專(zhuān)利名稱(chēng)：：基于elisa法的免疫共沉淀試驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特指一種基于ELISA法的免疫共沉淀試驗(yàn)方法，具體地講指一種快速、高通量、定量檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用的免疫共沉淀-酶聯(lián)試驗(yàn)技術(shù)，建立板式固相免疫共沉淀-酶聯(lián)試驗(yàn)的定量檢測(cè)方法，用于快速篩查和定量檢測(cè)共沉淀蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
：目前，研究蛋白質(zhì)間的相互作用有多種方法，常用的有酵母雙雜交系統(tǒng)、免疫沉淀、Pull-down等方法。其中，免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是相對(duì)穩(wěn)定、簡(jiǎn)便的方法，也是在蛋白質(zhì)組的科學(xué)研究中的得到了廣泛應(yīng)用的一種方法，它是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)來(lái)研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，能夠確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。但這種方法還有三個(gè)明顯缺陷一是兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；二是方法本身具有冒險(xiǎn)性，必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果；三是操作過(guò)程復(fù)雜，浪費(fèi)較多的蛋白質(zhì)樣品，只能檢測(cè)到納克級(jí)(ng),所以靈敏度較低。另外，與上述其他幾種研究細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)間相互作用的方法一樣具有醫(yī)學(xué)一些不足之處，如操作程序復(fù)雜，技術(shù)操作要求高，所用耗材昂貴，費(fèi)事、費(fèi)時(shí)、重現(xiàn)性差等。這已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組研究進(jìn)程的瓶頸，茲需一種能夠快速、定量、高通量篩査蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用的檢測(cè)方法。盡管也有學(xué)者對(duì)上述一些方法作了一些改進(jìn)，或者發(fā)明了一些新的檢測(cè)方法，依然存在耗材昂貴，費(fèi)事、費(fèi)時(shí)、重現(xiàn)性差的不足之處，如意大利學(xué)者Persani等在《自然-臨床實(shí)踐內(nèi)分泌代謝雜志》上發(fā)表的題為"技術(shù)的洞察現(xiàn)代檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的方法顯示有功能的促甲狀腺素受體的聚合結(jié)構(gòu)"(PersaniL,CalebiroD,BonomiM.TechnologyInsight:modernmethodstomonitorprotein-proteininteractionsrevealfunctionalTSHreceptoroligomerization,NatClinPractEndocrinolMetab.2007，3(2):180-90.)文章中，總結(jié)了國(guó)外學(xué)者發(fā)明的一些用于在活細(xì)胞內(nèi)觀察兩種蛋白質(zhì)的相互作用情況的現(xiàn)代檢測(cè)方法，這些技術(shù)是基于福斯特共振熒光能量轉(zhuǎn)移的物理學(xué)檢測(cè)方法。這些方法的優(yōu)勢(shì)是能夠?qū)崟r(shí)觀察活細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)間的相互作用，但技術(shù)要求高，且設(shè)備昂貴。目前，最簡(jiǎn)單的研究?jī)傻鞍踪|(zhì)相互作用的是酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA),在體外驗(yàn)證兩種蛋白質(zhì)的相互作用，具有高通量、速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、定量等優(yōu)點(diǎn)。然而，該方法目前僅用于定量檢測(cè)某一種蛋白質(zhì)的含量，其優(yōu)勢(shì)未能充分發(fā)揮出來(lái)。本發(fā)明就是利用了ELISA的原理及其上述優(yōu)勢(shì)來(lái)彌補(bǔ)免疫共沉淀的不足之處，發(fā)展了一個(gè)定量、快速、高通量檢測(cè)蛋白質(zhì)間的相互作用的方法。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提出一種新的技術(shù)方案，將免疫共沉淀法和酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法結(jié)合起來(lái)，即，利用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法中的96孔塑料板來(lái)捕獲目的蛋白(蛋白質(zhì)A)—興趣蛋白(蛋白質(zhì)B)—抗興趣蛋白抗體復(fù)合物，然后用抗興趣蛋白抗體相對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，顯色，酶標(biāo)儀檢測(cè)。本發(fā)明簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，提高了檢測(cè)系統(tǒng)的敏感度,具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性的特點(diǎn)，降低了實(shí)驗(yàn)成本，提高了實(shí)驗(yàn)效率。本發(fā)明可通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的(1)細(xì)胞內(nèi)總蛋白的提取用磷酸緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，然后，在細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，將細(xì)胞離心，取上清液備用；(2)用蛋白質(zhì)A的抗體包被96孔塑料板選擇與蛋白質(zhì)A相應(yīng)的抗體，抗體從商業(yè)公司訂購(gòu)，用碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液稀釋抗體，稀釋濃度為110pg/ml，再將稀釋液加入到%孔塑料板中進(jìn)行包被，每孔加100200pl，37°C26小時(shí)或4°C過(guò)夜；(3)封閉用12wt。/。牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉余下的空白位點(diǎn)，37。C中孵育46小時(shí)；(4)加樣將步驟1中的上清液用磷酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)偟鞍诐舛葹?10yg/ml，再將稀釋液加入到步驟2中已包被的塑料板的反應(yīng)孔中，每孔加10020(Hd，在37'C中孵育12小時(shí)，同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔；(5)加入與蛋白質(zhì)B的一抗選擇與蛋白質(zhì)B相應(yīng)的抗體，抗體從商業(yè)公司訂購(gòu)，磷酸鹽緩沖液稀釋抗體，濃度為1020ug/ml，于各反應(yīng)孔中，加入稀釋的蛋白質(zhì)B的抗體100150nl，37。C孵育0.51小時(shí)，洗滌；(6)于各反應(yīng)孔中，加入與蛋白質(zhì)B的抗體相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，37t:孵育0.5l小時(shí)，洗滌；(7)加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入顯色底物溶液100150nl，37'C放置1030分鐘；(8)終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入0.1~0.2mmo1硫酸。(9)結(jié)果判定在酶標(biāo)儀檢測(cè)儀上，檢測(cè)吸光度。步驟2中包被條件優(yōu)選為每孔IO(HU，4'C過(guò)夜；抗體的稀釋濃度優(yōu)選1.25yg/ml，2.5ug/ml,g/ml，10wg/ml。步驟3中牛血清白蛋白(BSA)溶液優(yōu)選2wt%，孵育時(shí)間優(yōu)選6小時(shí)；步驟4中稀釋的上清液中總蛋白濃度優(yōu)選1^ig/ml，加入到96孔塑料板的體積優(yōu)選為每孔lO(Hil;孵育時(shí)間優(yōu)選2小時(shí)；步驟5中抗體的稀釋濃度優(yōu)選10嗎/ml，加入到96孔塑料板的體積優(yōu)選為每孔100)^1，孵育優(yōu)選l小時(shí)；步驟6中孵育優(yōu)選1小時(shí)；步驟7中底物液顯色溶液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，加入到96孔塑料板的體積為每孔100y1,反應(yīng)時(shí)間為20分鐘；步驟8中硫酸加入到96孔塑料板的量?jī)?yōu)選為每孔50y1。本發(fā)明是結(jié)合免疫共沉淀法和酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法兩種方法的原理，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程，提高檢測(cè)系統(tǒng)的敏感度，具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性的特點(diǎn)，降低了實(shí)驗(yàn)成本，提高了實(shí)驗(yàn)效率，且可以對(duì)所需進(jìn)行研究的蛋白質(zhì)進(jìn)行任意組合。提供一種快速、定量分析兩種蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用，高通量篩査一種蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)間的相互作用技術(shù)方案。具體優(yōu)勢(shì)可見(jiàn)列表。傳統(tǒng)的免疫共沉淀法基于ELISA法的免疫共沉淀<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1.1細(xì)胞培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購(gòu)自中科院上海細(xì)胞與生化所，用含10。/。小牛血清(GIBCO)的培養(yǎng)基(DMEM，GIBCO)培養(yǎng)液，37"5%0)2培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)滿后，以2Xl()5個(gè)/ml濃度接種到24孔板中，每孔0.5ml。37°C5%032培養(yǎng)48小時(shí)后，細(xì)胞換用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí),細(xì)胞換用含100ng神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)DMEM繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)。1.2用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)確定磷酸化的酪氨酸激酶A(pTi:kA)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)在細(xì)胞內(nèi)的共定位。為了證明上述兩種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)可能是相互作用的，首先用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)確定磷酸化的酪氨酸激酶A(pTrkA)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)在細(xì)胞內(nèi)的是否共定位，這是進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明的方法有效性的前提。具體操作步驟如下1.2.1細(xì)胞固定將1.1所述細(xì)胞在lh各取出一組用4%多聚甲醛固定。1.2.2免疫熒光染色上述固定后細(xì)胞，將上述細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，洗滌，固定。分別用綠色熒光(FITC)標(biāo)記的二抗(Sigma)結(jié)合兔抗人的NGF抗體(SantaCruz)，用Cy3紅色熒光標(biāo)記的二抗結(jié)合羊抗人的磷酸化的TrkA(pTrkA)抗體(SantaCruz)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察受體與他們的共定位情況。1.2.3激光共聚焦顯微鏡所用激光共聚焦顯微鏡型號(hào)為MRC-1024(BioRad，Watford,UK)。共聚焦系統(tǒng)由Bio-Rad公司提供的軟件控制。從中可以看出紅色熒光(Cy3)表示pTrkA在細(xì)胞內(nèi)的分布，綠色熒光(FITC)表示NGF在細(xì)胞內(nèi)的分布，藍(lán)色熒光(Hoechst33342)染細(xì)胞核，Merge是指激光共聚焦后的結(jié)果，圖中可見(jiàn)金黃色顆粒，表明pTrkA與NGF在細(xì)胞內(nèi)是共定位的，說(shuō)明這兩種蛋白質(zhì)可能是相互作用的。1.3.1用本發(fā)明的方法定量檢測(cè)pTrkA與NGF兩種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的相互作用情況。1.3.1細(xì)胞內(nèi)總蛋白的提取①用預(yù)冷的磷酸緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干PBS;②加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(RIPABuffer)(細(xì)胞濃度為107/ml);③用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5離心管(EP管)中，4°C，緩慢晃動(dòng)15min(EP管插冰上，置水平搖床上)。4°C，14000g離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，儲(chǔ)存于-8(TC超低溫冰箱中，待測(cè)。1.3.2基于ELISA法的免疫共沉淀試驗(yàn)①用羊抗人的磷酸化TrkA的抗體包被96孔塑料板，采用被動(dòng)吸附法，包被緩沖液為PH9.6碳酸鹽。用包被緩沖液將欲包被的磷酸化的TrkA抗體稀釋成1.25昭/ml,2.5嗎/ml，5昭/ml,10嗎/ml，包被體積為10(V/well。包被條件4°C過(guò)夜。②封閉(blocking):封閉是指用高濃度的蛋白溶液封閉余下的空白位點(diǎn)。其目的是降低本底，封閉緩沖液為2wt。/。BSA，37。C中孵育4小時(shí)。③加樣用PBS將1.3.1中所述的上清液稀釋到l嗎/ml，以降低裂解液中去垢劑的濃度，加一定稀釋的待檢樣品l(XHil于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37'C孵育1小時(shí)，然后洗滌，同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔。④加兔抗人的NGF—抗于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的NGF的抗體10(Hd，濃度為10嗎/ml。37"C孵育1小時(shí)，洗滌。加與NGF的抗體相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，37'C孵育1小時(shí)，洗滌。⑥加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液0.1ml，37"C反應(yīng)20分鐘。⑦終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。⑧結(jié)果判定在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，從中可以看出隨著pTrkA抗體包被濃度的增加,NGF的抗體的濃度也增加，說(shuō)明pTrkA和NGF在細(xì)胞內(nèi)是以符合物的形式存在的。1.4用免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果①準(zhǔn)備瓊脂糖珠(ProteinAagarose)，用PBS洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50M濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠;②每lml總蛋白中加入ProteinA瓊脂糖珠(50%)，4。C搖晃10min(EP管插冰上，置水平搖床上)，以去除非特異性雜蛋白，降低背景；③4°C，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除ProteinA珠子④用PBS將總蛋白稀釋到1嗎/pl,以降低裂解液中去垢劑的濃度；加入一定體積的羊抗人磷酸化TrkA的抗體到500^1總蛋白中，4。C緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h;加入100^1ProteinA瓊脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復(fù)合物，4'C緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫lh;⑦14000rpm瞬時(shí)離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPAbuffer洗3遍，800^1/遍,用6(^12x上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定(60pl足夠上三道)；⑧將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳;⑨蛋白電泳及免疫印跡按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法配制12%聚丙烯酰胺凝膠，根據(jù)上述樣品的蛋白濃度，按各泳道蛋白總量相等的原則計(jì)算樣品體積后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，1:200兔抗人NGF多克隆抗體(SantaCmz)及l(fā):5000山羊抗兔IgG-HRP(華美生物工程公司)孵育，ECLPhis(AmershamBiosciences)作為發(fā)光底物，用膠片記錄結(jié)果，其中Lane1是用NGF的抗體沉淀NGF后，免疫印跡檢測(cè)pTrkA的結(jié)果，Lane2用pTrkA的抗體沉淀pTrkA，免疫印跡檢測(cè)NGF，從中可以看出pTrkA和NGF在細(xì)胞內(nèi)是以復(fù)合物的形式存在的。但是，免疫共沉淀試驗(yàn)檢測(cè)方法所用的耗材多且昂貴，花費(fèi)的時(shí)間較多，而本發(fā)明，僅需要價(jià)廉的酶標(biāo)板，步驟少，且能用酶標(biāo)儀定量檢測(cè)。權(quán)利要求1、基于ELISA法的免疫共沉淀試驗(yàn)方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行(1)細(xì)胞內(nèi)總蛋白的提取用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，然后，在細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，將細(xì)胞離心，取上清液備用；(2)用蛋白質(zhì)A的抗體包被96孔塑料板選擇與蛋白質(zhì)A相應(yīng)的抗體，抗體從商業(yè)公司訂購(gòu)，用碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液稀釋抗體，稀釋濃度為1～10μg/ml，再將稀釋液加入到96孔塑料板中進(jìn)行包被，每孔加100～200μl，37℃2～6小時(shí)或4℃過(guò)夜；(3)封閉用1～2wt％牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉余下的空白位點(diǎn)，37℃中孵育4～6小時(shí)；(4)加樣將步驟1中的上清液稀釋?zhuān)偟鞍诐舛葹?～10μg/ml，再將稀釋液加入到步驟2中已包被的塑料板的反應(yīng)孔中，每孔加100～200μl，在37℃中孵育1～2小時(shí)，同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔；(5)加入與蛋白質(zhì)B的一抗選擇與蛋白質(zhì)B相應(yīng)的抗體，抗體從商業(yè)公司訂購(gòu)，磷酸鹽緩沖液稀釋抗體，濃度為10～20μg/ml，于各反應(yīng)孔中，加入稀釋的蛋白質(zhì)B的抗體100～150μl，37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌；(6)于各反應(yīng)孔中，加入與蛋白質(zhì)B的抗體相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌；(7)加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入顯色底物溶液100～150μl，37℃放置10～30分鐘；(8)終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入0.1-0.2mmol硫酸；(9)結(jié)果判定在酶標(biāo)儀檢測(cè)儀上，檢測(cè)吸光度。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗(yàn)方法，其特征在于步驟2中包被條件為每孔lOOpl，4"過(guò)夜;抗體的稀釋濃度為1.25yg/ml，2.5ug/ml，5ug/ml，10tig/ml。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗(yàn)方法，其特征在于步驟3中牛血清白蛋白(BSA)溶液為2wt%，孵育時(shí)間為6小時(shí)。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗(yàn)方法，其特征在于:步驟4中稀釋的上清液中總蛋白濃度為l^ig/ml，加入到96孔塑料板的體積為每孔lOOpl;孵育時(shí)間為2小時(shí)。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗(yàn)方法，其特征在于步驟5中抗體的稀釋濃度為10嗎/ml，加入到96孔塑料板的體積為每孔100^1，孵育1小時(shí)。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗(yàn)方法，其特征在于步驟6中孵育時(shí)間為1小時(shí)。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗(yàn)方法，其特征在于步驟7中底物液顯色溶液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，加入到96孔塑料板的體積為每孔100lU，反應(yīng)時(shí)間為20分鐘。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗(yàn)方法，其特征在于步驟8中2M硫酸加入到96孔塑料板的體積為每孔50u1100p1。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗(yàn)方法，其特征在于步驟8中硫酸加入到96孔塑料板的量為每孔50w1。全文摘要基于ELISA法的免疫共沉淀試驗(yàn)方法，涉及生物技術(shù)，將免疫共沉淀法和酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法結(jié)合起來(lái)，即，利用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法中的96孔塑料板來(lái)捕獲目的蛋白(蛋白質(zhì)A)—興趣蛋白(蛋白質(zhì)B)—抗興趣蛋白抗體復(fù)合物，然后用抗興趣蛋白抗體相對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，顯色，酶標(biāo)儀檢測(cè)。本發(fā)明簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，提高了檢測(cè)系統(tǒng)的敏感度，具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性的特點(diǎn)，降低了實(shí)驗(yàn)成本，提高了實(shí)驗(yàn)效率。文檔編號(hào)G01N33/68GK101187666SQ20071002068公開(kāi)日2008年5月28日申請(qǐng)日期2007年3月22日優(yōu)先權(quán)日2007年3月22日發(fā)明者孫湘蘭,張志堅(jiān),勇楊,步雪峰,王穆兵,肖德生,谷曉楚,龔愛(ài)華申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)