專利名稱：基于液相色譜法的分析方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種液相色譜法，將分析試料與流動相一齊導入分離柱， 并通過檢測器檢測由該柱分離后洗脫出的試料的成分。
背景技術：
液相色譜法(liquid chromatography)作為分析試料成分的分析技術 正得到廣泛應用。液相色譜法是利用物質(zhì)相對于固定相與流動相(mobile phase)的這兩相的分布狀態(tài)的差別進行分離的方法，所述固定相形成在 柱填充劑表面上或在毛細管內(nèi)面上，所述流動相流經(jīng)填充材料的間隙，試 料中的各成分根據(jù)其化學性質(zhì)以不同的速度流過分離柱。
在對化學性質(zhì)相互相差甚遠的多種物質(zhì)一齊進行分析時，分析所需要 的時間會變長，但是由于若流動相的組成變化則物質(zhì)的分布狀態(tài)變化，通 常采用使流動相組成隨時間改變并在維持分離狀態(tài)的同時縮短分析時間 的流動相組成梯度洗脫法。
圖4中表示使用了流動相組成梯度洗脫法的液相色譜儀。
在用于輸送流動相l(xiāng)a、 lb的流動相送液流路2a、 2b上分別設置有送 液泵5a、 5b。送液泵5a、 5b通過控制電動機的轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)送液量。流動 相送液流路2a、 2b在混合器11處進行合流，混合器ll將流動相l(xiāng)a、 lb 混合后輸送到分析流路12。在分析流路12中隔著試料注入部7設置有分 離柱(separation column) 15，并在柱15的下游設置有檢測器19。
自試料注入部7注入的試料通過由混合器11混合后的流動相而被導 入分離柱15中，按每個成分進行分離，由檢測器19檢測分離后的試料成 分。
送液泵5a、 5b通過控制裝置21控制各自的送液量，并按照用于實現(xiàn) 梯度洗脫法的規(guī)定的送液程序來改變送液量。
在這種液相色譜儀中，例如，如圖5所示，從流動相八為100%、流
動相B為0%的送液狀態(tài)開始分析，以漸漸地減小流動相A的濃度、增加 流動相B的濃度的方式來改變流動相組成，最終使流動相A為0%、流動 相B為100%，從而一邊改變柱15中試料的保持力一邊進行分析。尤其， 這樣使用多個送液泵在送液泵的下游側(cè)將多個流動相合流的梯度方式被 稱為高壓梯度方式(例如參照專利文獻l)。并且，在圖6中，縱軸的A、 B坐標分別表示A液100%、 B液100n/c)。橫軸為時間。
但是，在流動相組成梯度洗脫法中，由于檢測器感應流動相的組成變 化會引起基線的變動，所以，根據(jù)流動相的條件或檢測方法有不能適用于 分析的情況。
另外，僅使用流動相組成梯度洗脫法存在不能充分達到其目的的情況。
另一方面，由于溫度也會使物質(zhì)的分布狀態(tài)改變，作為代替流動相組 成梯度洗脫法的方法，提出了使柱周邊的溫度隨時間改變的溫度梯度洗脫 法(例如參照非專利文獻1)。在此方法中，通過從外部改變柱溫度來改 變柱內(nèi)的流動相溫度。
但是，在此方法中，由于因熱介質(zhì)的熱容量、熱介質(zhì)或柱管材質(zhì)的導 熱率及溫度差而導熱性變化，所以難以迅速且準確地使溫度改變。而且， 也有沿柱剖面方向產(chǎn)生溫度梯度而易于引起峰形劣化的問題。因此，此提 案的溫度梯度洗脫法未得到廣泛普及。
專利文獻l:特開2003-98166號公報
非專利文獻l:金澤秀子，"溫度響應性色譜法"分析，2004年6月 號，第303 308頁

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速且準確的溫度梯度洗脫法。 本發(fā)明著眼于若將不同溫度的流動相任意地進行混合則能迅速地實 現(xiàn)溫度調(diào)節(jié)，并且將流動相在2條流路中調(diào)節(jié)成相互不同的恒定溫度，以 任意的混合比將其混合后使其流入被絕熱的柱來實現(xiàn)目的。
艮口，本發(fā)明的基于液相色譜法的分析方法，將所要分析的試料與流動 相一齊導入至分離用柱，并將在該柱中分離并洗脫出的試料成分用檢測器
進行檢測，該基于液相色譜法的分析方法包括如下步驟，以進行溫度梯度 洗脫法使柱處于絕熱狀態(tài)；從2條流動相送液流路供給流動相，在混合 后導入至柱中，此時，將一條流動相送液流路的流動相溫度設定成比在柱 中想要調(diào)節(jié)的溫度范圍的上限溫度高的恒定溫度，并將另一條流動相送液 流路的流動相溫度設定成比在柱中想要調(diào)節(jié)的溫度范圍的下限溫度低的 恒定溫度；和通過調(diào)節(jié)2條流動相送液流路的流量，使流動相的混合比率 隨時間變化，從而使柱內(nèi)的流動相的溫度隨時間變化。
在流動相的混合比率的時間變化中，包括從恒定溫度向另一恒定溫 度分階段地變化的方式；和從低溫向高溫或從高溫向低溫連續(xù)變化的方 式。本發(fā)明包含這兩種方式。階段地進行變化的方式具有控制簡單的優(yōu)點。 另一方面，在隨時間連續(xù)改變混合比率時，能夠在柱內(nèi)沿流動相的移動方 向形成溫度梯度。
在本發(fā)明中，從柱流出的液體的溫度也隨時間而改變。因此，有時檢 測器會因溫度而靈敏度發(fā)生變化或基線發(fā)生變動。以避免這類問題為目 的，優(yōu)選將從柱流出的液體調(diào)節(jié)到恒定溫度，此后導入檢測器。
另外，由于若柱中所導入的流動相的流量改變則峰值的保持時間改 變，因此以進行更準確的分析為目的，優(yōu)選對2條流動相輸送流路的流量 進行調(diào)節(jié)，以使柱中所導入的流動相的流量為恒定。
在可以應用流動相組成梯度洗脫法的情況下，以提高梯度洗脫法的作 用為目的，在基于本發(fā)明的梯度洗脫法中，可以與流動相組成梯度洗脫法 并用，該流動相組成梯度洗脫法使從2條流動相送液流路供給的流動相的 組成隨時間變化。
本發(fā)明的液相色譜儀具備分離用柱；絕熱容器，其收納柱；第1 流動相送液流路，其具備送液泵、設定為比在柱中想要調(diào)節(jié)的溫度范圍的 上限溫度高的恒定溫度的恒溫器；第2流動相送液流路，其具備與送液泵 不同的送液泵、設定為比在柱中想要調(diào)節(jié)的溫度范圍的下限溫度低的恒定 溫度的恒溫器，并輸送與第1流動相送液流路中輸送的流動相相同的流動 相；混合器，其將從第l、第2流動相送液流路供給的流動相混合后向柱 送出；試料注入器，其在向柱供給流動相的流路中注入想要分析的試料； 檢測器，其配置在柱的下游，對在柱中分離并洗脫出的試料成分進行檢測；
和梯度控制器，其對第1、第2流動相送液流路的送液泵的流量進行調(diào)節(jié)，
使在混合器中的流動相的混合比率隨時間而變化；由此使柱內(nèi)的流動相的 溫度隨時間變化來進行溫度梯度洗脫法。
在梯度控制器所控制的流動相的混合比率的時間變化中，有分階段的 變化和連續(xù)的變化，但為了在柱內(nèi)形成沿著流動相的移動方向的溫度梯 度，梯度控制器連續(xù)進行所述混合比率的隨時間的變化，對第l、第2流 動相送液流路的送液泵的流量進行調(diào)節(jié)。
優(yōu)選在柱與檢測器之間還具備恒溫器，其將來自柱的流出液的溫度調(diào) 節(jié)到恒定溫度。
梯度控制器的優(yōu)選形態(tài)是對第1、第2流動相送液流路的送液泵的流 量進行調(diào)節(jié)，以使導入柱中的流動相的流量達到恒定。
作為第l、第2流動相送液流路，可以還具備流動相組成梯度結(jié)構(gòu)， 其使第1、第2流動相送液流路所輸送的流動相的組成隨時間而變化。
配置試料注入器的位置只要是能將試料注入到柱中供給有流動相的 流路中位置即可，例如是第1或第2流動相送液流路，或是混合器與柱之 間的流路。
雖然可調(diào)節(jié)的溫度范圍取決于流動相的組成，但是由于在流動相送液 流路的恒溫器中承受著由柱的流動阻抗所引起的高壓，所以能夠通過流動 相的沸點上升對相當高的高溫區(qū)域進行梯度分析。 (發(fā)明效果)
本發(fā)明的分析方法及液相色譜儀將流動相在2條流路上調(diào)節(jié)成相互 不同的恒定溫度，將其以任意的混合比混合后使其注入柱中，并且實施隔 斷來自柱的散熱的方法，所以能夠容易地使柱內(nèi)的流動相的溫度變化，并 使原來困難的快速溫度梯度洗脫法成為可能。
此外，由于與以往經(jīng)由熱介質(zhì)對柱從外側(cè)進行加溫或冷卻的方法不 同，沿柱的剖面方向不產(chǎn)生溫度梯度，所以不會招致峰形的劣化。
其結(jié)果，在本發(fā)明中，使高速且高精度的溫度梯度洗脫法成為可能。
在本發(fā)明中連續(xù)地進行混合比率的隨時間的變化時，由于沿柱中的流 動相的流動方向產(chǎn)生溫度梯度，所以利用其濃縮效果可以抑制柱內(nèi)的物質(zhì) 的擴散，并達到高效率的分離。
若將從柱中流出的液體調(diào)節(jié)到恒定溫度，然后導入檢測器，則即便是 示差折射光檢測器那樣對溫度變化敏感的檢測器也可以使用。
若使導入柱的流動相的流量恒定，則能提高峰值的保持時間的再現(xiàn) 性，并提高測定精度。
若在本發(fā)明的溫度梯度洗脫法中并用流動相組成梯度洗脫法，則可以 實現(xiàn)更有效的梯度洗脫法。


圖1A是表示一個實施例的高速液相色譜儀的流路圖。 圖1B是表示另一實施例的高速液相色譜儀的流路圖。 圖2是表示進行了一個實施例的溫度梯度洗脫時的色譜的波形圖。 圖3A是表示另一實施例的高速液相色譜儀的流路圖。 圖3B是表示本發(fā)明的另一實施例的高速液相色譜儀的流路圖。 圖4是表示具備現(xiàn)有的流動相組成梯度機構(gòu)的高速液相色譜儀的流 路圖。
圖5是表示流動相組成梯度動作中的流動相組成變化的曲線圖。
圖中1, la, lb —流動相；2a，2b —流動相送液流路；3 —脫氣裝置；
5a, 5b—送液泵；7 —試料注入器；9a, 9b, 17 —恒溫器；ll一混合器；12 一分析流程；13 —絕熱器；15—柱；19一檢測器；21—梯度控制器。
具體實施例方式
以下，利用實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
圖1A是表示一個實施例的高速液相色譜儀的流路圖。
該高速液相色譜儀具備將經(jīng)過了對流動相1所含的氣體進行脫氣的
脫氣裝置3后的流動相流路分支來送液的2條流動相送液流路2a、 2b。 一條流動相送液流路2a具備恒溫器9a，其將送液泵5a、試料注入器7以 及流動相設定為比想要在柱中調(diào)節(jié)的溫度范圍的下限溫度低的恒定溫度。 另一條流動相送液流路2b具備恒溫器9a，其將送液泵5b以及流動相設 定為比想要在柱中調(diào)節(jié)的溫度范圍的上限溫度高的恒定溫度。
兩條流動相送液流路2a、 2b連接于混合器11。從混合器11開始的流
路12中連接有用于將試料按成分進行分離的分離柱15，在柱15的下游， 隔著恒溫器17連接有對利用柱15分離洗脫后的試料成分進行檢測的檢測 器19?；跈z測器19的情況，恒溫器17可以省略。
混合器11和柱15以隔絕散熱的方式收納在絕熱容器13中。如此圖 所示，優(yōu)選從恒溫器9a、 9b的出口到柱15的出口為止收納到絕熱容器 13中。
送液泵5a、 5b連接于梯度控制器21，通過梯度控制器21對流動相 送液流路2a、 2b的送液泵5a、 5b的流量進行調(diào)節(jié)，按照在混合器U中 的流動相的混合比率隨時間改變的方式對流動相送液流路2a、 2b的送液 量進行調(diào)整。
在恒溫器9a、 9b、 17中收納有基于不銹鋼等的導熱率高的材質(zhì)的管， 并以鋁塊或空氣作為介質(zhì)進行加熱或冷卻?；旌掀?1及柱15和其配管的 材質(zhì)都采用如聚醚醚酮(PEEK)那樣的導熱率低的材質(zhì)。
關于圖1A的流路結(jié)構(gòu)，流動相1通過脫氣裝置3將氣泡脫氣后，分 配到2條流路2a和2b。在流路2a中利用送液泵5a，在流路2b中利用送 液泵5b，分別通過梯度控制器21設定成任意的流量比進行送液。在2條 流路2a和2b中，流動相在各恒溫器9a、 ％中被調(diào)節(jié)到各個不同的溫度 后，由混合器ll進行混合，并供給到柱15。通常，以混合后的流動相流 量為恒定的方式設定各個送液泵5a、 5b的流量，恒溫器9a的溫度設定得 比想要調(diào)節(jié)的溫度的下限低，恒溫器9b的溫度設定得比想要調(diào)節(jié)的溫度 的上限高。例如，當將柱15中的流動相的流量設定為1.0mL/分、并實施 從30。C到70。C的線性溫度梯度洗脫時，將恒溫器9a設定為25°C，將恒 溫器9b設定為75°C，并使送液泵5a的流量在1分鐘內(nèi)從0.9mL/分向 (UmL/分變化，同時使送液泵5b的流量在1分鐘內(nèi)從O.lmL/分向0.9mL/ 分變化。此流量變化由梯度控制器21來控制。此時，若液相色譜儀工作 在理想的狀態(tài)，則流動相的溫度將在1分鐘內(nèi)從3(TC到70'C隨時間線性 地連續(xù)變化。
由柱15分離后的試料成分經(jīng)過恒溫器17調(diào)節(jié)成恒定溫度，并在檢測 器19中進行檢測。
接著，更具體地說明此高速液相色譜儀。
在柱15中，例如采用反相色譜儀用柱Shim-PackFC-ODS(注冊商標) (內(nèi)徑3mm、長度100mm)。但是，柱15只要采用PEEK等導熱率低的 材料作為柱管，則其它就可選用任何材料。
此外，在檢測器19中可使用吸光度檢測器、熒光檢測器、示差折射 檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器等，若需要則可再連接質(zhì)量分析儀。
在流動相中，作為一個示例，采用水和乙腈(acetonitrile)的混合液。 但是，流動相是根據(jù)要分析的物質(zhì)進行選擇的，而不受其種類或溫度、pH 等任一個的制約。
圖1B是表示其它的實施例的圖。與圖1A的實施例相比，試料注入 器7的位置不同。在此實施例中試料注入器7在流路12中被配置于混合 器11與柱15之間。
試料注入器7也可配置在恒溫器9a或9b與混合器11之間。
測定條件如下 (1)分析條件
柱Shim-Pack FC—ODS (注冊商標)(內(nèi)徑3mm、長度100mm) 流動相水與乙腈(acetonitrile)的混合液(容量比1:1) 流量1.0mL/分
溫度從30。C到70°C的1分鐘的溫度梯度
(2 )檢測條件 檢測器吸光度檢測器 檢測波長260nm
在圖2中表示使用圖1A的高速液相色譜儀，在此測定條件下,對含有 對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸乙酯、對羥苯甲酸丙酯及對羥苯甲酸丁酯的 對羥苯甲酸烷基酯(alkylparabens)混合標準試料進行分析后的結(jié)果的色 譜。橫坐標是時間,縱坐標是表示檢測強度的吸光度(mAU)。溫度從30°C 向70°C相對于時間呈線性上升。
根據(jù)此結(jié)果，對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸乙酯、對羥苯甲酸丙酯及 對羥苯甲酸丁酯可在1分鐘以內(nèi)洗脫，并且很好地相互分離。由此可知， 通過本發(fā)明的溫度梯度洗脫法它們被迅速地分離。
進而，參照圖3A和圖3B，對其他實施例進行說明。
這些實施例還具備流動相組成梯度機構(gòu)，其在本發(fā)明的溫度梯度洗脫 法中隨時間改變流動相的組成。
流動相l(xiāng)a、 lb連接于具備可分別調(diào)整流量的閥4a、4b的流路6a、6b。流路6a、6b經(jīng)由脫氣裝置3a連接于被分支后的2條流動相流路2a、2b。閥4a、4b也連接于梯度控制器21，流動相l(xiāng)a、lb的組成隨時間進行調(diào)節(jié)。
流動相2a、2b以及在它們下游的結(jié)構(gòu)與圖1A、1B相同。 在圖3A、3B的流路結(jié)構(gòu)中，流動相l(xiāng)a、lb按照閥4a、4b的開口比 設定成規(guī)定流量比，將被混合后的流動相通過脫氣裝置3進行脫氣后混合，并分配到2條流動相流路2a、2b。此后，與圖1A、1B的實施例同樣執(zhí)行溫度梯度。
在圖3A、 3B所示的流路結(jié)構(gòu)的情況下，具有以下效果，例如，基于 流動相l(xiāng)a和lb的組成的分配系數(shù)極不相同，進一步當基于溫度的分配系 數(shù)也極不相同時，利用兩者性質(zhì)的相乘效果分配系數(shù)將變得更不相同。因此，可以提供梯度效果更大的色譜儀。
權利要求
1、一種基于液相色譜法的分析方法，將所要分析的試料與流動相一齊導入至分離用柱，并將在該柱中分離并洗脫出的試料成分用檢測器進行檢測，該基于液相色譜法的分析方法包括如下步驟，以進行溫度梯度洗脫法使所述柱處于絕熱狀態(tài)；從2條流動相送液流路供給流動相，在混合后導入至所述柱中，此時，將一條流動相送液流路的流動相溫度設定成比在所述柱中想要調(diào)節(jié)的溫度范圍的上限溫度高的恒定溫度，并將另一條流動相送液流路的流動相溫度設定成比在所述柱中想要調(diào)節(jié)的溫度范圍的下限溫度低的恒定溫度；和通過調(diào)節(jié)所述2條流動相送液流路的流量，使流動相的混合比率隨時間變化，從而使所述柱內(nèi)的流動相的溫度隨時間變化。
2、 如權利要求1所述的分析方法，其特征在于，通過連續(xù)進行所述混合比率的隨時間的變化，從而在所述柱內(nèi)形成沿 著流動相的移動方向的溫度梯度。
3、 如權利要求1或2所述的分析方法，其特征在于， 將從所述柱流出的液體調(diào)節(jié)到恒定溫度后導入至所述檢測器。
4、 如權利要求1 3中任一項所述的分析方法，其特征在于， 調(diào)節(jié)所述2條流動相送液流路的流量，使導入至所述柱中的流動相的流量達到恒定。
5、 如權利要求1 4中任一項所述的分析方法，其特征在于， 與流動相組成梯度洗脫法并用，該流動相組成梯度洗脫法使從所述2條流動相送液流路供給的流動相的組成隨時間變化。
6、 一種液相色譜儀，具備 分離用柱；絕熱容器，其收納所述柱；第l流動相送液流路，其具備送液泵、設定為比在所述柱中想要調(diào)節(jié) 的溫度范圍的上限溫度高的恒定溫度的恒溫器； 第2流動相送液流路，其具備與所述送液泵不同的送液泵、設定為比在所述柱中想要調(diào)節(jié)的溫度范圍的下限溫度低的恒定溫度的恒溫器，并輸送與第1流動相送液流路中輸送的流動相相同的流動相；混合器，其將從第l、第2流動相送液流路供給的流動相混合后向所 述柱送出；試料注入器，其在向所述柱供給流動相的流路中注入想要分析的試料；檢測器，其配置在所述柱的下游，對在柱中分離并洗脫出的試料成分 進行檢測；和梯度控制器，其對第l、第2流動相送液流路的送液泵的流量進行調(diào) 節(jié)，使在所述混合器中的流動相的混合比率隨時間而變化；由此使所述柱內(nèi)的流動相的溫度隨時間變化來進行溫度梯度洗脫法。
7、 如權利要求6所述的液相色譜儀，其特征在于，為了在所述柱內(nèi)形成溫度梯度，所述梯度控制器按照連續(xù)進行所述混 合比率的隨時間的變化的方式，對第l、第2流動相送液流路的送液泵的 流量進行調(diào)節(jié)。
8、 如權利要求6或7所述的液相色譜儀，其特征在于， 在所述柱與檢測器之間還具備恒溫器，其將來自柱的流出液的溫度調(diào)節(jié)到恒定溫度。
9、 如權利要求6 8中任一項所述的液相色譜儀，其特征在于， 所述梯度控制器對第1、第2流動相送液流路的送液泵的流量進行調(diào)節(jié)，以使導入所述柱中的流動相的流量達到恒定。
10、 如權利要求6 9中任一項所述的液相色譜儀，其特征在于， 還具備流動相組成梯度機構(gòu)，其使第l、第2流動相送液流路所輸送的流動相的組成隨時間而變化。
11、 如權利要求6 10中任一項所述的液相色譜儀，其特征在于， 所述試料注入器配置于第1或第2流動相送液流路。
12、 如權利要求6 10中任一項所述的液相色譜儀，其特征在于， 所述試料注入器配置于所述混合器與柱之間的流路。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于液相色譜法的分析方法，以便迅速獲得準確的溫度梯度洗脫法。在該方法中，使柱(15)處于絕熱狀態(tài)，將流動相(1)從兩條流動相送液流路(2a、2b)供給，混合后導入至柱(15)中。此時，將一條流動相送液流路(2a)的流動相溫度設定成比在柱(15)中想要調(diào)節(jié)的溫度范圍的上限溫度高的恒定溫度，并將另一條流動相送液流路(2b)的流動相溫度設定成比在柱(15)中想要調(diào)節(jié)的溫度范圍的下限溫度低的恒定溫度，通過調(diào)節(jié)兩條流動相送液流路(2a、2b)的流量，使流動相的混合比率隨時間而變化，從而使在柱(15)內(nèi)的流動相的溫度隨時間而變化。由此來實施溫度梯度洗脫法。
文檔編號G01N30/30GK101379393SQ200680052620
公開日2009年3月4日 申請日期2006年2月9日 優(yōu)先權日2006年2月9日
發(fā)明者早川禎宏, 林守正 申請人:株式會社島津制作所