專利名稱：：一種鼠免疫狀態(tài)監(jiān)測試劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)用配置品，具體涉及來源于動物材料的醫(yī)用配置品。技術(shù)背景移植排斥反應(yīng)(transplantationrejection)是由移植抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答所導(dǎo)致的移植物功能喪失或受者機體損害，是臨床移植失敗的主要原因和移植免疫學(xué)所致力克服的關(guān)鍵難題。在同種移植中，即使外科手術(shù)十分成功，移植物也會因排斥反應(yīng)而不能長期存活。因此，移植排斥一直是醫(yī)學(xué)界研究的重點，在移植排斥的研究過程中，受體免疫狀態(tài)檢測是必不可少的環(huán)節(jié)。但是目前仍然沒有一種可靠的試劑/方法可以檢測受體免疫狀態(tài)，現(xiàn)有的受體免疫狀態(tài)檢測的主要是通過檢測一些免疫學(xué)指標間接反映免疫狀態(tài)，均存在不同缺陷。常用檢測指標有以下幾種1、外周血T細胞計數(shù)。研究表明，CD4/CD8比值同移植排斥反應(yīng)有關(guān)。排斥反應(yīng)往往發(fā)生于CD4/CD8比值低下的患者中，用單克隆抗體免疫熒光法或流式細胞儀測定T細胞及其亞群，在急性排斥的臨床癥狀出現(xiàn)前，T細胞總數(shù)和CD4/CD8比值升高，而巨細胞病毒感染時比值降低；各家報道的比值不同，一般認為當比值大于1.2時，預(yù)示急性排斥即將發(fā)生；比值小于1.08則感染的可能性很大。如果能進行動態(tài)監(jiān)測，對急性排斥和感染的鑒別診斷會有重要價值。然而，也有一些學(xué)者認為，CD4/CD8比值與排斥反應(yīng)沒有直接關(guān)系，不同的研究結(jié)果爭執(zhí)不下源于CD4和CD8亞群的種型多樣性(heterogeneity)。例如CD8可分為抑制型和細胞毒型，還有部分NK細胞亦表達CD8抗原。同樣，CD4也可根據(jù)CD29和CD45的表達分為成熟型和初始型，既使是區(qū)分了各種亞型，CD4、CD8同移植排斥反應(yīng)的關(guān)系仍不明顯，還有待于進一步研究。2、殺傷細胞CTL和NK細胞活性測定。移植后因免疫抑制劑的應(yīng)用，殺傷細胞的活性受抑制，但在急性排斥前會明顯增高。目前常用的方法為體外試驗，取供者淋巴細胞滅活后作為刺激細胞，分離受者淋巴細胞作反應(yīng)細胞，將兩種細胞混合直接做單向混合淋巴細胞試驗，測得的結(jié)果是Tc細胞和NK細胞共同作用的結(jié)果。3、MHC分子檢測。器官移植排斥反應(yīng)所識別的靶抗原主要是表達于移植物細胞表面的MHC分子。MHC分子可通過直接途徑和間接途徑被受者T細胞識別，它在器官移植排斥反應(yīng)中有重要的作用。MHC分子在體內(nèi)廣泛分布，人體中MHC有2種形式一是以膜抗原形式存在于幾乎所有組織細胞表面，二是以可溶形式存在于血清、尿液、精液、乳汁、唾液等多種體液與分泌液中。血清可溶性MHC分子檢測比較方便，用ELISA檢測血清可溶性HLA—抗原水平，可提示排斥反應(yīng)。目前血清可溶性MHC分子檢測在國內(nèi)應(yīng)用較多。相對于血清可溶性MHC分子，外周血單個核細胞表面MHC分子受到外界影響較小。外周血單個核細胞在移植術(shù)后發(fā)生排斥時，表面表達MHC分子水平增高，目前研究的主要是MHC—II分子。細胞表面MHC分子的檢測還不成熟，流式細胞術(shù)是應(yīng)用較早的方法，分子生物學(xué)方法特別是熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的應(yīng)用使細胞表面MHC分子的檢測應(yīng)用日漸廣泛。在人類HLA—DR作為T淋巴細胞的活性化標志，排斥反應(yīng)發(fā)生時HLA—DR陽性化T淋巴細胞增加，而近期也有文獻指出HLA—叫陽性化單核細胞增加可以作為移植急性排斥反應(yīng)早期診斷的有效性指標。但人類末梢血中的單核細胞幾乎都是HLA—DR、HLA—叫，作為抗原提呈細胞在機能成熟的過程中CD80、CD86、CD40等為先導(dǎo)，HLA—DR表現(xiàn)在細胞表面，所以一部分學(xué)者認為以此作為免疫應(yīng)答初期階段的指標是比較合理的。4、細胞因子測定。血清IL-2R測定，T細胞激活后可釋出IL-2R，在急性排斥和病毒感染時IL-2R的血清含量升高，以巨細胞病毒感染時增高最明顯。且個體間血清IL-2R的含量差別顯著，無公認的診斷標準，限制了它的臨床的應(yīng)用，動態(tài)測定可克服這一缺點。細胞免疫在排異反應(yīng)中發(fā)揮著主要作用，目前研究表明Thl/Th2淋巴細胞的平衡在移植免疫反應(yīng)中相當重要。移植腎發(fā)生急性排斥反應(yīng)時，抗原遞呈細胞識別外來抗原，經(jīng)信號傳遞及Th細胞活化。Thl淋巴細胞可通過分泌IFN—y、IL一2、工L一12等細胞因子促使TDTH細胞和Tc細胞的增殖、分化、成熟。從而促發(fā)細胞免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致急性移植物排斥。Th2淋巴細胞可通過釋放TL一4，TL一10等細胞因子刺激B細胞增殖并產(chǎn)生特異性抗體，從而在慢性移植物排斥反應(yīng)中發(fā)揮一定的作用。近年來部分動物移植耐受研究提示，增強Th2淋巴細胞功能的同時?？梢种芓hl細胞的表達，從而有利于外周耐受的建立。通過對Thl/Th2淋巴細胞相關(guān)細胞因子的測定，可以反應(yīng)免疫狀態(tài)。目前也是免疫狀態(tài)監(jiān)測研究熱點之一。5、Perforin、顆粒酶B、CD40L和FasL的測定。細胞毒效應(yīng)分子的表達正在成為診斷急性排斥反應(yīng)的敏感而特異的指標。急性排斥反應(yīng)時在外周血淋巴細胞中或移植物局部組織中的Perforin、顆粒酶B和CD40L基因、表達均明顯升高。6、在免疫耐受誘導(dǎo)中嵌合體狀態(tài)或基因治療將來有可能成為免疫檢測的指標。嵌合現(xiàn)象是指受者體內(nèi)存在具有移植物抗原活性的細胞，即嵌合體(microchimerism)。Starzl等認為嵌合體可能是維持免疫耐受的原因之一。有資料顯示，臨床上嵌合體的消失與慢性排斥的發(fā)生有關(guān)。通過大量的研究，人們發(fā)現(xiàn)嵌合在移植后不同的時期及不同的移植器官中均可出現(xiàn)，在急、慢性排斥中也可出現(xiàn)。7、循環(huán)抗體檢測。群體反應(yīng)性抗體(PRA)是指器官移植受者體內(nèi)的抗HLA抗體，由于人類白細胞抗原的多樣性，相應(yīng)的抗體種類也是多種多樣的。移植術(shù)后2周,受者血清即可出現(xiàn)抗HLA抗體。術(shù)前術(shù)后的PRA高低同術(shù)后急性排斥反應(yīng)明顯相關(guān)，因此動態(tài)測定PRA水平尤為重要，也是目前廣泛被承認和應(yīng)用的一項監(jiān)測指標。PRA的應(yīng)用已有多年，但近來采用酶聯(lián)免疫吸附法測定抗體的特異性多達40余種。為診斷分析帶來困難。其他方法如血清補體測定等也有報道，但其意義不確切。目前常用的檢測方法1、51Cr釋放試驗。檢測特異性T淋巴細胞毒性試驗?zāi)壳白畛Ｓ脴藴试囼灧椒ㄈ允?1Cr釋放試驗，本法結(jié)果準確、重復(fù)性好；但也存在以下不足①使用放射性的51Cr有r射線放射性危險，不利于安全操作及廢物處置，且需特殊測定儀器；②51Cr自發(fā)釋放率高，有些細胞標記問題及敏感性低等，常因不同靶細胞標記效率變化差別大而影響結(jié)果判定；③51Cr半衰期(27.8天)，無法用于需多次測定的動物試驗；細胞共育時間短而試驗操作步驟多，不能在單個細胞水平進行測定。因此多年來人們一直試圖尋找可以替代51Cr釋放法的CTL活性測定方法，如采用熒光標記、流式細胞分析和報告基因等技術(shù)的靈敏可靠、簡單易行的非同位素測定法。且51Cr釋放試驗為體外試驗，試驗本身只是測定CTL及NK細胞的活性，只在一定程度上反應(yīng)細胞免疫狀況，不能全面反應(yīng)體內(nèi)復(fù)雜的免疫環(huán)境。2、采用ELISA法將受體血清中的細胞因子濃度作為監(jiān)測指標，以及用RT—PCR法檢測移植物活檢標本中細胞因子mRNA的方法的有效性得到了一些學(xué)者的認可，但是細胞因子是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，單一細胞因子不能全面反映免疫狀態(tài)。3、固相酶聯(lián)免疫斑點試驗(Enzyme-linkedImmunospotAssayELISP0T):ELISP0T通過檢測抗原誘導(dǎo)的細胞因子(如IFN-y)的分泌，可在體外定量測定病人PBMC中抗原特異性T細胞反應(yīng)(T細胞受抗原剌激產(chǎn)生并釋放IFN-y)。本法在肽特異性分泌IFN-y的T細胞數(shù)量與細胞毒活性之間，與標準的51Cr釋放法相關(guān)良好，是一種在臨床試驗中監(jiān)測病人對腫瘤抗原或移植抗原的CTL或Th-細胞反應(yīng)的靈敏、準確、價廉、的方法。但是僅能通過細胞因子間接反應(yīng)免疫狀態(tài)。4、Luminex:是一個多功能的液相芯片分析平臺，通常用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、受體和配體識別分析等研究。液相芯片技術(shù)，可以同時檢測多個細胞因子。5、分子生物學(xué)技術(shù)近年來，伴隨著細胞分子生物學(xué)技術(shù)的進步，移植物內(nèi)mRNA的檢測成為可能，免疫應(yīng)答過程的研究提高到了分子水平，免疫指標在診斷中的價值受到關(guān)注。6、流式細胞儀技術(shù)隨著流式細胞儀技術(shù)的進步，細胞抗原的研究得到進一步發(fā)展。利用CD3、CD4、CD8和細胞內(nèi)Thl及Th2多重染色的方法發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用流式細胞儀技術(shù)在急性排斥反應(yīng)的病例中可監(jiān)測到活性化初期T淋巴細胞(CD69)、IL一2陽性T淋巴細胞(T)增加，細胞內(nèi)IL一4/IL一10陽性T淋巴細胞(Th2)減少，排斥反應(yīng)時Thl/Th2失衡。由于免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，雖然各種檢測技術(shù)有了長足的進步，上述免疫學(xué)檢測方法雖然檢測精確程度不斷提高，但是均有其局限性，依靠單一指標不足以判斷機體復(fù)雜的免疫狀態(tài)，建立一種在多指標基礎(chǔ)上的聯(lián)合評估模式(pattern/profile)來監(jiān)測移植后受體免役狀態(tài)是免疫學(xué)家及移植工作者需要解決的難題。目前臨床上衡量器官移植后排斥反應(yīng)及免疫抑制治療的效能主要通過排斥反應(yīng)的發(fā)生情況(病理活檢)和移植物功能情況來進行評估。但是移植物活組織病理檢査也有其局限性其一.活檢組織檢測是一種損傷性檢查方法，對移植物的正常存活有一定的影響，不能反復(fù)采取樣本，另外，采取樣本過少又會影響病理切片讀片的正確性。其二.活檢組織病理學(xué)檢查是非定量性指標，影響其臨床診斷的準確性，病理學(xué)檢查容易受讀片者的主觀因素及技術(shù)水平的影響，產(chǎn)生偏倚，缺乏客觀性。其三.病理切片檢查無法對浸潤性淋巴細胞做功能性評判，不利于排斥反應(yīng)的早期診斷.在排斥反應(yīng)發(fā)生的早期或移植物失功能的受者，甚至臨床上表現(xiàn)為穩(wěn)定型的受者，病理活檢切片都可看到大量T淋巴細胞浸潤，或僅表現(xiàn)為斑點性T細胞浸潤。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種鼠免疫狀態(tài)監(jiān)測試劑，可以快速、直觀、準確的監(jiān)測移植手術(shù)后鼠的免疫狀態(tài)。本發(fā)明實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案是一種鼠免疫狀態(tài)監(jiān)測試劑，該試劑是經(jīng)二乙酰羧基熒光素-琥珀酰亞胺酯(carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester，CFSE)染色的兩種近交系的鼠脾細胞的PBS懸液，其中兩種鼠脾細胞的總濃度為0.5lxl()S個/ml，二者的比例為1:1，熒光染色濃度差為1:20。本發(fā)明所述的免疫狀態(tài)監(jiān)測的懸液的制備方法，該方法由以下步驟組成1)分別取兩種近交系的鼠脾細胞，用PBS懸浮并調(diào)整細胞濃度，得到兩種濃度均為107+/niL的細胞懸液；2)將濃度為10mM的CFSE的二甲亞砜溶液以50倍的PBS稀釋后得200nMCFSE工作液；3)往步驟1所得的一種細胞懸液中加入步驟2所得的CFSE工作液，使CFSE的終濃度為0.3nM，往步驟1所得的另一種細胞懸液中加入步驟2所得的CFSE工作液，使CFSE終濃度為6pM，然后在溫度為37t:下孵育染色1520分鐘；4)分別收集步驟3所得的細胞懸液中的染色細胞，用0.01M的4"CPBS洗滌23次后重懸于PBS;5)按細胞數(shù)1:1的比例混合步驟4所的兩種染色細胞懸液，并用PBS調(diào)整細胞總濃度為0.51X108個/fflL，即可。在實際生產(chǎn)過程中，需要對本發(fā)明所述的免疫狀態(tài)監(jiān)測的懸液抽樣檢測與監(jiān)控。具體檢測方法如下-取本發(fā)明試劑混勻后取0.5ml加入試管，再加入O.5ml0.4°/。臺盼蘭染液，混勻，靜置1-2分鐘。同時，準備好血細胞計數(shù)板及蓋玻片。將本發(fā)明試劑吸出少許，適量滴加在蓋片邊緣，使本發(fā)明試劑充滿蓋片和計數(shù)板之間。靜置0.5分鐘后，用倒置光學(xué)顯微鏡鏡下觀察計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的；然后按下式計算細胞數(shù)/ml二4大格細胞總數(shù)/4X10000，分別統(tǒng)計細胞總濃度，以及死細胞(深藍色)濃度，用細胞總濃度減去死細胞濃度即為本發(fā)明所述懸液的濃度。用流式細胞術(shù)檢測本發(fā)明試劑的染色率，PBS處理的細胞為陰性參照，將本發(fā)明試劑樣本上流式細胞儀，設(shè)定488run激發(fā)/525nm濾過，測定染色陽性細胞比例需大于95%。本發(fā)明所述的兩種近交系的鼠脾細胞，其中一種為測試細胞，來自于和移植供體同一近交系的鼠個體，該細胞與移植物同基因，抗原性與移植物完全相同，能被因移植產(chǎn)生的免疫反應(yīng)特異性殺傷，準確地反映移植物所受的免疫攻擊；另一種為內(nèi)參照細胞，來自于和移植受體同一近交系的鼠個體，與受體同基因，作為免疫狀態(tài)監(jiān)測的內(nèi)參，用于消除由于細胞破碎、死亡、歸巢等一系列細胞在體外染色處理及體內(nèi)自然死亡等非特異性損失帶來的誤差。在本發(fā)明中，并沒有特別規(guī)定哪一種細胞是測試細胞，哪一種細胞是內(nèi)參照細胞，這是由移植手術(shù)的受體和供體的選擇所決定的與受體同一近交系的鼠細胞為內(nèi)參照細胞，與供體同一近交系的鼠細胞為供體細胞。當將本發(fā)明試劑通過靜脈注射到移植模型鼠后，可通過抽血檢測不同時間段本發(fā)明試劑中兩種細胞的比例變化來判斷移植模型鼠的免疫狀態(tài)。一般情況下，若注射后24小時兩種細胞的比例即表現(xiàn)出明顯差異(測試細胞急劇下降，內(nèi)參照細胞則變化微小)，說明受體鼠機體免疫系統(tǒng)對移植物處于高排斥狀態(tài)。由于本發(fā)明試劑中的兩種細胞均經(jīng)過同種熒光染料不同濃度的染色，可通過流式細胞儀方便直觀地檢測出受體內(nèi)兩種熒光細胞的比例變化。本發(fā)明所述的鼠免疫狀態(tài)檢測試劑，能直觀地，準確的，全面的監(jiān)測移植后免疫狀態(tài)(1)通過與內(nèi)參照受體細胞的直接對比，比較測試細胞與內(nèi)參照細胞的流式細胞儀檢測峰的峰下面積的大小能快速直觀的知道檢測結(jié)果，不需要再做復(fù)雜的計算即能了解受體對移植物的免疫情況；(2)流式細胞測試可準確到單個細胞水平，結(jié)果可靠；(3)測試細胞的抗原性與移植物完全相同，結(jié)果能準確的反映移植物所受的免疫攻擊；內(nèi)參照的設(shè)立消除了細胞由于破碎、死亡、歸巢等一系列細胞在體外染色處理及體內(nèi)自然死亡等非特異性損失帶來的誤差；(4)通過測試細胞的特異性損失來反映免疫狀態(tài)，而不是片面的依靠某一個細胞因子的升高或降低，或者某一群細胞的多少，活性高低來判斷，其結(jié)果更全面、準確。下面將通過動物實驗證明本發(fā)明所述的免疫狀態(tài)監(jiān)測試劑能有效地檢測移植后受體的免疫反應(yīng)狀態(tài)。一實驗材料(一)實驗動物健康、清潔級、近交系C57BL/6j(C57;H-2b)雌性小鼠，68周齡，體重1622g(實驗動物質(zhì)量合格證號:SCXK2006-0015，2006B008,2005A044),作為供體。BALB/c(BALB;H-2d)雌性小鼠68周齡，體重16~22g(實驗動物質(zhì)量合格證號SCXK2006-0015，2006B008,2005A046),作為受體。購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。SPF級飼養(yǎng)。實驗前觀察1周，標準飼料喂養(yǎng)，飲水隨意。(二)主要試劑1、CFDA-SECellTracerKit:Molecularprobes公司(美國)2、二甲亞砜(DMSO):Sigma3、多聚甲醛廣州化學(xué)試劑廠4、0.5%臺盼藍溶液廣州化學(xué)試劑廠5、雙蒸水本院制劑中心6、氯化銨廣州化學(xué)試劑廠7、紅細胞裂解液精密稱取NH4C10.83g、KHC030.lg和EDTA2Na0.004g溶于1000ml三蒸水。8、PBS緩沖液(O.1M):精密稱取NaCl8.00g,KC10.20g，Na2HP042.08g，KH2P040.20g溶于1000ml三蒸水。(三)主要實驗儀器1、電子分析天平ER120A美國2、臺式高速離心機TDL-50B上海3、超凈工作臺ThermoForma美國4、CCM哮箱SL-JC-2323美國5、OLYMPUS相差顯微鏡CK-2日本6、OLYMPUS照相系統(tǒng)PM-CBAD日本7、低溫離心機Eppendorf德國8、微量加樣器Eppendorf德國9、恒溫水浴箱Grant美國10、流氏細胞儀EPICSEUTEBeckman-Coulter公司11、熒光倒置顯微鏡LEICA德國12、pH酸度計pHS-25型上海二、實驗方法1、試驗分組建立C57—BALB/c小鼠皮膚移植排斥模型后，尾靜脈注射本發(fā)明試劑(制備方法見實施例l)，按輸注后不同時間點分為7組，分別為lh、2h、4h、10h、ld、2d、6d組，每組5只模型鼠，另設(shè)同系移植BALB/c—BALB/c對照組。2、皮膚移植模型的建立按近交系小鼠皮膚移植國家標準，并根據(jù)試驗觀察需要進行了適當改良，步驟如下1)將試驗材料置于高壓鍋內(nèi)121'C、40min高壓滅菌。2)隨機取近交系C57小鼠10只，BALB/c小鼠35只。3)每只動物分別編號并稱取體重，詳細記錄品系名稱、性別、出生年月日、譜系及其他特征。4)用無菌生理鹽水配制0.7%戊巴比妥鈉溶液。5)采用腹腔注射麻醉動物。小鼠每10g體重注射0.1mL。6)首先麻醉C57供皮鼠，待動物麻醉失去知覺后，將其背部朝上放在固定板上，固定動物，備皮后并用3%碘酒棉球和75%酒精棉球消毒。7)在背部剪下直徑5mm10mm的皮膚左右各一塊。8)將剪好的皮片翻轉(zhuǎn)過來放入帶少量生理鹽水的培養(yǎng)皿中，用眼科剪刀，輕輕地切去皮下組織至真皮，然后用無菌生理鹽水沖洗后備用。9)麻醉受體BALB/c鼠。10)于背部逆毛方向移植C57皮片，并用5—0無創(chuàng)傷縫合線固定皮緣。11)覆蓋涂過凡士林和青霉素G鈉的紗布塊，34層，用lcm寬橡皮膏固定，松緊適度。12)手術(shù)結(jié)束待動物蘇醒后，把動物放入鼠盒內(nèi)，并掛上標記卡片。13)同法進行對照組皮膚移植，供者皮膚為同一近交系BALB/c鼠。3、本發(fā)明試劑輸注1)將小鼠固定鼠籠置中，僅鼠尾顯露；2)溫水浸泡鼠尾使尾靜脈擴張；3)75%酒精消毒后，用4號頭皮針穿刺成功后注射本發(fā)明試劑總量約0.5mL/只，每只小鼠注射細胞總數(shù)約為510乂107個。注射數(shù)量可以適當減少到1乂107個。4、流式細胞術(shù)分析小鼠外周血淋巴細胞中陽性細胞比例1)標本采集用消菌毛細管穿剌小鼠內(nèi)眥取血，每次約200uL。2)流式細胞樣品制備全血紅細胞溶解法操作步驟如下a.取全血100ul，放入5ml試管。b.用2ml氯化銨液在室溫下溶解紅血球，約5min。若紅細胞完全被溶解，溶液由混濁變到透明。注意溶解程度的掌握十分重要若溶解過分，則導(dǎo)致白細胞上抗原被破壞，或者某些敏感的細胞死亡而導(dǎo)致比例的改變。若溶解不徹底，大量紅細胞會影響對淋巴細胞的分析。這是因為淋巴細胞在分析圖像上與紅細胞群接近，在框出淋巴細胞群時，會把部分紅細胞框定于淋巴細胞內(nèi)。而紅細胞溶解不足或過度在很大程度上影響著分析結(jié)果。，c.紅細胞被徹底溶解，加入lmlPBS稀釋的0.5%甲醛，立即離心，用34ml冷BPS清洗。離心250Xg(約每分鐘1500轉(zhuǎn))，5min;洗3次。注意每次用吸管將上清吸出，不能傾倒去液。d.將處理完成的細胞懸浮于0.5lml的0.1%甲醛溶液內(nèi)。置4。C，蔽光，等待分析。經(jīng)固定后的細胞在冰箱內(nèi)可保存一周。若立即檢測可不固定。e.上機檢測上機打開流式細胞儀及氬離子激光源(488nm)，預(yù)熱20min，儀器自動初始化，用標準熒光微球進行光路與流路標準，所有熒光信號的變異系數(shù)(cv)均小于2%，在前向散射光(FS)和側(cè)向散射光(SS)散點圖中圈定細胞群，選擇淋巴細胞為分析對象，去除細胞碎片，用陰性對照確定熒光陰性范圍及PMT電壓標準，顏色補償，每份標本測定10000個細胞，全部數(shù)據(jù)用流式細胞儀和軟件SYSTEMII獲取和分析。f.殺傷率計算特異性殺傷率(R)=1—donorcells/recipientcellsX100%5、統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)示為均數(shù)±標準差。應(yīng)用SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間殺傷率均數(shù)比較用t檢驗，pO.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。三、實驗結(jié)果1.皮膚移植模型觀察1.1移植后一周后，發(fā)現(xiàn)由于急性排斥C57皮片周邊而開始干癟、脫落，皮膚移植后兩周(13天)移植皮膚完全脫落，C57—BALB/c皮膚移植排斥模型建立。1.2對照組BALB/c同系皮膚移植，皮片脫痂，手術(shù)部位平整、有新毛長出。2.流式結(jié)果2.1兩組的殺傷率情況如圖1所示1)兩種細胞輸注后在模型組和對照組的比例變化不同，模型組與對照組輸注本發(fā)明試劑lh、2h、4h、10h、1d、2d后對熒光染色C57小鼠脾細胞的特異性殺傷率有顯著差異(t=39.5,41.1，26.2,27.4，15.8,5.5，所有P<0.01)。輸注后一小時和兩小時模型組中熒光染色C57小鼠脾細胞的殺傷率分別高達87.4%±4.5%、92.2%±3.9%。2)同系皮膚移植對照組小鼠在注射本發(fā)明試劑后14個小時外周血流式檢測結(jié)果顯示C57/BALB比例仍保持在注射時的細胞比例1:l左右，BALB/c小鼠未表現(xiàn)出對異基因C57脾細胞有特異性殺傷作用，而10小時才表現(xiàn)出對C57脾細胞又有輕度殺傷，然后隨著時間的推移殺傷作用明顯增強，到注射后三天C57細胞被全部殺滅。體內(nèi)細胞毒性實驗表明同系皮膚移植BALB/c小鼠對異基因C57細胞由開始的不殺傷，隨著在體內(nèi)時間的延長三天后才被全部殺傷，是一個逐漸殺滅的過程。3)皮膚移植模型體內(nèi)殺傷過程與對照組則不同，注射后1個小時即表現(xiàn)出明顯的殺傷，C57/BALB比例降低，C57細胞明顯被殺滅，注射后2小時C57細胞就基本被完全清除，BALB表現(xiàn)出對供體細胞猛烈的殺傷特性。2.2兩組動物實驗流式圖可直觀反應(yīng)的BALB/c小鼠免疫狀態(tài)變化過程如圖217所示1)同系皮膚移植對照組BALB/c小鼠在注射異基因C57脾細胞后10小時以內(nèi)特異性細胞融解排斥反應(yīng)弱，10小時外周血C57脾細胞仍然剩余83%。隨著時間的延長BALB/c小鼠開始對C57脾細胞排斥反應(yīng)逐漸增強，C57脾細胞在一天時后快速被裂解64%。脾細胞注射后第三天，異基因C57脾細胞基本被清除，僅剩余5%。2)而同基因的BALB/c脾細胞到灌注后第6天仍然較高水平存在，且亮度沒有降低。3)模型組C57脾細胞在輸注后1小時就只剩7%，在24小時剩余5%，基本被完全排斥，而同基因BALB/c脾細胞同對照組一樣僅緩慢下降。4)兩組結(jié)果表明體內(nèi)細胞毒性實驗在注射本發(fā)明試劑后2—4小時即表現(xiàn)出明顯差異，選擇這一時間點可以準確判定兩組小鼠所處的免疫狀態(tài)，兩小時模型組小鼠殺傷率達到95%，說明小鼠機體免疫系統(tǒng)對供體特異性脾細胞處于高排斥狀態(tài)，而同系皮膚移植對照組小鼠注射本發(fā)明試劑兩小時后體內(nèi)細胞殺傷率僅為5%,表明短期內(nèi)對異基因細胞沒有明顯的特異性殺傷作用。因此本發(fā)明試劑可以準確的判斷體內(nèi)免疫系統(tǒng)的特異性免疫狀態(tài)，即對某一供體是排斥還是耐受狀態(tài)，選用本發(fā)明試劑注射后2小時作為監(jiān)測點為最佳時間點，能滿足臨床快速檢測的要求。2.3為進一步研究本發(fā)明試劑的穩(wěn)定性我們進行了自身對照實驗，由于同一只小鼠取血次數(shù)限制，每只小鼠取血時間點最多只能設(shè)定5次，試驗動物采用未行皮膚移植空白對照BALB/c鼠及C57-BALB/C皮膚移植排斥模型，流式結(jié)果如下-2.3.1未行皮膚移植空白對照BALB/c鼠體內(nèi)細胞毒性檢測流式結(jié)果1)鼠l.不同時間點混合細胞比例變化如表1所示，(l)同基因BALB/c脾細胞能夠在BALB/c小鼠外周血中長期存在，從輸注后六天從占外周血淋巴細胞的3.2%降到1.8%，并且下降速度有減慢趨勢，同時說明CFSE細胞毒性較小；較高濃度的CFSE(6yM)染色對脾細胞的活性影響小。同基因細胞減少的速度較慢可能是由于基本沒有排斥作用，細胞是自然衰老死亡，開始下降速度快可能與細胞經(jīng)過外機械處理破壞有關(guān)；(2)同BALB/c脾細胞相比，異基因的C57脾細胞在2小時仍表現(xiàn)出沒有特異性滅活細胞比例仍在h1，而一天以后就快速消失，1天時己經(jīng)從2小時的3.3%降到1.8%，三天是降到0.1%基本上全部消失，兩種細胞除了MHC不同以外，在體外細胞獲取、染色、體內(nèi)免疫環(huán)境及檢測時處理均相同，快速滅活只能時特異性抗原所致體內(nèi)特異殺傷所致。但是由于BALB/c小鼠體內(nèi)沒有預(yù)存C57特異性抗體或特異性CTL細胞，所以對殺傷C57脾細胞的特異性殺傷在1天以后才明顯的表現(xiàn)出來。(3)CFSE染色后自發(fā)性漏出少六天CFSE染色的脾細胞熒光強度沒有減弱，仍然和兩小時流式檢測結(jié)果一樣在103區(qū)域，說明CFSE自發(fā)性漏出少，是一種很好的體內(nèi)細胞示蹤的熒光燃料。(4)單染設(shè)計直方圖的結(jié)果形式比雙色更為簡單、直觀且能消除雙染誤差。表1鼠1不同時間點混合細胞比例變化的流式細胞儀檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2)鼠2體內(nèi)細胞毒性檢測流式結(jié)果如表2所示，鼠3體內(nèi)細胞毒性檢測流式結(jié)果如表3所示，其結(jié)果與鼠l基本一致，異基因C57細胞滅活在兩天以后增快，而同基因BALB/c脾細胞消失在外周血中長期存在，滅失緩慢，六天時仍然大量存在，且CSFE熒光強度在一周內(nèi)未見減弱，說明本方法試驗結(jié)果可重復(fù)性強。表2鼠1不同時間點混合細胞比例變化的流式細胞儀檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3鼠1不同時間點混合細胞比例變化的流式細胞儀檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.3.2皮膚移植模型自身對照流式結(jié)果同一只皮膚移植模型小鼠注射混合細胞懸液后不同時間點外周血兩種細胞比例變化情況如表4所示1)模型在兩小時異基因C57細胞即只剩0.3%，而同基因?qū)φ誃ALB/c脾細胞高達5.7%;1天時異基因C57細胞即只剩0.1%，而同基因?qū)φ誃ALB/c脾細胞高達3.4%，6天時同基因BALB/c脾細胞仍有2.5%，與未行皮膚移植的正常BALB/c小鼠結(jié)果相比，同基因細胞在外周血中存在的時間一致，而移植模型對供體C57脾細胞有強大的殺傷作用；2)異基因C57脾細胞的快速滅活可能與移植致敏有關(guān)系，移植后體內(nèi)存在大量供體特異性抗體及特異行CTL細胞，當與本發(fā)明試劑中的熒光染色C57細胞相遇時即對其發(fā)起猛烈的免疫攻擊，使其迅速發(fā)生溶細胞效應(yīng)而消失；3)本試驗?zāi)軌蛑庇^的看到兩種細胞在模型小鼠體內(nèi)的遭遇，異基因供體細胞迅速消失，而同基因細胞能長期存活，同基因細胞作為內(nèi)參照細胞可以通過流式直方圖直觀的看出細胞比例變化，從而了解小鼠的免疫狀態(tài)。表4同一只皮膚移植模型小鼠注射混合細胞懸液后不同時間點外周血兩種細胞比例變化情況<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>圖1是模型組和對照組對熒光染色C57細胞殺傷率隨時間變化曲線，+表示對照組，一表示模型組。圖2是注射本發(fā)明試劑后1小時模型組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖3是注射本發(fā)明試劑后1小時對照組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖4是注射本發(fā)明試劑后2小時模型組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖5是注射本發(fā)明試劑后2小時對照組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖6是注射本發(fā)明試劑后4小時模型組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖7是注射本發(fā)明試劑后4小時對照組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖8是注射本發(fā)明試劑后10小時模型組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖9是注射本發(fā)明試劑后10小時對照組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖IO是注射本發(fā)明試劑后1天模型組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖11是注射本發(fā)明試劑后1天對照組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖12是注射本發(fā)明試劑后2天模型組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖13是注射本發(fā)明試劑后2天對照組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖14是注射本發(fā)明試劑后3天模型組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖15是注射本發(fā)明試劑后3天對照組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖16是注射本發(fā)明試劑后6天模型組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。圖17是注射本發(fā)明試劑后6天對照組小鼠體內(nèi)細胞特異性殺傷情況，Ml為熒光染色C57細胞的流式峰面積，M2為熒光染色BALB/c細胞的流式峰面積。具體實施方式例11)從C57小鼠和BALB/c小鼠中取出脾細胞，分別用PBS懸浮并調(diào)整細胞濃度為107個/mL;2)將濃度為10mM的CFSE的二甲亞砜溶液以50倍的PBS稀釋后得200nMCFSE工作液；3)往C57小鼠脾細胞懸液中加入CFSE工作液染色使CFSE的終濃度為0.3uM，往BALB/c小鼠脾細胞懸液中加入CFSE工作液使CFSE終濃度為6yM，然后在溫度為37°C，孵育染色15分鐘；4)染色細胞用0.01M的4'CPBS洗滌2次后重懸于PBS;5)按細胞數(shù)1:1的比例混合兩種熒光染色細胞，并調(diào)整細胞總濃度為5X107個/mL，即可。細胞活力檢測適量細胞混合懸液稀釋后，取一滴稀釋液和一滴0.5%臺盼藍溶液混合，靜置3min，加至細胞計數(shù)板，倒置顯微鏡下觀察，活細胞不著色，死細胞核成藍色，計數(shù)活細胞和死細胞數(shù)量，按下式計算百分比，活細胞比例達95%以上細胞存活率-O.5《臺盼藍染色陰性細胞/100個細胞/HPX100。流式細胞術(shù)分析CFSE標記細胞以PBS對照處理淋巴細胞為陰性參照，將CFSE標記淋巴細胞樣本上流式細胞儀，設(shè)定488mn激發(fā)/525mn濾過，測定陽性細胞比例為大于95%。1)從C57小鼠和BALB/c小鼠中取出脾細胞，分別用PBS懸浮并調(diào)整細胞濃度為107個/mL;2)將濃度為10raM的CFSE的二甲亞砜溶液以50倍的PBS稀釋后得200nMCFSE工作液；3)往C57小鼠脾細胞懸液中加入CFSE工作液染色使CFSE的終濃度為0.3yM,往BALB/c小鼠脾細胞懸液中加入CFSE工作液使CFSE終濃度為6uM，然后在溫度為37'C，孵育染色17分鐘；4)染色細胞用0.01M的4°CPBS洗滌3次后重懸于PBS;5)按細胞數(shù)1:1的比例混合兩種熒光染色細胞，并調(diào)整細胞總濃度為8X107個/mL，即可。例31)從C57小鼠和BALB/c小鼠中取出脾細胞，分別用PBS懸浮并調(diào)整細胞濃度為107個/mL;2)將濃度為10mM的CFSE的二甲亞砜溶液以50倍的PBS稀釋后得200uMCFSE工作液；3)往C57小鼠脾細胞懸液中加入CFSE工作液染色使CFSE的終濃度為0.3"M，往BALB/c小鼠脾細胞懸液中加入CFSE工作液使CFSE終濃度為M，然后在溫度為37t)，孵育染色20分鐘；4)染色細胞用0.01M的4。CPBS洗滌3次后重懸于PBS;5)按細胞數(shù)1:1的比例混合兩種熒光染色細胞，并調(diào)整細胞總濃度為1X108個/mL，即可。權(quán)利要求1、一種鼠免疫狀態(tài)監(jiān)測試劑，該試劑是經(jīng)CFSE染色的兩種近交系的鼠脾細胞的PBS懸液，其中兩種鼠脾細胞的總濃度為0.5～1×108個/ml，二者的比例為1∶1，熒光染色濃度差為1∶20。2、權(quán)利要求1所述的免疫狀態(tài)監(jiān)測試劑的制備方法，該方法由以下步驟組成1)分別取兩種近交系的鼠脾細胞，用PBS懸浮并調(diào)整細胞濃度，得到兩種濃度均為107+/mL的細胞懸液；2)將濃度為10mM的CFSE的二甲亞砜溶液以50倍的PBS稀釋后得200^iMCFSE工作液；3)往步驟1所得的一種細胞懸液中加入步驟2所得的CFSE工作液，使CFSE的終濃度為0.3pM，往步驟1所得的另一種細胞懸液中加入步驟2所得的CFSE工作液，使CFSE終濃度為6pM，然后在溫度為37"下孵育染色1520分鐘；4)分別收集步驟3所得的細胞懸液中的染色細胞，用0.01M的4'CPBS洗滌23次后重懸于PBS;5)按細胞數(shù)1:1的比例混合步驟4所的兩種染色細胞懸液，并用PBS調(diào)整細胞總濃度為0.51X108個/mL，即可。全文摘要本發(fā)明提供了一種鼠免疫狀態(tài)監(jiān)測試劑，該試劑是經(jīng)CFSE染色的兩種近交系的鼠脾細胞的PBS懸液，其中兩種鼠脾細胞的總濃度為0.5～1×10⁸個/ml，二者的比例為1∶1，熒光染色濃度差為1∶20。將本發(fā)明試劑通過靜脈注射到移植模型鼠，可通過抽血檢測不同時間段本發(fā)明試劑中兩種細胞的比例變化來判斷移植模型鼠所處的免疫狀態(tài)。文檔編號G01N33/49GK101149371SQ20071003107公開日2008年3月26日申請日期2007年10月26日優(yōu)先權(quán)日2007年10月26日發(fā)明者孫爾維,潘明新,王海瀾,蔣澤生,袁小澎,聰馬,毅高申請人:南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院