專利名稱：：Cea陰性結(jié)直腸癌檢測和預(yù)后判斷的質(zhì)譜試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的結(jié)直腸癌生物樣品中蛋白質(zhì)分析方法的試劑盒。一種通過能與蛋白質(zhì)結(jié)合的基質(zhì)去捕獲生物標(biāo)志，并用有定量控制的質(zhì)譜分析來檢測CEA陰性結(jié)直腸癌生物標(biāo)志。在此提及的此項發(fā)明涉及蛋白質(zhì)檢測領(lǐng)域，為一種新的非侵入性的體外質(zhì)譜檢測方法。本發(fā)明可以應(yīng)用到已經(jīng)脫離人體的體液中的CEA陰性結(jié)直腸癌生物標(biāo)志組合的檢測方法或試劑盒。
背景技術(shù)：
：隨著人類基因組計劃的實施和完成，科學(xué)家們提出了后基因組(post-genome)計劃的概念，研究要點轉(zhuǎn)移到功能基因組學(xué)上，而生物功能主要體現(xiàn)物質(zhì)是蛋白質(zhì)。1994年，澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams首先提出蛋白質(zhì)組(proteome)的概念，指的是"一種基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)"，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。對于蛋白質(zhì)組的研究是功能基因組學(xué)研究的核心，稱為蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)。蛋白質(zhì)組學(xué)被認(rèn)為是后基因組研究中最主要的部分。與基因組相比，蛋白質(zhì)組的組成更復(fù)雜，功能更活躍，應(yīng)用前景更廣泛。蛋白質(zhì)組學(xué)從細(xì)胞整體水平進(jìn)行蛋白質(zhì)屬性的研究，如表達(dá)水平、翻譯后修飾及相互作用等，并由此獲得對于疾病過程、細(xì)胞生理生化特征和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的廣泛完整的認(rèn)識。所以，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)正在逐步成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及制藥學(xué)等的重要研究手段。不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定人體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于體外疾病樣本診斷及篩査，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的差異化分析，要求能夠達(dá)到分辨細(xì)胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)序列鑒定分析。用質(zhì)譜聯(lián)合可克服這一技術(shù)缺點。結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個多基因突變導(dǎo)致抑癌基因失活、癌基因活化的過程?；蚪M學(xué)研究由于自身的限制難以完全闡明基因與蛋白質(zhì)參與過程及其具體作用，而近年來蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為人們從整體上了解惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了較為理想的技術(shù)平臺。目前臨床上對惡性腫瘤預(yù)后評估主要依賴于臨床表現(xiàn)、病理學(xué)及傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志(tumormarker),但腫瘤早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時常常無明顯臨床表現(xiàn)，而病理學(xué)證據(jù)很難得到且重復(fù)性差。傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志癌胚抗原(CEA)在結(jié)直腸癌預(yù)后評估中有重要價值，但臨床工作中也發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)比例的結(jié)直腸癌患者中因癌胚抗原表達(dá)陰性而無法檢測，同時對于癌胚抗原陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評估則缺乏有效的早期監(jiān)測手段。但是，我們在進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析時發(fā)現(xiàn)沒有一個臨床CEA陰性結(jié)直腸癌質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立一種在CEA陰性結(jié)直腸癌生物樣品中檢測的方法。該方法為CEA陰性結(jié)直腸癌的早期檢測提供了新的途徑，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的CEA陰性結(jié)直腸癌生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明涉及一種通過生物標(biāo)志結(jié)合的基質(zhì)表面，并用定量性質(zhì)譜分析來同時檢測多種生物標(biāo)志狀態(tài)。本發(fā)明中的生物標(biāo)志是利用一臺質(zhì)譜儀來發(fā)現(xiàn)的。該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為+/_0.1%?；|(zhì)是任何能與生物標(biāo)志選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)。舉例說明，WCX陰離子，C8/C18疏水作用基質(zhì)吸附劑，分離生物化學(xué)中的這些方法和由這些方法產(chǎn)生的吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質(zhì))。底基洗去未吸附的物質(zhì)。任何適宜的洗液均可使用。生物標(biāo)志首先能夠被具有能與生物標(biāo)志物結(jié)合基質(zhì)吸附表面捕獲，非吸附物能從基質(zhì)上洗脫，吸附到底基的生物標(biāo)志物在質(zhì)譜儀中被檢測。生物標(biāo)志通過離子發(fā)生源，如激光，被離子化，產(chǎn)生的離子被一個離子感受集合器收集，然后質(zhì)量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強度的最大值。生物標(biāo)志的檢測明顯地將與信號強度的檢測有關(guān)。這樣，生物標(biāo)志的數(shù)量與質(zhì)量都可以被檢測出來。飛行質(zhì)譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個樣本產(chǎn)生的單獨的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了干擾，并增加了動態(tài)范圍。該飛行時間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉(zhuǎn)換飛行時間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。通過對生物標(biāo)志的吸附和檢測而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可利用計算機的數(shù)據(jù)分析程序進(jìn)行分析。該計算機程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測出的生物標(biāo)志的數(shù)量，并顯示信號的強度和確定被檢測的每個生物標(biāo)志的分子量。數(shù)據(jù)分析還能包括一系列的確定生物標(biāo)志的信號強度和矯正數(shù)據(jù)對預(yù)定統(tǒng)計分布狀態(tài)的偏離。例如，通過計算與某些參數(shù)相關(guān)的每個峰值的高度，可規(guī)范觀測到的峰。該參數(shù)可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學(xué)成分產(chǎn)生的不重要的干擾，這可以設(shè)置調(diào)零。計算機可以將計算結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種形式來表現(xiàn)。其標(biāo)準(zhǔn)譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質(zhì)量信息可以在譜帶中保留，產(chǎn)生一個較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標(biāo)志物更易顯現(xiàn)。在另一種形式中，兩個或更多的譜比較，便于突顯獨特的生物標(biāo)志物和那些高于或低于校準(zhǔn)樣本的生物標(biāo)志物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進(jìn)行選擇，軟件是可用的，它可自動檢測峰。一般情況下，該軟件通過鑒定信號具有信噪比高于一個選擇閾值并標(biāo)記出在峰信號的質(zhì)心處的峰的質(zhì)量這樣的方式操作。在一個有效的程序中，比較許多譜線以認(rèn)定出現(xiàn)在質(zhì)譜中某一選定范圍內(nèi)同樣的一些峰。該軟件的一個版本聚集所有出現(xiàn)在確定的質(zhì)量范圍內(nèi)的各條光譜的峰，對所有在質(zhì)量(質(zhì)荷比)中值附近的峰指定一個質(zhì)量(質(zhì)荷比)簇。發(fā)明中使用的生物標(biāo)志是基質(zhì)所捕獲。這些生物標(biāo)記是進(jìn)一步通過質(zhì)譜(massspectrometry)測定其不同分子量來知道它們特定的身份。血清質(zhì)譜多肽蛋白圖譜的重復(fù)性同一樣本同時做8點重復(fù)試驗，所有峰值的CV值均<10%，顯示了較好的重復(fù)性(圖1)。結(jié)直腸癌多肽蛋白檢測篩選用Mann-Whitney〃檢驗比較配對樣本的蛋白峰，通過分析幾百種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述蛋白指紋或質(zhì)譜多肽圖譜可以用于區(qū)分正常與結(jié)直腸癌。峰值CV〉30")i或者p〈0.05為有顯著性差異結(jié)直腸癌患者與健康人群有7種差異多肽蛋白(p〈0.05),其中3398.3Da多肽蛋白低表達(dá)，2424.4、2686.9、2821.4、2901.4、5477.1、8453.9土15Da多肽蛋白高表達(dá)(表1)。進(jìn)一步建立癌胚抗原陰性表達(dá)結(jié)直腸癌的檢驗?zāi)Ｐ停?398.3、5477.1、8453.9土15Da3個蛋白峰組成的檢驗?zāi)Ｐ蛯?0例癌胚抗原陰性表達(dá)結(jié)直腸癌患者和60例健康人群盲篩檢驗的敏感性100%，特異性83%(圖2、表2);即當(dāng)3398.3Da小于等于7.83;或當(dāng)3398.3Da大于7.83且5477.1Da大于1.54且8453.9Da大于1.18時為CEA陰性結(jié)直腸癌患者，否則為健康人群(圖3、表l)。結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)多肽蛋白篩選將結(jié)直腸癌患者按照臟器轉(zhuǎn)移情況分組，然后進(jìn)行組間比較，其中4種多肽、蛋白質(zhì)在臟器轉(zhuǎn)移組中顯著增高(表3):3622.7、4156.1、5336.2、11683.3土15Da。將結(jié)直腸癌患者按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組情況分組，發(fā)現(xiàn)2種多肽、蛋白質(zhì)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中顯著增高(表4):3622.7、32341.3土15Da。用同一例代表性患者的11683.3Da峰顯示W(wǎng)CX磁珠靈敏性比WCX芯片更高(圖4)。血清CEA測定值與結(jié)直腸癌患者多肽蛋白表達(dá)差異將結(jié)直腸癌患者按照血清CEA《5Pg/L和〉5l^g/L分成2組，進(jìn)行組間比較，兩組間有顯著性的差異蛋白質(zhì)峰，其中4種蛋白質(zhì)在CEA〉5Pg/L組中顯著增高(表5):3489.7、4533.3、9604.9、32341.3土15Da。結(jié)直腸癌患者術(shù)前術(shù)后個體化多肽蛋白表達(dá)差異對結(jié)直腸癌患者在根治性切除術(shù)后14天再次進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比(m/z)分別為3399.3、4117.3、4964.8土15Da的3種多肽蛋白在血清中的濃度顯著降低，接近于健康人群(表6)。根治性切除的患者中顯著下降(3399.3Da術(shù)前14.5、術(shù)后4.6)基本接近于健康人群(圖5);而非根治性切除的患者中其差異并不明顯(3399.3Da術(shù)前12.0、術(shù)后8.9)(圖6)。腫瘤的發(fā)生是一個多基因突變過程，單一的癌胚抗原檢查有一定的局限性。目前，大約43X的結(jié)直腸癌患者由于癌胚抗原表達(dá)陰性而不能被早期檢測。癌胚抗原(CEA〉5化/L)在結(jié)直腸癌中的陽性檢測率為57%，而由3398.3、5477.1、8453.9土15Da3個差異峰組成的檢測模型對癌胚抗原陰性表達(dá)結(jié)直腸癌的陽性檢測率為100%。這是首次發(fā)明癌胚抗原陰性表達(dá)結(jié)直腸癌的檢測方法。故用蛋白指紋圖譜技術(shù)來檢測腫瘤標(biāo)志蛋白指紋，特別是對癌胚抗原陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的早期檢測及健康體檢尤有意義。本發(fā)明篩選出了幾種能夠在癌胚抗原陰性表達(dá)及陽性表達(dá)結(jié)直腸癌患者血清中檢出的具代表性蛋白質(zhì)(2424.4、2686.9、2821.4、2901.4、3398.3、5477.1、8453.9土15Da)分子量較小。早期結(jié)直腸癌局限于結(jié)直腸粘膜組織，腫瘤表達(dá)的大分子蛋白不易滲透進(jìn)入血液，而小分子蛋白則易于進(jìn)入外周血循環(huán)，因此，小分子腫瘤標(biāo)志的篩選有利于結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)。而結(jié)直腸癌目前常規(guī)腫瘤標(biāo)志的分子量非常大，如癌胚抗原的分子量為150300kDa，這可能是常規(guī)腫瘤標(biāo)志在早期結(jié)直腸癌中敏感性低下的原因。這些在結(jié)直腸癌患者與正常人中差異十分顯著的蛋白質(zhì)可能是早期結(jié)直腸癌敏感的腫瘤標(biāo)志。結(jié)直腸癌的預(yù)后取決于是否存在轉(zhuǎn)移，尋找與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)分子，積極進(jìn)行有效的干預(yù)措施可以改變一部分結(jié)直腸癌患者的命運。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)3489.7、32341.3土15Da2個多肽蛋白與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中表達(dá)顯著上升；3622.7、4156.1、5336.2、11683.3土15Da的4個多肽蛋白與結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移相關(guān)，表達(dá)顯著上升，為臨床正確判斷疾病進(jìn)程提供幫助。用同一結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移病人的11683.3Da蛋白峰顯示W(wǎng)CX磁珠靈敏性比WCX芯片更高，證明磁珠表面的結(jié)合面積大于蛋白質(zhì)芯片，從而其靈敏性比蛋白質(zhì)芯片更高。對結(jié)直腸癌患者術(shù)前與術(shù)后的對比分析，發(fā)現(xiàn)3399.3、4117,3、4964.8t15Da3個多肽蛋白的表達(dá)存在顯著性差異。在結(jié)直腸癌獲得根治性切除術(shù)后顯著下降，基本接近于正常人；而在非根治性切除術(shù)的患者中其差異并不明顯。這一結(jié)果與胃癌術(shù)后現(xiàn)象類似，同時證實了這些多肽蛋白在結(jié)直腸癌患者中的敏感性，也為早期檢測結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了方向。常用于結(jié)直腸癌的常規(guī)腫瘤標(biāo)志如癌胚抗原CEA、糖蛋白類抗原CA19-9和CA72-4等，其敏感性只有20.9%56%，在早期結(jié)直腸癌中的敏感性則更低。尋找敏感的、早期可出現(xiàn)的、新的蛋白質(zhì)標(biāo)記物是目前的重點。本發(fā)明通過對血清CEA測定值《5化/L與〉5Pg/L的結(jié)直腸癌患者的對比分析，發(fā)現(xiàn)3489.7、4533.3、9604.9、32341.3土15Da的4個多肽、蛋白質(zhì)存在顯著性差異(P<0.05)，在CEA>5^g/L的病例中表達(dá)顯著上升；其中32341.3Da同時又與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，這可能為發(fā)明結(jié)直腸癌早期而敏感的預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志提供了一種思路。本發(fā)明利用WCX陰離子基質(zhì)及利用C8/C18疏水基質(zhì)磁珠為例對正常人與結(jié)直腸癌血清(漿)進(jìn)行蛋白質(zhì)對比分析。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強度的最大值。一種CEA陰性結(jié)直腸癌檢測和預(yù)后判斷的質(zhì)譜試劑盒和方法的具體操作歩驟以下是用本發(fā)明提供的一個操作方案及CEA陰性結(jié)直腸癌檢測試劑盒實例。1.樣品處理及標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中，視需要離心澄清樣品。質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備定義符合如下標(biāo)準(zhǔn)供血者10人，5男5女，血型為0型；年齡為18-30歲；民族漢。生化指標(biāo)正常，包括總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢查、腎功檢查；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸煙者。2.基質(zhì)與CE^陰性結(jié)直腸癌、標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備、樣品上樣抽取0型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液(a)4'C下待血液凝固后馬上離心，4'C離心5min分離血清。(b)4。C下馬上離心，4。C離心5min分離血漿。標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控或結(jié)直腸癌血清(漿)樣品分裝100pl—小管，于一8(TC儲存；或取混合血清(漿)1:2稀釋于U9緩沖液(9MUrea,2%CHAPS,50rnMTris-HCL，pH9.0)一小管，25。C儲存。即成為結(jié)直腸癌、標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)試劑盒。將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清及樣品點樣在有支持物的基質(zhì)中的一個位點上。支持物用磁性珠或芯片?；|(zhì)是用于標(biāo)記、結(jié)合血清(漿)的。標(biāo)記至液相色譜柱子上的基質(zhì)可用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)的標(biāo)準(zhǔn)方法去分析。將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控O血清(漿)用于質(zhì)譜儀試劑盒的定量方法。3.洗滌用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。以下步驟用0.05%1%三氟乙酸徹底洗滌整個磁性珠陣列點，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)。吸能分子可用Sinapinicacid或alpha—Cyano-4—hydroxycirmamicacid等。3.質(zhì)譜的定量控制及測試用激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337ran)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標(biāo)志后用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)標(biāo)準(zhǔn)方法去分析滯留于各位點的生物標(biāo)志或蛋白質(zhì)。用計算機分析數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da等強度調(diào)至50%信號強度的最大值。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強度的最大值。用2746i1Da、5909土1Da、6634土1Da標(biāo)準(zhǔn)峰為質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)定性(分子量)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明將蛋白質(zhì)分成了幾大類，即WCX陰離子、C8/C18疏水作用等蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析及定量。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠或芯片的實驗結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠或芯片的實驗結(jié)果一致。本發(fā)明可用于體外細(xì)胞和非侵入性的體外結(jié)直腸癌質(zhì)譜檢測方法的定量控制，如離體體液的結(jié)直腸癌試劑盒用于臨床質(zhì)譜的結(jié)直腸癌檢測方法?？梢詸z測多個結(jié)直腸癌蛋白質(zhì)生物標(biāo)志群及質(zhì)譜多肽圖譜。本發(fā)明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點(1)準(zhǔn)確質(zhì)譜直接分析有很強的精確性，一般誤差率只有O.lDa。因為蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均質(zhì)量是已知的，如果知道了抗原或生物標(biāo)志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。(2)方便本方法將蛋白質(zhì)分成了幾大類，即陰離子、疏水作用蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析。支持基質(zhì)的方法所用吸附劑的支持物是磁珠或芯片。用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。磁珠表面的結(jié)合面積大于芯片，從而其靈敏性比芯片更高。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析。(3)快捷用本發(fā)明提供的蛋白指紋法進(jìn)行檢測時，無需對蛋白質(zhì)進(jìn)行測序。本發(fā)明采用了計算機"條碼格式"，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示。此強度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強弱，從而有助于臨床復(fù)雜的檢測，如可用此"蛋白指紋"或條碼格式進(jìn)行醫(yī)學(xué)分析。說明書附1血清質(zhì)譜多肽蛋白圖譜的重復(fù)性圖2癌胚抗原陰性表達(dá)結(jié)直腸癌及健康人群盲篩的敏感性、特異性及ROC曲線圖3癌胚抗原陰性表達(dá)結(jié)直腸癌(Cancer)、結(jié)直腸管狀腺瘤(Control)及健康人群(Normal)的蛋白指紋圖譜圖4結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(11683.3Da)的芯片與磁珠檢測靈敏性比較圖5—例根治性切除術(shù)后患者的蛋白指紋圖譜圖6—例非根治性切除術(shù)后患者的蛋白指紋圖譜具體實施方式本發(fā)明將結(jié)合具體實施例作進(jìn)一步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例1正常與CEA陰性結(jié)直腸癌患者的區(qū)分及質(zhì)譜的試劑盒制備(1)實驗方法60例CEA陰性結(jié)直腸癌患者(CEA《5Pg/L)、68例CEA陽性結(jié)直腸癌患者(CEA〉5Pg/L)，均為腺癌，平均年齡61.5歲；進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者僅20例未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其余均伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；伴臟器轉(zhuǎn)移32例肝轉(zhuǎn)移16例，肺轉(zhuǎn)移12例，卵巢轉(zhuǎn)移4例。由結(jié)直腸鏡確診的結(jié)直腸良性管狀腺瘤患者15例。健康體檢者60例，平均年齡59.5歲，來源于肝功能、腎功能等檢查均正常的體檢人群。受檢者空腹釆集靜脈血1mL，采集后立即于4。C冰箱靜置2小時，4°C4000r/min離心10分鐘分離血清，將血清于4°C12000r/min再次離心5分鐘，去除所有殘留細(xì)胞碎片和不溶物，在冰上將血清分裝為IO(MV管，共5管，保存于-8crc冰箱。避免反復(fù)凍融。蛋白質(zhì)芯片及磁珠操作步驟血清樣品處理從-8(TC冰箱中取出血清，于4"，10OOOrpm離心5min。取IO叱血清樣品，加20叱U9處理液(9mol/L尿素，2%CHAPS,1%DTT,50畫1/LTris-CL,pH9.0),充分混勻，冰浴振蕩30min后取出，加入360^L結(jié)合緩沖液(10Ommol/LNaAc，pH4.0),立即混勻。芯片上樣及洗脫將WCX2芯片(弱陰型離子表面，羧基基團(tuán)，捕獲正電荷基團(tuán)蛋白)裝入bioprocessor中，每孔加入200A結(jié)合緩沖液，室溫振蕩洗滌2次，每次5min,甩千。每孔分別加入處理好的樣品，振蕩孵育lh,甩去樣品，用200ul芯片洗脫緩沖液(10Omraol/LNaAc,pH4.0)室溫振蕩洗滌2次，每次5min,甩干；再用HPLCH20洗滌一次，立即甩干。取出芯片，每點加2次0.5叱SPA飽和溶液，晾干后上機測量。磁珠上樣及洗脫將處理好的樣品IOO叱加至已裝好WCX磁珠(弱陰離子表面，羧酸基團(tuán)，捕獲正電荷基團(tuán)蛋白)的PCR管(北京賽爾迪公司)中，置磁性處理器上孵育30min，除去液體。加lO(mL磁珠結(jié)合緩沖液(50mmol/LNaAc,pH4.04.3)至已裝好WCX磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作2次。加10叱ElutionBuffer2min，洗脫標(biāo)本至上清液。取5A上清液移至另一個PCR管中，加入5吣SPA飽和溶液充分混勻，取l化混合溶液加樣到Au片上，晾干后上機測量。數(shù)據(jù)收集將處理好的Au片置入MALDI-TOF-MS進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。在讀取數(shù)據(jù)前，用加有all-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的芯片校正質(zhì)譜儀，使分子量誤差<0.1%。本研究中閱讀儀的主要參數(shù)設(shè)定為，最高檢測分子量為50kDa，優(yōu)化分子量范圍100015000Da，最佳聚集中心8000Da，數(shù)據(jù)釆集參數(shù)范圍2080，收集總數(shù)為130次。軟件中設(shè)定讀片程序，以讀取數(shù)據(jù)。用血清中的內(nèi)標(biāo)峰4091.1Da或6634.0Da校正原始數(shù)據(jù)中的蛋白指紋圖譜，使分子量誤差<0.01%，從而獲得的精確的蛋白指紋圖譜。統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用軟件分析處理所有峰譜，形成蛋白指紋圖譜。所有的圖譜都進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)一到它們自己全部的離子總數(shù)(峰面積的總和)。將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1或6634.,0Da強度調(diào)至4050%信號強度的最大值，并且用最顯著的峰進(jìn)行了校正，而后又進(jìn)行了"減少基線"，定義蛋白峰(s/n〉5，最小的峰強度〉1.6)。分析所有l(wèi)50kDa之間的蛋白峰，并且仔細(xì)檢査了每個相應(yīng)的峰，計算出峰的平均數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV%)。用Mann-Whitney〃檢驗比較配對樣本的蛋白峰，計算p值.結(jié)直腸癌CEA檢測取空腹靜脈血4mL，離心后提取血清，用i2000全自動免疫定量檢測系統(tǒng)(美國，雅培)微粒體發(fā)光法測定，按照檢測系統(tǒng)步驟進(jìn)行操作，正常參考值〈5Pg/L。血清質(zhì)譜多肽蛋白圖譜的重復(fù)性檢驗同一樣本同時做8點重復(fù)試驗，所有峰值的CV值均〈10%，顯示了較好的重復(fù)性(圖1)。結(jié)直腸癌檢測多肽蛋白篩選用Marm-Whitney〃檢驗比較配對樣本的蛋白峰，初步分析篩選出結(jié)直腸癌患者與健康人群有7種差異多肽蛋白，其中3398.3Da多肽蛋白低表達(dá)，2424.4、2686.9、2821.4、2901.4、5477.1、8453.9+15Da多肽蛋白高表達(dá)(表l)。表l篩選結(jié)直腸癌患者與健康人群候選多肽蛋白的結(jié)果(P〈0.05，3T土sd)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例2試劑盒的雙盲測試用從實施例1中篩選出幾個特征蛋白峰，3398.3、5477.1、8453.9土15Da3個差異峰組成的檢驗?zāi)Ｐ蛯Π┡呖乖幮员磉_(dá)結(jié)直腸癌患者和健康人群盲篩檢驗的敏感性100%，特異性83%(表2);即當(dāng)3398.3Da小于等于7.83;或當(dāng)3398.3Da大于7.83且5477.1Da大于1.54且8453.9Da大于1.18時為癌胚抗原陰性表達(dá)結(jié)直腸癌患者，否則為健康人群(圖3、表1、2)。表2試劑盒的雙盲測試雙盲測試癌胚抗原陰性表達(dá)結(jié)直腸癌(60)正常(60)癌胚抗原陰性表達(dá)結(jié)直腸癌6010正常050敏感性100%特異性83%利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠或芯片的實驗結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠或芯片的實驗結(jié)果一致。實施例3結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)多肽蛋白篩選將結(jié)直腸癌患者按照臟器轉(zhuǎn)移情況分組，然后進(jìn)行組間比較，其中4種多肽、蛋白質(zhì)在臟器轉(zhuǎn)移組中顯著增高(表3)。將結(jié)直腸癌患者按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組情況分組，發(fā)現(xiàn)2種多肽、蛋白質(zhì)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中顯著增高(表4)。用同一例代表性患者的11683.3Da峰顯示W(wǎng)CX磁珠靈敏性比WCX芯片更高(圖4)。表3結(jié)直腸癌臟器轉(zhuǎn)移組及非臟器轉(zhuǎn)移組的多肽蛋白豐度差異(P〈0.05,3f士sd)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表4結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的多肽蛋白豐度差異(P〈0.05,r士sd)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例4血清CEA測定值與結(jié)直腸癌患者多肽蛋白表達(dá)差異將結(jié)直腸癌患者按照血清CEA《5^/L和〉5^/L分成2組，進(jìn)行組間比較，兩組間有顯著性的差異蛋白質(zhì)峰，其中4種蛋白質(zhì)在CEA〉5Pg/L組中顯著增高(表5)。表5結(jié)直腸癌血清CEA《5l^g/L和〉5^g/L兩組的多肽蛋白豐度差異(P〈0.05,3T±sd)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例5結(jié)直腸癌患者術(shù)前術(shù)后個體化多肽蛋白表達(dá)差異對結(jié)直腸癌患者在根治性切除術(shù)后14天再次進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比(m/z)分別為3399.3、4117.3、4964.8Da的3種多肽蛋白在血清中的濃度顯著降低，接近于健康人群(表6)。根治性切除的患者中顯著下降(3399.3Da術(shù)前14.5、術(shù)后4.6)基本接近于健康人群(圖5);而非根治性切除的患者中其差異并不明顯(3399.3Da術(shù)前12.0、術(shù)后8.9)(圖6)。表6結(jié)直腸癌根治性切除術(shù)前、術(shù)后血清多肽蛋白豐度差異(P<0.05,3T士sd)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種用磁珠支持基質(zhì)的方法捕獲生物樣品中CEA陰性結(jié)直腸癌蛋白質(zhì)組的試劑盒和方法，其特征是采用蛋白指紋法對CEA陰性結(jié)直腸癌中蛋白質(zhì)組或質(zhì)譜多肽圖譜進(jìn)行鑒別檢測。用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)控制下的定量性質(zhì)譜分析來檢測。該方法通過以下步驟實現(xiàn)(1)樣品處理及質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備；(2)基質(zhì)與血清(漿)結(jié)合試劑盒制備、樣品上樣；(3)洗滌；(4)質(zhì)譜的定量控制及質(zhì)譜檢測；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中。用O型血，男女相等，混合制備質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)；所述步驟(2)將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)及樣品點樣在有支持物的基質(zhì)中的一個位點上。支持物用磁珠或芯片?；|(zhì)是用WCX陰離子基質(zhì)及C8/C18疏水基質(zhì)與血清(漿)選擇性結(jié)合；所述步驟(3)用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。用三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片或位點上。所述步驟(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)用質(zhì)譜儀去分析滯留與各位點的生物標(biāo)志或用電噴霧電離已洗脫的生物標(biāo)志后用質(zhì)譜儀去分析。對血液進(jìn)行蛋白質(zhì)對比分析，用計算機分析血液中質(zhì)荷比數(shù)據(jù)。本試劑盒依據(jù)幾個特征蛋白峰3398.3、5477.1、8453.9±15Da，雙盲測試CEA陰性結(jié)直腸癌的敏感性100％，特異性83％。結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白峰為3622.7、4156.1、5336.2、11683.3、3489.7、32341.3±15Da；結(jié)直腸癌個體化手術(shù)療效判斷的蛋白峰為3399.3、4117.3、4964.8±15Da。2.權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)分析方法，所用的基質(zhì)包括陰離子、疏水作用吸附劑。3.權(quán)利要求2中所用吸附劑的支持物是磁珠或芯片。4.一種權(quán)利要求l所述的檢測試劑盒，其特征在于，它包括一容器以及裝于容器中的權(quán)利要求1所述的生物樣品。將生物樣品分裝100ul—小管，于一80°C儲存或取生物樣品1:2稀釋于一小管U9緩沖液(9MUrea，2%CHAPS，50rnMTris-HCL，pH9.0)，25°C儲存。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征于，所述的生物樣品為血清或血漿c全文摘要本發(fā)明涉及一種用磁珠支持基質(zhì)的方法捕獲生物樣品中結(jié)直腸癌蛋白質(zhì)組，用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。然后用質(zhì)譜法進(jìn)行分析的蛋白指紋法。本發(fā)明的方法可用于正常人與CEA陰性結(jié)直腸癌檢測和預(yù)后判斷的蛋白指紋或質(zhì)譜多肽圖譜的試劑盒。本方法準(zhǔn)確、方便且快捷。文檔編號G01N30/02GK101241139SQ20071000340公開日2008年8月13日申請日期2007年2月5日優(yōu)先權(quán)日2007年2月5日發(fā)明者洋許申請人:洋許