設(shè)計(jì)成本、建造成本和維修成本，另外提高了可靠性。我們描述了使用沖擊的替代的技術(shù)。沖擊B細(xì)胞的可選擇的技術(shù)為了避免由于離心的花費(fèi)和設(shè)計(jì)復(fù)雜化，已建議了幾種方法作為將B細(xì)胞移至結(jié)合表面的替代方法。這些包括在細(xì)胞內(nèi)磁性樣O求的操控、熱泳、電泳和聲學(xué)處理。各個(gè)方法都需要開發(fā)和細(xì)化作為CANARY系統(tǒng)內(nèi)的新技術(shù)。建議的技術(shù)此處描述了以新穎方式使用CANARY技術(shù)的技術(shù)，尤其通過沖擊使B細(xì)胞結(jié)合抗原的方式。該技術(shù)使用與BCAN或TCAN中所用的非常相似的沖擊。B細(xì)胞溶液通過抗原細(xì)胞沖擊嘴被噴霧。因?yàn)槠漭^大的質(zhì)量，所以，即使B細(xì)胞在溶液中，其仍沖擊在沖擊面上。這在以下部分更詳細(xì)地被描述。噴霧為與生物氣溶膠收集所用相同的流速。因此，用于生物氣溶膠收集的相同的泵可以驅(qū)動(dòng)B細(xì)胞沖擊。B細(xì)胞沖擊的物理學(xué)顆粒通過液體的沖擊與顆粒通過氣體的沖擊類似。當(dāng)流體流線因物理障礙而突然改變方向時(shí)，流體內(nèi)足夠大的顆粒穿過流線、并與障礙物發(fā)生撞擊。描述撞擊可能性的無量綱參數(shù)為斯托克數(shù)(Stokesnumber)。其為顆粒的停止距離與障礙的尺寸的比值。斯托克數(shù)約為加-tU/D其中，U為朝向障礙物移動(dòng)的流體速度，D為障礙物的尺寸和t為顆粒弛豫時(shí)間。所述弛豫時(shí)間為顆粒直徑、顆粒密度和流體粘性的函數(shù)。對于從噴嘴出流到?jīng)_擊面上的流體，D為噴嘴的直徑。對于沖擊嘴的顆粒臨界直徑的等式為其中5V/U為常數(shù)(0.5),n為流體粘度(對于水為O.OIP，對于空氣為0.0002P)，并且g為流速。對于BCAN，g為21pm，且D為O.lcm。然后，對于水計(jì)算的Jw為6微米，對于空氣為0.8樣i米。因此，相同的沖擊波導(dǎo)管可以被用于沖擊空氣中的顆粒、以及沖擊溶液中的B細(xì)胞。新方法具有多種優(yōu)點(diǎn)。該新技術(shù)免去了B細(xì)胞離心步驟。該方法快——其僅需數(shù)秒以沖擊B細(xì)胞。在PMT附件中無移動(dòng)部件，這意味著PMT具有較長的運(yùn)轉(zhuǎn)壽命，并且，其可以被定位以獲得更靈敏的信號。與基于離心機(jī)的設(shè)備相比，該檢測器并不昂貴，并且是結(jié)實(shí)的。通過改造現(xiàn)有的BCAN或TCAN,其制造容易。技術(shù)3:CANARYB細(xì)胞沖擊目的為了研制不涉及離心步驟的用于CANARY現(xiàn)場設(shè)備的可替代的B細(xì)力包輸送方法。試驗(yàn)設(shè)計(jì)早期CANARY方案對于B細(xì)胞輸送需要以500g離心5秒的步驟。然而，通過對包括如B細(xì)胞和PMT的精細(xì)組分的自動(dòng)系統(tǒng)設(shè)置苛刻的設(shè)計(jì)限制，離心樣品限制了CANARY現(xiàn)場設(shè)備的有效性。此處描述的新方法通過以與BCAN或TCAN系統(tǒng)類似的方式?jīng)_擊抗原物質(zhì)和B細(xì)胞從而免去了額外的移動(dòng)部件。其不同于其中僅抗原物質(zhì)被沖擊的現(xiàn)有方法。結(jié)果，唯一的移動(dòng)部件為用于噴霧B細(xì)胞的閥，其被安裝于距結(jié)合面一定距離處。在該新方法中，B細(xì)胞微滴在沖擊流中被分散。在技術(shù)1"B細(xì)胞噴霧"中的試驗(yàn)顯示B細(xì)胞至少在某形式的霧化中存活。在技術(shù)2"無離心的CANARY測試，，中的計(jì)算顯示B細(xì)胞通過以BCAN中所用的流速流動(dòng)的水性溶液進(jìn)行沖擊。因?yàn)锽CAN具有1微米的沖擊臨界值，所以，具有10微米直徑和更高直徑的B細(xì)胞微滴在由使用相同流速的BCAN泵所提供的氣流內(nèi)容易發(fā)生沖擊。由于微滴尺寸遠(yuǎn)小于BCAN嘴，因此，噴嘴處的損失可以忽略不計(jì)。是否B細(xì)胞在沖擊中存活僅能通過試驗(yàn)確定。該新的噴霧方法去除了用于抗原物質(zhì)沖擊、B細(xì)胞沖擊和PMT測量三個(gè)操作的移動(dòng)部件。結(jié)果，這樣簡化了用于B細(xì)胞可以以一定距離儲(chǔ)存在單儲(chǔ)存庫中的野外設(shè)備的設(shè)計(jì)需要。因?yàn)闅饬鞑恍枰cB細(xì)胞添加分離，所以在沖擊器內(nèi)使用單閥裝置。該技術(shù)需要能夠氣溶膠化10或20微米液滴的擴(kuò)散器。用于生物氣溶膠的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)散器柯立森霧化器對大于5微米的液滴具有低效率。兩種可替代的噴霧器已被考慮。第一種為從Qosina得到的、且為化妝品工業(yè)研制的定量噴霧器。某些試驗(yàn)顯示顆粒尺寸為10微米或更大，并且產(chǎn)生氣溶膠脈沖。這些噴霧器各價(jià)值$1。用于這些顆粒尺寸的另一種類型的噴霧器為用于連續(xù)流的超聲噴霧器。生產(chǎn)超聲噴霧器系統(tǒng)的兩家公司為Sono-tek和Sonaer。這些系統(tǒng)價(jià)值$7.5k$15k。用BCAN原型測試Qosina噴霧器的試驗(yàn)設(shè)定如下(參見圖117)。將盤置于為BCAN試驗(yàn)制造的沖擊裝置內(nèi)。其包括沖擊嘴、支承沖擊盤的孔和出口倒鉤。所述倒鉤通過管與旋轉(zhuǎn)流量計(jì)、HEPA濾器和以接近5lpm的流速運(yùn)行的泵連接。管將裝置的入口與三通管連接，所述三通管的一端對周圍空氣是開放的，另一端對Qosina噴霧器開放，所述Qosina噴霧器包含B細(xì)胞溶液。將PMT置于玻璃盤的下方。因?yàn)镻MT對光敏感，因此，將沖擊裝置和PMT置于暗箱內(nèi)。暗色管將出口與旋轉(zhuǎn)流量計(jì)連接，將入口與三通連接。在測試過程中，抗原物質(zhì)模擬物將被點(diǎn)在玻璃沖擊盤上，并且將盤置于裝置內(nèi)。其次，啟動(dòng)泵，B細(xì)胞從噴霧器噴出。此時(shí)，如果B細(xì)胞在噴霧和沖擊中存活的量足夠，可以預(yù)期從PMT得到發(fā)光信號。支持測試為將B細(xì)胞沖擊在無抗原物質(zhì)的盤上，以測試單獨(dú)的沖擊不導(dǎo)致B細(xì)胞發(fā)光。技術(shù)4:TCAN-3B細(xì)胞輸送概念目的目前，TCAN-2生物傳感器包括控制B細(xì)胞釋放和輸送的COTs喇叭閥。該喇叭閥即昂貴且笨重。此外，喇叭閥內(nèi)的彈簧在^f吏用前必須移開以在離心步驟過程中保持閥開放。該技術(shù)建議了基于伯努利原理的簡單應(yīng)用的B細(xì)胞釋放和輸送的可替代方案。概念該建議的概念利用了將B細(xì)胞從液體池吸入氣溶膠通路的氣溶膠收集泵。這通過用在氣溶膠收集過程中關(guān)閉的箔封條密封B細(xì)胞儲(chǔ)存庫而被實(shí)現(xiàn)。在氣溶膠收集后，封條被穿孔，導(dǎo)致氣溶膠通路和儲(chǔ)存庫之間的壓力差(AP)。該概念基于伯努利原理，其闡述了流體的壓力隨速度反向變化；因而，空氣速度增加將產(chǎn)生壓力下降。此概念的原理與常規(guī)噴霧器相同。大多數(shù)噴霧器通過在液體儲(chǔ)存庫上方產(chǎn)生氣流而工作。快速移動(dòng)的空氣在入口處降低壓力，基于壓力差將液體吸入氣體通路內(nèi)。伯努利原理P/p+l/2V2+f常數(shù)P^壓力；p4危體密度；V二速度；g二重力加速度；z^高度因?yàn)榛诶硐氲臍怏w法則，尾端壓力(P2)與入口壓力(P,)平#f,所以在刺穿封條前B細(xì)胞應(yīng)保持在池中。假定溫度保持相同，當(dāng)流體塞被拖到氣溶膠通路內(nèi)時(shí)，氣體的體積(V2)也增加，導(dǎo)致尾端壓力(P2)下降。尾端壓力將與入口壓力實(shí)現(xiàn)自我平衡，直至封條撕破。在封條撕破后，尾端壓力與周圍的大氣壓力平衡。理想氣體法則PV=nRT設(shè)計(jì)參數(shù)有多個(gè)需要完成的關(guān)鍵試驗(yàn)。關(guān)鍵的設(shè)計(jì)參數(shù)包括確定儲(chǔ)存庫通道的理想直徑和幾何形式。該直徑將影響液體-氣體界面處的表面張力。由于毛細(xì)管內(nèi)的表面張力導(dǎo)致的壓力差如下(對于水，表面張力二Y二0.073N/m)AP=2Y/半徑隨半徑減小，將液體從儲(chǔ)存庫吸出所需的壓力也增加。結(jié)論該釋放和輸送B細(xì)胞的方法簡化了在TCAN-2中目前被使用的CD的設(shè)計(jì)。該方法也降低了CD的成本和尺寸，導(dǎo)致部件的生產(chǎn)更^更宜和簡單。該技術(shù)可以被用于此處所描述的非離心B細(xì)胞輸送方法。技術(shù)5:關(guān)于B細(xì)胞沖擊和CANARY的進(jìn)一步試驗(yàn)此處描述的方法通過在抗原基底上沖擊B細(xì)胞微滴從而將B細(xì)胞靶定在抗原上。這尤其適于CANARY干式?jīng)_擊。將B細(xì)胞置于與抗原相同的位置處，因?yàn)樗麄兺ㄟ^相同的裝置被放置。B細(xì)胞遭受的過量應(yīng)力為氣溶膠化所致。具體地說，在氣溶膠運(yùn)送和氣溶膠沖擊過程中發(fā)生的應(yīng)力。在生物氣溶膠產(chǎn)生過程中，細(xì)胞可能遭受劇烈的機(jī)械應(yīng)力，并且?guī)щ?。在輸送階段中，液滴可能發(fā)生溶劑蒸發(fā)和溶質(zhì)濃度改變。這些影響可能導(dǎo)致脫水、氧中毒、和滲透壓不平衡。在沖擊階段中，顆粒再次遭受機(jī)械應(yīng)力。所有這些影響可能滅活B細(xì)胞，阻礙其作為抗原檢測器的應(yīng)用。在FACS分析過程中B細(xì)胞沒有被氣溶膠化滅活，細(xì)胞生存能力也沒受到影響。在FACS/流式細(xì)胞分析過程中，F(xiàn)ACS機(jī)器每次一個(gè)地將細(xì)胞分散到微滴(即氣溶膠)內(nèi)，并且，微滴進(jìn)行光學(xué)分析，然后(任選地)將微滴在管中收集用于進(jìn)一步分析。在沖擊到干管中后，即使存在離子螯合劑時(shí)，B細(xì)胞也存活數(shù)小時(shí)。1小時(shí)后，僅10%的細(xì)胞損失。因此，足夠CANARY檢測的B細(xì)胞在不到一秒的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行沖擊。139測試研究為了進(jìn)一步研究氣溶膠化對B細(xì)胞的影響，將抗原置于FACS分選機(jī)測試管的底部。然后，通過FACS設(shè)備處理CANARYB細(xì)胞。然后，測試管可以在光度計(jì)內(nèi)分析CANARYB細(xì)胞的光子發(fā)射。陰性對照在管中省略抗原。此外，抗原和CANARY細(xì)胞一同沖擊在管內(nèi)的情況可以被測試。進(jìn)一步的實(shí)施例416通道傳感器此處描述的是精制和改進(jìn)的16通道傳感器，其提供與利用單通道系統(tǒng)所觀察到的相同靈敏度水平(圖121)。該便攜式樣機(jī)適于外部驗(yàn)證和測試。特別地，其使用單光采集通道同時(shí)測量16個(gè)樣品。該傳感器由轉(zhuǎn)子組成，該轉(zhuǎn)子支持有16個(gè)圍繞其圓周水平、均勻分布的測試管，并且由繞垂直軸的可變速馬達(dá)驅(qū)動(dòng)。單固定光子檢測部件，此時(shí)為PMT，被置于轉(zhuǎn)子的平面內(nèi)恰好在管旋轉(zhuǎn)過程中的路徑之外。這樣，使各個(gè)管順序、反復(fù)地緊密接近PMT，使其光輸出在各次通過時(shí)被采樣。最后，由光源(紅外LED)和檢測器(光電晶體管)組成的光開關(guān)被用于控制檢測到的光子的計(jì)數(shù)和16個(gè)域內(nèi)的數(shù)據(jù)的再組織，各域與特定的樣品相關(guān)。單次測量包括1、在各個(gè)管中制備16個(gè)樣品(和/或?qū)φ?。2、使用包括但不限于人工轉(zhuǎn)移、自動(dòng)轉(zhuǎn)移、膠嚢或泡包裝的各種方法中的任一種向各個(gè)試管內(nèi)引入等份的B細(xì)胞。3、將測試管安裝于轉(zhuǎn)子中。4、以相對高的離心力(RCF)(2000g)短暫(5秒)離心旋轉(zhuǎn)將B細(xì)胞定位至管底部。5、在測量過程中(12分鐘)降低轉(zhuǎn)子的速度至10120rpm,每次S走轉(zhuǎn)各管被采樣一次。6、產(chǎn)生各個(gè)樣品的光子計(jì)數(shù)的時(shí)間序列以進(jìn)行顯示和/或輸入用于評估的計(jì)算機(jī)算法。非離心測試形式可用于以臨床、即時(shí)和前線應(yīng)用為目標(biāo)的小型手持傳感器的其它測試形式也在此被描述。通常，在開發(fā)過程中的目標(biāo)為確定能簡化CANCARY測試程序和其所需硬件，同時(shí)盡可能保持較高速度和靈敏度的形式。具體地說，注重實(shí)現(xiàn)能夠降低或去除離心步驟需求的替代測試程序，因?yàn)殡x心步驟是當(dāng)前能耗和儀器復(fù)雜的主要原因。關(guān)于使用表面結(jié)合目標(biāo)物質(zhì)的物理處理、微流槽、管吸裝置、過濾或磁性微球捕獲的測試形式的許多途徑已被實(shí)驗(yàn)'性評估。以下詳細(xì)描述側(cè)向流裝置和尤其是磁性微球捕獲的應(yīng)用。表面結(jié)合顆粒的物理處理(也稱作"針頭")方法這是一類通過(以及最初的測試使用)常規(guī)直的大頭針啟示的用于使用CANRYB細(xì)胞的非離心方法。實(shí)踐中，直的大頭針可以被滿足3個(gè)基本標(biāo)準(zhǔn)的任何適合固體表面取代1)表面不激發(fā)B細(xì)胞鈣流，2)表面能夠以不改變CANARYB細(xì)胞上的抗體與被結(jié)合的目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合的能力的方式容納和保留/結(jié)合目標(biāo)物質(zhì)，以及3)表面易于物理處理以使其與在反應(yīng)容器的表面上的B細(xì)胞(發(fā)射體細(xì)胞)層接集到"針頭"上(圖122)，并且隨后被呈現(xiàn)給等份的固定B細(xì)胞(圖123),如果被收集的樣品包括那些細(xì)胞表達(dá)抗體的抗原，弱光信號將被產(chǎn)生，并且通過靈敏的光度計(jì)被收集。在離心的CANARY方法中，被測試的顆粒(包括細(xì)菌、病毒或毒素)通過氣體沖擊(如在BCAN內(nèi))、或者，對于液體樣品，通過長時(shí)間(>2分鐘)、有力(>10KRCF)離心"預(yù)旋轉(zhuǎn)"被定位于樣品位置(這些樣品制劑之一在樣品點(diǎn)附近有效地將顆粒濃縮在小體積中)。然后，將CANARYB細(xì)胞引入樣品容積內(nèi)，并且在短暫(《5秒)、輕柔(-500RCF)細(xì)胞輸送旋轉(zhuǎn)后，其被帶到其中他們可以遇到顆粒的樣品位點(diǎn)處。因?yàn)槠鋵細(xì)胞移至樣品表面需要短時(shí)間，所以這些相遇在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生；所得的B細(xì)胞的發(fā)光被同步以產(chǎn)生#皮檢測光子的可識別圖形形式的更清楚的可識別信號。141針頭方法在表面上或表面附近實(shí)現(xiàn)顆粒和B細(xì)胞相似的濃縮被測試的顆粒通過多種方式在表面(針頭)上被收集，并且該表面被物理操縱到提前布置的B細(xì)胞薄層(重力沉降、預(yù)旋轉(zhuǎn)、或生長粘附于表面)。這又導(dǎo)致B細(xì)胞的同步激活，導(dǎo)致足夠強(qiáng)的信號。這些概念的第一個(gè)試驗(yàn)驗(yàn)證包括在針頭上干燥2pL含有已知量的抗原模擬物的樣品，以及將這些針頭引入固定的(通過離心)等份的多種B細(xì)胞系(各"系"被表達(dá)已知試劑或模擬物的抗體的B細(xì)胞克隆群)。當(dāng)使用相應(yīng)抗原和細(xì)胞系時(shí)觀察到強(qiáng)反應(yīng)，而在錯(cuò)配的情況下未觀察到信號(圖124顯示典型的劑量反應(yīng))。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)性驗(yàn)證包括與圖122(b)類似的條件中靜電收集Bs孢子。使用空氣中大概相似濃度的Bs孢子、固定氣流速度、并且改變收集時(shí)間，當(dāng)將收集針引入固定的含表達(dá)Bs抗體的B細(xì)胞的管內(nèi)時(shí)，觀察到劑量反應(yīng)(圖125)。雙重磁性樣i球測試此處描述了利用兩組磁性微球的測試。一組為CANARYB細(xì)胞特異性的，而另一組為特定抗原物質(zhì)特異性的。這些抗原物質(zhì)特異性農(nóng)么球能對特定類的抗原物質(zhì)(如，呂^111+/-細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì)、DNA等)(例如參見US2005/118570和美國專利11/056,518,通過引用所有這些的教導(dǎo)內(nèi)容被包含在此處)具有通用親和性，或者具有對單抗原物質(zhì)的特異性親和性。在圖127中，在雙重微球測試旁邊進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)CANARY測試。鼠疫耶爾森氏菌特異性磁性微球與鼠疫耶爾森氏菌劑的稀釋液系列混合5分鐘。5分鐘后，磁性微球與任何結(jié)合的鼠疫耶爾森氏菌一起被拖到測試管的底部，并且棄掉上清液。然后，向樣品中加入磁性標(biāo)記的B細(xì)胞，并且向下拖至管的底部。迄今，用磁性微球定位抗原物質(zhì)和B細(xì)胞已證明提供了與離心相似的靈敏度。管吸形式此處描述了使管吸和過濾材料成層以實(shí)現(xiàn)樣品液輸送和抗原定位而無需離心的設(shè)備內(nèi)的CANARY測試。該設(shè)備的基本構(gòu)造和表明其定位孢子大小的顆粒的能力的圖片如圖128和129所示。1圖130顯示了使用相同抗原物質(zhì)和細(xì)胞樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)離心測試和側(cè)向流測試所得的CANARY信號。這些和其它試驗(yàn)已顯示盡管在側(cè)向流測試中可以使用B細(xì)胞，但是信號-噪音水平有低于離心測試的傾向，因此降低了整體LOD。降低的信號強(qiáng)度表明該形式在定位抗原顆?；蛘弋?dāng)其到達(dá)過濾材料上的顆粒時(shí)使B細(xì)胞同步呈現(xiàn)方面、或者在兩方面都是不夠有效的。也觀察到背景水平的增加。這些隨管吸材料和流速的不同而在強(qiáng)度方面發(fā)生變化，并且通常與預(yù)料由于增加的表面粘附和液體剪切力導(dǎo)致的對B細(xì)胞的機(jī)械應(yīng)力增加的材料和流速相關(guān)?？赡艿难a(bǔ)救包括選擇使用對機(jī)械應(yīng)力具有較高抗性的B細(xì)胞、使用低水平的清潔劑以降低系統(tǒng)剪切應(yīng)力、降低捕獲區(qū)的厚度和大小以確保所有被捕獲的抗原可以被B細(xì)胞發(fā)現(xiàn)、以及通過降低管吸帶的長度降低剪切應(yīng)力。最初設(shè)備使用0.2pm濾器用于捕獲，但可以與捕獲小于0.2|am的顆粒的微球結(jié)合。進(jìn)一步的實(shí)施例5自動(dòng)CANARY生物氣溶膠傳感器實(shí)施方式此處描述了在自動(dòng)傳感器中通過慣性沖擊的氣溶膠收集與CANARY鑒定的結(jié)合，以證明在90秒之少的時(shí)間內(nèi)收集和鑒定氣源病原體。對于其它自動(dòng)生物氣溶膠收集和鑒定設(shè)備目前所報(bào)道的最快反應(yīng)為〉18分鐘，因此，與現(xiàn)有技術(shù)的當(dāng)前狀態(tài)相比，這代表了超過一個(gè)數(shù)量級的改進(jìn)。基于該設(shè)計(jì)的兩個(gè)實(shí)施方式，BCAN和TCAN傳感器(圖131)已制造并測試，此處描述了引入下一代CANARY技術(shù)中的關(guān)鍵材料、方法和裝置，我們稱之為PANTHER(威脅環(huán)境排放物的病原體分析儀(PahtogenAnalyzerforThreateningEnvironmentalRelease),圖131)。在相關(guān)圖及其圖例中(圖131-137)描述了核心技術(shù)的關(guān)鍵細(xì)節(jié)，并能夠被總結(jié)如下1)含被分析的氣溶膠顆粒的空氣通過4.75"直徑的盤吸入，該盤具有引導(dǎo)并加速氣流通過16或更多通道的特征，所述通道具有使氣流攜帶的氣溶膠顆粒沖擊在盤表面的易于直接進(jìn)行CANARY分析的適當(dāng)定形區(qū)域內(nèi)的幾何學(xué)特征。2)CANARYB細(xì)胞被分成16或更多獨(dú)立等份儲(chǔ)存于儀器中，小份的細(xì)胞可以使用多種現(xiàn)有的裝置自動(dòng)釋放并經(jīng)短暫(不到5秒)旋轉(zhuǎn)可以被輸送至各個(gè)氣溶膠收集位點(diǎn)。3)旋轉(zhuǎn)力使CANARYB細(xì)胞和收集的顆粒之間接觸，并且從任何含有CANARYB細(xì)胞的病原體目標(biāo)的樣品發(fā)射光。盤在反應(yīng)區(qū)內(nèi)對于光的發(fā)射波長是透明的，并且使用光子計(jì)數(shù)光檢測裝置(如光電倍增管)收集并定量發(fā)射的光。4)如上描述的多個(gè)盤被負(fù)載在提供儲(chǔ)存、運(yùn)輸、處理和數(shù)據(jù)分析的設(shè)備上。該儀器的運(yùn)行提供能夠在90秒之少的時(shí)間內(nèi)鑒別氣源病原體的病原體收集和分析能力。附錄縮略詞/符號定義AC交流空軍基地三磷酸腺苷生物試劑警告?zhèn)鞲衅鰾cl2-樣11Bcl2修飾因子肉毒毒素A肉毒毒素A重鏈AFBATPBAWSBcl2UlBmfBoNT/ABoNT/AHcCANARYAnalysisandNotificationofAntigenRisksandYoelds)CCD電荷偶聯(lián)設(shè)備CDC疾病控制中心COTS市售成品CPT細(xì)胞制備管CRET化學(xué)能量共振轉(zhuǎn)移DC直流DEP》又向電泳DMSO二甲亞砜DNA脫氧核糖核酸DoD國防部EBs原生小體EGFP增強(qiáng)的綠色熒光蛋白FcyRIFcy受體IFMD口蹄疫GADD45P卩生長阻礙和DNGFP綠色熒光蛋白GST谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶HA紅血球凝聚素HBSSHanks平纟軒鹽〉容液Hells解旋酶，淋巴特異性的HistlHlc組蛋白lHlcHSF1熱激因子1歴y干擾素yLD5050%致死劑量LOD檢測極限NiCd鎳-鎘PBS磷酸鹽緩沖液PCR聚合酶鏈反應(yīng)Pdcdllgl程序細(xì)胞死亡1配體PMT光電倍增管PST血漿分離管RCF相對離心力RLU相對光單位TCA三氯乙酸Tx-100TritonX-100USAMRIID美國軍方傳染病醫(yī)學(xué)研究所VEE委內(nèi)瑞拉馬腦炎盡管本發(fā)明已參照其優(yōu)選實(shí)施方式被具體顯示和說明，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，在其中可以進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的改變，而不背離通過附加權(quán)利要求所選定的本發(fā)明的范圍。此處引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和專利申請的教導(dǎo)內(nèi)容通過弓)用而^皮全部包含于此。權(quán)利要求1、一種用于檢測樣品中可溶性抗原的方法，包括a)向樣品中加入發(fā)射體細(xì)胞，其中所述發(fā)射體細(xì)胞包含受體和響應(yīng)于樣品中的目標(biāo)抗原與所述受體的結(jié)合而發(fā)射光子的發(fā)射體分子；b)檢測光子發(fā)射，其中光子發(fā)射為樣品中可溶性抗原的指示。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述可溶性抗原為核酸、毒素、肽、化學(xué)物質(zhì)、病毒或其組合。3、一種用于檢測樣品中的可溶性抗原的設(shè)備，其中，該抗原被發(fā)射體細(xì)胞上的受體結(jié)合，所述發(fā)射體細(xì)胞包含受體和響應(yīng)于樣品中的目標(biāo)抗原與所述受體的結(jié)合而發(fā)射光子的發(fā)射體分子，其中所述設(shè)備檢測光子的發(fā)射，從而檢測樣品中的可溶性抗原。4、如權(quán)利要求3所述的設(shè)備，其中所述設(shè)備為手持設(shè)備。5、一種用于檢測空氣樣品中的目標(biāo)顆粒的方法，包括a)向基底上沖擊氣體樣品；b)向基底加入發(fā)射體細(xì)胞，其中所述發(fā)射體細(xì)胞包含受體和響應(yīng)于目標(biāo)顆粒與所述受體的結(jié)合而發(fā)射光子的發(fā)射體分子；c)檢測光子，其中光子發(fā)射為空氣樣品中目標(biāo)顆粒的指示。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述基底為針頭。7、如權(quán)利要求5所述方法，其中所述發(fā)射體細(xì)胞為B細(xì)胞。8、如權(quán)利要求5所述方法，其中所述受體為抗體。9、如權(quán)利要求8所述方法，其中所述抗體為抗免疫球蛋白抗體。10、如權(quán)利要求5所述方法，其中所述受體為Fc受體。11、如權(quán)利要求5所述方法，其中所述空氣樣品中的目標(biāo)顆粒為化學(xué)物質(zhì)、爆炸物顆粒或生物顆粒。12、一種用檢測空氣樣品中的目標(biāo)顆粒的設(shè)備，包括a)向基底上沖擊氣體樣品的裝置，其中，將發(fā)射體細(xì)胞加入所述基底，并且其中所述發(fā)射體細(xì)胞包含受體和響應(yīng)于目標(biāo)顆粒與所述受體的結(jié)合而發(fā)射光子的發(fā)射體分子；b)檢測光子發(fā)射的裝置，其中光子發(fā)射為空氣樣品中目標(biāo)顆粒的指示。13、如權(quán)利要求12的設(shè)備，其中所述設(shè)備為手持設(shè)備。14、一種4全測植物病原體的方法，包括a)制備包括植物病原體的植物樣品；b)向所述植物樣品中加入發(fā)射體細(xì)胞，其中所述發(fā)射體細(xì)胞包含受體和響應(yīng)于樣品中的植物病原體與所述受體的結(jié)合而發(fā)射光子的發(fā)射體分子；c)檢測光子發(fā)射，其中光子發(fā)射為樣品中植物病原體的指示。15、一種用于4企測臨床樣品中的病原體的方法，包括a)制備用于測試病原體的臨床樣品；b)向樣品中加入發(fā)射體細(xì)胞，其中所述發(fā)射體細(xì)胞包含受體和響應(yīng)于樣品中的病原體與所述受體的結(jié)合而發(fā)射光子的發(fā)射體分子；c)檢測光子發(fā)射，其中光子發(fā)射為樣品中病原體的指示。16、如權(quán)利要求15所述方法，其中所述臨床樣品為鼻拭子、尿樣、唾液樣品或血樣。17、如權(quán)利要求15所述方法，其中所述病原體為細(xì)菌、病毒或毒素。全文摘要此處描述的本發(fā)明提供了檢測如病原體、可溶性抗原、核酸、毒素、化學(xué)物質(zhì)、植物病原體、血源病原體、細(xì)菌、病毒等目標(biāo)顆粒的方法。本發(fā)明也描述了一種包含受體的發(fā)射體細(xì)胞，其中所述受體可以為抗體或Fc受體，以及用于檢測樣品中的目標(biāo)顆粒的發(fā)射體分子，其中，被檢測的目標(biāo)顆粒被發(fā)射體細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)受體結(jié)合。本發(fā)明也提供了用于檢測樣品中(包括多個(gè)樣品)的目標(biāo)顆粒的光電傳感器設(shè)備。文檔編號G01N33/566GK101495869SQ200680051617公開日2009年7月29日申請日期2006年11月30日優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日發(fā)明者A·赫夫,B·約翰遜,E·施沃貝爾,F·納爾吉,J·哈珀,J·拉西里格諾拉,K·霍根,M·S·佩特羅維克,M·亨尼西,M·霍利斯,R·馬修斯,S·帕爾喬德休里,T·維安,T·賴德申請人:麻省理工學(xué)院