熒光標記益生菌菌液及分析益生菌在腸道內吸附、定植狀況的方法

文檔序號：6124508閱讀：629來源：國知局

專利名稱：熒光標記益生菌菌液及分析益生菌在腸道內吸附、定植狀況的方法
熒光標記益生菌菌液及分析益生菌在腸道內吸附、定植狀況的方法技術領域-
本發(fā)明涉及一種操作簡單、形象生動、能準確地描述益生菌在動物腸道內吸附、定植狀況的熒光標記益生菌菌液及用熒光標記益生菌菌液分析益生菌在腸道內吸附、定植狀況的方法。
背景技術：
-
益生菌是一類來源于自然界和健康動物腸道的微生物，通過分泌、產生短鏈脂肪酸、H202和細菌素等物質，對病原微生物具有顯著的抑制和殺滅作用，
從而具有對動物腸道菌群的調節(jié)功能；同時，能分泌B簇維生素、氨基酸和多種消化酶類，可促進動物腸絨毛的發(fā)育、促進營養(yǎng)物質的消化和吸收、加快動物生長，達到了替代飼用抗生素的目的；另外，益生菌還具有剌激和激活免疫細胞活性、調節(jié)免疫功能的作用。
隨著人們對食品安全越來越重視，益生菌作為動物飼料添加劑也越來越受到人們的關注，上述益生菌對動物的作用效果與其在動物腸道內的生長、繁殖有著直接關系，即益生菌在動物腸道內吸附、定植狀況是確保益生菌發(fā)揮作用的主要因素之一。多年來，人們對益生菌的研究從未間斷，使益生菌從理論到實際應用都有了較快的發(fā)展。但迄今為止，對于益生菌在腸道中如何吸附、定植的機理研究及排泄過程的研究等一直無法客觀評價，絕大多數采用體外上皮細胞吸附試驗進行研究，亦有科研人員采用腸道超薄切片等方法觀察益生菌在腸道內的定植情況，然而，這些研究方法都不能正確描述益生菌在動物腸道內的動態(tài)過程，具有一定的局限性。

發(fā)明內容
本發(fā)明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種操作簡單、形象生動、能準確地描述益生菌在動物腸道內的吸附、定植狀況的熒光標記益生菌菌液及用熒光標記益生菌菌液分析益生菌在腸道內吸附、定植狀況的方法。
本發(fā)明的技術解決方案是一種熒光標記益生菌菌液，其特征在于由下述方法制成
a.將益生菌按0.2~20%接種量接種于初始pH5.5~8.5的液體MRS培養(yǎng)基
中，于30 45"C振蕩培養(yǎng)至對數生長期；
b. 使用高速冷凍離心機2 1(TC、 5000 15000rpm離心2 20min，去掉上清液，用pH5.5 8.5PBS洗滌3次后，重新懸浮，使?jié)舛冗_到106'9CFU / ml;
c. 將b步驟所得菌液與溶解于0.01~0.5mol/lNa2COj[] 0.05~0.25mol/lNacl 緩沖液中熒光標記物溶液混合，熒光標記物的濃度是0.5 5mg/ml溶液混合，菌液與熒光標記物溶液體積比為5 20: 1， 4'C標記0.5 3h后用pH5.5 8.5PBS洗滌3次，重新懸浮，使?jié)舛冗_到106-9CFU/ml。
應用上述的熒光標記益生菌菌液分析益生菌在腸道內吸附、定植狀況的方法，步驟如下
a. 每只雞飼喂0.2 2ml熒光標記益生菌菌液，為飼喂熒光標記益生菌組；
b. 飼喂后0.5~2h開始采集雞糞，用5mlpH5.5-8.5PBS溶解后，取少許于載玻片上，涂布均勻；倒置熒光顯微鏡配置激發(fā)光主波長為334nm的UV激發(fā)濾色鏡，使用20 80倍物鏡進行觀察；
c. 飼喂0.5 3h后，隨機抽取對照組及飼喂熒光標記益生菌菌液的肉雞各
一只，放血致死，分別取每只雞的腺胃、肌胃、十二指腸、空回腸、盲腸或大
腸，使用pH5.5 8.5 PBS沖洗，除去內容物后再放入滅菌的平皿中，然后再用
pH5.5-8.5 PBS反復洗滌3次，刮取各部位上皮細胞，懸浮于0.2~2.0ml
pH5.5-8.5PBS中，分別取少許于載玻片上，涂布均勻，于倒置熒光顯微鏡下觀察；
d. 分別取l~5ml pH5.5 8.5PBS、肉雞飲用水、肉雞專用飼料PBS溶解物于載波片上涂布均勻，于倒置熒光顯微鏡下觀察。
本發(fā)明是利用熒光標記物標記益生菌，通過跟蹤監(jiān)測熒光標記益生菌在肉雞消化道各段的情況，以準確地確定益生菌在動物消化道各段的吸附、定植狀況。操作簡單、形象生動，可用于判斷每種益生菌或其他病原菌能否在動物體內繁殖及其確定在體內的代謝周期，從而可了解益生菌或其他病原菌對動物作用的過程，便于掌握益生菌對腸道定植或機體清除病原菌的動態(tài)變化。

圖1是本發(fā)明實施例詞喂熒光標記益生菌菌液3小時的肉雞十二指腸上皮細胞照片。
圖2是本發(fā)明實施例飼喂熒光標記益生菌菌液18小時的肉雞十二指腸上皮細胞照片。圖3是本發(fā)明實施例詞喂熒光標記益生菌菌液30小時的肉雞十二指腸上皮細胞照片。
圖4是本發(fā)明實施例飼喂熒光標記益生菌菌液110小時的肉雞十二指腸上皮細胞照片。
圖5是本發(fā)明實施例飼喂熒光標記益生菌菌液134小時的肉雞十二指腸上皮細胞照片。
圖6是本發(fā)明實施例飼喂熒光標記益生菌菌液254小時的肉雞十二指腸上皮細胞照片。
圖7是本發(fā)明實施例飼喂熒光標記益生菌菌液326小時的肉雞十二指腸上皮細胞照片。
圖8是本發(fā)明實施例對照組肉雞十二指腸上皮細胞照片。圖9是本發(fā)明實施例飼喂熒光標記益生菌菌液2小時的肉雞排泄物照片。圖10是本發(fā)明實施例伺喂熒光標記益生菌菌液18小時的肉雞排泄物照片。圖11是本發(fā)明實施例飼喂熒光標記益生菌菌液74小時的肉雞排泄物照片。圖12是本發(fā)明實施例詞喂熒光標記益生菌菌液110小時的肉雞排泄物照片。
圖B是本發(fā)明實施例飼喂熒光標記益生菌菌液158小時的肉雞排泄物照片。
圖14是本發(fā)明實施例詞喂熒光標記益生菌菌液230小時的肉雞排泄物照片。
圖15是本發(fā)明實施例飼喂熒光標記益生菌菌液326小時的肉雞排泄物照片。
圖16是本發(fā)明實施例對照組肉雞排泄物照片。
圖17是pH5.5~8.5PBS照片。
圖18是本發(fā)明實施例肉雞飲用水照片。
圖19是本發(fā)明實施例肉雞專用詞料PBS溶解物照片。
具體實施方式
-
1. 進雛前準備徹底清掃雞舍，進行常規(guī)消毒，入雛前3天進行熏蒸消毒 24小時(高錳酸鉀福爾馬林=1: 2)，熏蒸時舍溫控制在15度以上。
2. 雞舍管理采用網上平養(yǎng)，統(tǒng)一飼喂肉雞專用飼料(不含任何微生態(tài)制
劑)，飼養(yǎng)期間按常規(guī)程序進行免疫、消毒。 3. 飼喂至20日齡，將肉雞隨機分為對照組和詞喂熒光標記益生菌組。
4. 將益生菌FQ15按0.2~20%接種量接種于初始pH5.5-8.5的液體MRS培養(yǎng)基中，于30 45。C振蕩培養(yǎng)至對數生長期后，在每只EP管中加入0.5~2.5ml 培養(yǎng)液，使用高速冷凍離心機2 10。C、 5000~15000rpm離心2 20min，去掉上清液，使用pH5.5 8.5PBS洗滌3次后，重新懸浮，使?jié)舛冗_到106.9CFU / ml。然后與溶解于0.01 0.5mol/LNa2CO3和0.05~0.25mol/LNacl緩沖液中的熒光標記物FITC混合，FQ15菌液與FITC溶液比為5~20: 1， 4。C標記0.5~3h后用 pH5.5-8.5PBS洗滌3次，重新懸浮，使?jié)舛冗_到IO"CFU / ml，(濃度檢測參考GB/T 4789.2-2003)。
5. 對飼喂熒光標記益生菌組的每只雞飼喂0.2-2ml熒光標記的益生菌菌液；
6. 分別采集飼喂熒光標記益生菌2小時、18小時、74小時、110小時、 158小時、230小時、326小時排泄物，用5mlpH5.5-8.5PBS溶解后，取少許于載玻片上，涂布均勻，固定。倒置熒光顯微鏡配置激發(fā)光主波長為334nm的 UV激發(fā)濾色鏡，使用20-80倍物鏡進行觀察，照片分別為圖9、 10、 11、 12、 13、 14、 15。圖16是對照組肉雞的排泄物照片。
7. 隨機抽取飼喂采集飼喂熒光標記益生菌3小時、18小時、30小時、110 小時、134小時、254小時、326小時以及對照組的肉雞，放血致死，進行雞活體解剖。使用解剖剪將腹腔剪開，分別取每只雞的十二指腸放置于滅菌的干凈平皿中。將各部位剪開(腸道各段只取中間部位一段)，使用pH5.5~8.5PBS沖洗除去內容物，再放入另一個滅菌的干凈平皿中，然后再用pH5.5~8.5PBS反復洗滌3次。用干凈的載玻片邊緣輕輕刮取各部位上皮細胞，懸浮于0.2~2.0ml pH5.5 8.5PBS中，分別取少許于載玻片上，涂布均勻，固定，于倒置熒光顯微鏡下觀察，照片分別為圖1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8。
8. 分別取l~5ml pH5.5-8.5PBS、肉雞的飲用水、肉雞專用伺料PBS溶解物(lg飼料溶解于10mlpH5.5 8.5PBS中)于載波片上涂布均勻，固定，于倒置熒光顯微鏡下觀察，照片分別為圖17、 18、 19，作為對照。
實施例中的具體數值可在所列范圍內選取，熒光標記物(FITC、 DTAF、 RBITC、 HRP、 Biotin、 Co-Au)益生菌(AS 1. 131，來源于中國微生物菌種保藏中心)，除可熒光標記益生菌AS 1. 131夕卜，還可熒光標記其他益生菌或各種病菌等。
通過觀察排泄物中吸附有熒光標記益生菌的細胞脫落情況以及與1 5mlpH5.5-8.5PBS、肉雞的飲用水、肉雞專用飼料PBS溶解物照片對比，發(fā)現益生菌在進入體內后可迅速吸附于細胞周圍，在飼喂0.5 2h后就可在雞的糞便中看到帶有熒光的細胞，而且在體內停留的周期可達到60~150小時。同時從熒光標記的益生菌與消化道各段上皮細胞的吸附情況可以得出結論，功能性益生菌能夠在肉雞體內定植并生長，定植的部位為十二指腸，體內生長周期為60 150 小時。
權利要求
1.一種熒光標記益生菌菌液，其特征在于由下述方法制成a.將益生菌按0.2～20％接種量接種于初始pH5.5～8.5的液體MRS培養(yǎng)基中，于30～45℃振蕩培養(yǎng)至對數生長期；b.使用高速冷凍離心機2～10℃、5000～15000rpm離心2～20min，去掉上清液，用pH5.5～8.5PBS洗滌3次后，重新懸浮，使?jié)舛冗_到106-9CFU/ml；c.將b步驟所得菌液與溶解于0.01～0.5mol/lNa2CO3和0.05～0.25mol/lNacl緩沖液中熒光標記物溶液混合，熒光標記物的濃度是0.5～5mg/ml，菌液與熒光標記物溶液體積比為5～20∶1，4℃標記0.5～3h后用pH5.5～8.5PBS洗滌3次，重新懸浮，使?jié)舛冗_到106-9CFU/ml。
2. 應用權利要求1所述的熒光標記益生菌菌液分析益生菌在腸道內吸附、定植狀況的方法，其特征在于步驟如下a. 每只雞飼喂0.2~21111熒光標記益生菌菌液，為飼喂熒光標記益生菌組；b. 飼喂后0.5~2h開始采集雞糞，用5mlpH5.5-8.5PBS溶解后，取少許于載玻片上，涂布均勻；倒置熒光顯微鏡配置激發(fā)光主波長為334nm的UV激發(fā)濾色鏡，使用20-80倍物鏡進行觀察；c. 飼喂0.5 3h后，隨機抽取對照組及飼喂熒光標記益生菌菌液的肉雞各一只，放血致死，分別取每只雞的腺胃、肌胃、十二指腸、空回腸、盲腸或大腸，使用pH5.5 8.5 PBS沖洗，除去內容物后再放入滅菌的平皿中，然后再用 pH5.5-8.5 PBS反復洗滌3次，刮取各部位上皮細胞，懸浮于0.2 2.0ml pH5.5-8.5PBS中，分別取少許于載玻片上，涂布均勻，于倒置熒光顯微鏡下觀察；d. 分別取l~5ml pH5.5~8.5PBS、肉雞飲用水、肉雞專用飼料PBS溶解物于載波片上涂布均勻，于倒置熒光顯微鏡下觀察。
全文摘要
本發(fā)明公開一種熒光標記益生菌菌液，是將益生菌按0.2～20％接種量接種于初始pH5.5～8.5的液體MRS培養(yǎng)基中，于30～45℃振蕩培養(yǎng)至對數生長期；使用高速冷凍離心機2～10℃、5000～15000rpm離心2～20min，去掉上清液，用pH5.5～8.5PBS洗滌3次后，重新懸浮，使?jié)舛冗_到106-9CFU/ml；將b步驟所得菌液與溶解于0.01～0.5mol/lNa2CO3和0.05～0.25mol/lNacl緩沖液中的熒光標記物溶液混合，熒光標記物的濃度是0.5～5mg/ml，菌液與熒光標記物溶液體積比為5～20∶1，4℃標記0.5～3h后用pH5.5～8.5PBS洗滌3次，重新懸浮，使?jié)舛冗_到106-9CFU/ml。利用熒光標記物標記益生菌，通過跟蹤監(jiān)測熒光標記益生菌在肉雞消化道各段的情況，以準確地確定益生菌在動物消化道各段的吸附、定植狀況。
文檔編號G01N21/64GK101178359SQ20071001294
公開日2008年5月14日申請日期2007年9月25日優(yōu)先權日2007年9月25日
發(fā)明者江國托申請人:大連三儀動物藥品有限公司

完整全部詳細技術資料下載