專利名稱：：一種用于檢測肝纖維化的液相芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物類，具體地是涉及一種用于檢測肝纖維化的液相芯片及其制備方法。
背景技術(shù)：
：肝纖維化是指在各種慢性肝病中，肝細胞發(fā)生持續(xù)、反復的壞死或炎癥剌激，導致機體發(fā)生修復反應(yīng)，大量纖維增生同時伴有纖維降解相對或絕對不足，細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)大量沉積的病理過程。肝纖維化不是一個獨立的疾病，而是許多慢性肝病的共同病理過程，同時也是慢性肝炎、肝硬化等進一步發(fā)展、惡化的重要原因。中國是病毒性肝炎的高發(fā)國家，各種慢性肝病的主要病理發(fā)展是通過肝纖維化再惡化為肝硬化，且多見于壯年，慢性肝病經(jīng)由肝纖維化發(fā)展到肝硬化，乃至發(fā)生門脈高壓、腹水、肝性腦病甚至肝癌等嚴重并發(fā)癥。大量臨床研究表明，因為體內(nèi)存在纖維降解過程，肝纖維化是可以減輕和逆轉(zhuǎn)的，但發(fā)展至肝硬化則再不可逆。如能阻斷、減輕乃至逆轉(zhuǎn)肝纖維化，就能在很大程度上改善肝病的預后。因此，早期診斷肝纖維化，阻止或延緩肝纖維化發(fā)生、發(fā)展，對于肝病的診治具有重要的價值。目前診斷肝臟纖維化的方法可分為三大部分-①病理學診斷到目前為止，經(jīng)肝穿或經(jīng)腹腔鏡肝活檢，進行組織病理學檢査仍是診斷肝纖維化和肝硬化的"金標準"。但肝活檢本身也存在許多問題，如肝臟病變的不均勻性而導致的取樣誤差，以及由于存在一定的創(chuàng)傷性，患者難以接受，很難反復取材等，因此不能動態(tài)地觀察肝纖維化及纖維化形成的情況。此外，肝穿針的質(zhì)量、肝穿的深度、肝穿組織的量，切片、染色等過程均可影響組織病理診斷的準確性。②影像學診斷對纖維化的特異性識別是影像學研究的一個重要問題，但X線和B超不能對纖維化作出確診和鑒別診斷。③血清學診斷血清學診斷是研究最廣泛的肝纖維化診斷方法。該法取材方便，價格低廉，并可早期診斷，已成為目前應(yīng)用最為廣泛的方法。近年來，臨床上將肝纖維化時釋放于外周血中的某些代謝產(chǎn)物濃度作為反應(yīng)肝纖維化的非侵入性檢測指標。血清肝纖維化標志物主要有III型前膠原(PIIIP)，IV型膠原及其片段(IV-C)，層粘連蛋白(LN)，透明質(zhì)酸酶(HA)，脯肽酶(PLD)。動物實驗顯示，血清HA、PIIIP、LN和IVC依據(jù)肝臟病理分級和分期的增加而升高，正常人與肝纖維化患者血清HA、PIIIP、LN和IVC有顯著性差異(PO.Ol)，且隨著疾病的嚴重程度而升高(PO.Ol)。然而，血清肝纖維化指標由于受到多方面結(jié)締組織代謝的影響，單項指標只能反映肝纖維化的某個方面，對診斷肝纖維化的準確性不高。聯(lián)合檢測有助于肝纖維化的診斷(王晉云，2001;錢引坤，2001;趙明，2003;張雪松，2004;林城，2005;肖蘭，2006;王霞，2006;張斌，2006;韓建國，2006等)。臨床達成共識的常用組合為PIIIP+IV-C+HA+LN，稱為肝纖維化四項檢査。其中，透明質(zhì)酸酶(HA)是肝細胞外間質(zhì)中的蛋白多糖，主要由肝內(nèi)間質(zhì)細胞合成，內(nèi)皮細胞參與降解。肝纖維化時HA合成增加，降解減少，血清水平升高。多項研究結(jié)果顯示，血中HA在肝纖維化早期即見顯著增加。HA是目前眾多纖維化生化指標中最為敏感和特異的指標，其診斷的準確性為82.19%，特異性為93%，敏感性為56%。IV型膠原(IV-C)主要存在于Disse腔及匯管小血管周圍，是基底膜的主要成分，在細胞黏附、分化和基因表達中起重要作用。肝纖維化時IV-C沉積增加，是反映肝基底膜膠原變化的可靠指標。m型前膠原(Piiip)是ni型前膠原裂解下來的N末端肽，肝纖維化早期pnip合成活躍，晚期合成減慢。層粘連蛋白(LN)是細胞外基質(zhì)糖蛋白成分，是細胞外骨架的支撐結(jié)構(gòu)，并對細胞外基質(zhì)其他成分有黏附作用。血清LN值反映了基底膜的更新率，可反映肝竇的毛細血管化和匯管區(qū)纖維化的范圍。血清LN對判斷肝纖維化的特異性和正確率分別為98%和92%，但其敏感性只有63%。而聯(lián)合檢測則可使檢測的靈敏度，特異性和準確率等大大提高。錢梅艷等發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測PIIIP，IV-C，HA與LN肝纖維化的陽性檢出率高達92X，而各個指標的單獨檢測則陽性率低于85%。首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院肝病中心陳煜博士的一項臨床試驗發(fā)現(xiàn)B超聯(lián)合血清肝纖維四項指標檢測，診斷肝硬化的靈敏度為94.4%,特異度為95.5%，準確度達95.1%。肝纖維化四項檢査主要使用放射免疫，酶聯(lián)免疫吸附等方法。然而這些方法每次測試只能獲得一個標志物的濃度。如果要檢測多個指標，則需要多個反應(yīng)來完成，不僅浪費時間，同時還浪費標本，檢測成本相對較高。因此，應(yīng)用一次反應(yīng)同時檢測多個指標的技術(shù)平臺檢測肝纖維化具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有肝纖維化檢査方法一次只能檢測一個標志物的技術(shù)的不便和臨床診斷的需要，本發(fā)明要解決的問題是提供一種可以四項標志物聯(lián)檢的肝纖維化檢測液相芯片，該液相芯片為肝纖維化的早期診斷提供一種無創(chuàng)傷的，準確方便的臨床檢測手段。解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下一種用于肝纖維化檢測液相芯片，主要包括有4-plex包被微球m型前膠原(PIIIP)的捕獲抗體(C.Ab-PIIIP)包被的微球，IV型膠原及其片段(IV-C)的捕獲抗體(C.Ab-IV-C)包被的微球，層粘連蛋白(LN)的捕獲抗體(C.Ab-LN)包被的微球，透明質(zhì)酸酶(HA)的捕獲抗體(C.Ab-HA)包被的微球，上述微球分別具有不同顏色編碼；4-plex生物素標記檢測抗體分別用生物素標記的III型前膠原(PIIIP)的檢測抗體(D.Ab-PIIIP)，IV型膠原及其片段(IV-C)的檢測抗體(D.Ab-IV-C)，層粘連蛋白(LN)的檢測抗體(D.Ab-LN)，透明質(zhì)酸酶(HA)的檢測抗體(D.Ab-HA);鏈親和素藻紅蛋白(SA-PE)。本發(fā)明的另一需要解決的技術(shù)問題是提供一種上述用于肝纖維化檢測的液相芯片的制備方法。一種制備用于肝纖維化檢測的液相芯片的方法，主要包括以下步驟(1)相應(yīng)的捕獲抗體包被微球-將50pL微球活化后，28000g，離心；-吸棄上清，將微球重懸于pH5.0的230-280pL50mM的MES的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s，后將微球于28000g，離心l-2min;重復該歩驟；-吸棄上清，將微球重懸于lOOpL50mMpH5.0的MES的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s;-往懸浮的微球中加入相應(yīng)的0.8-1.2嗎抗體，用50mM的pH5.0的MES溶液將總體積補至450-550^L;-用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩1.5-2.5hr;-偶聯(lián)了抗體后的微球以^8000g的速度，離心l-2min;-吸棄上清，將微球重懸于500nLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲振蕩約20s;-室溫避光振蕩30min;再于^8000g，離心l-2min;-吸棄上清，將微球重懸于lmLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s;微球S8000g，離心l-2min;重復該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸于500-1000nLPBS-TBN溶液中；-每種包被好的微球通過luminex儀器計數(shù)后置于2-8'C避光單獨保存，使用時，依據(jù)檢測需要等比例混合；(2)每種檢測抗體的生物素標記--依據(jù)檢測抗體濃度計算出檢測抗體溶液稀釋至lmg/ml的體積，視為目標體積；-配置10mg/ml的NHS-Biotin反應(yīng)液；-按摩爾比l:IOO于反應(yīng)管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin反應(yīng)液；-加入體積為目標體積的pH8.9的1/10的NaHC03溶液；-加入pH7.4的PBS補至目標體積；-包上鋁箔，將反應(yīng)管置于振蕩器上，于25'C恒溫箱中避光孵育3-5小時，轉(zhuǎn)速為訓rpm陽訓Orpm;-將反應(yīng)液轉(zhuǎn)至透析盒內(nèi)，于PBS緩沖液中透析過夜，以去除未反應(yīng)的NHS-Biotin;-使用時根據(jù)需要將標記好的每種檢測抗體等比例混合。所述活化微球的步驟如下-用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球；-取50pL微球離心l-2min;-去掉上清夜，將微球重懸于100pL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約20s，S8000g離心1—2min;-吸棄上清，加入80nL的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約20s;-加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-力口入10^L50mg/mLEDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-室溫避光靜置20min，每10min用渦漩振蕩器輕輕地混勻。本發(fā)明綜合液相芯片技術(shù)平臺多指標并行檢測的優(yōu)勢與雙抗夾心法的靈敏性，進行血清中III型前膠原(PIIIP)，IV型膠原及其片段(IV-C)，層粘連蛋白(LN)，透明質(zhì)酸酶(HA)的濃度檢測。液相芯片技術(shù)也叫流式熒光技術(shù)，該技術(shù)由一種微球作為反應(yīng)載體，微球用聚苯乙烯材料制成，直徑5.6um，表面有活性羧基可供化學偶連用，抗原、抗體等生物大分子可通過氨基與微球表面的羧基通過化學反應(yīng)共價結(jié)合(即包被過程)。在微球制造過程中加入紅外和遠紅外兩種熒光染料，根據(jù)兩種染料混合比例的不同將微球進行編碼，可區(qū)分出上百種不同編碼的微球。使用時，先將III型前膠原(PIIIP)的捕獲抗體(C.Ab-PIIIP)，IV型膠原及其片段(IV-C)的捕獲抗體(C.Ab-IV-C)，層粘連蛋白(LN)的捕獲抗體(C.Ab-LN)，透明質(zhì)酸酶(HA)的捕獲抗體(C.Ab-HA)分別包被于不同顏色編碼的微球上，同時分別用生物素標記III型前膠原(PIIIP)的檢測抗體(D.Ab-PIIIP)，IV型膠原及其片段(IV-C)的檢測抗體(D.Ab-IV-C)，層粘連蛋白(LN)的檢測抗體(D.Ab-LN)，透明質(zhì)酸酶(HA)的檢測抗體(D.Ab-HA)。將包被好的四種微球混合，懸浮于液相，再加入標本，在懸液中微球上標記的C.Ab與標本中相應(yīng)的檢測物的某一個表位異性地結(jié)合，之后加入生物素標記的檢測抗體與標本中相應(yīng)檢測物的另一表位特異性結(jié)合，反應(yīng)完全后加入熒光物質(zhì)-藻紅蛋白標記的鏈親和素，由于鏈親和素藻紅蛋白(SA-PE)可以與生物素高度特異性結(jié)合，因此反應(yīng)體系中最后形成"微球-C.Ab-PIIIP+PIIIP+D.Ab-PIIIP+SA-PE","微球-C.Ab-IV-C+IV-C+D.Ab-IV-C+SA-PE","微球-C.Ab-LN+LN+D.Ab-LN+SA-PE","微球-C.Ab-HA+HA+0.八1>1^+8八-『四種復合物，以微球為載體，通過Luminex系列液相芯片分析儀器檢測，讀取微球的色彩編號及SA-PE的熒光值。微球色彩編號可辨別檢測項目，SA-PE熒光值與各檢測物濃度呈正相關(guān)，通過測定III型前膠原(PIIIP)，IV型膠原及其片段(IV-C),層粘連蛋白(LN),透明質(zhì)酸酶(HA)標準品在不同濃度下的熒光值，可以獲得各個檢測指標標準品濃度-熒光值標準曲線以及標準曲線方程。將待測血清樣本檢測所得熒光值代入標準曲線方程即可分別求得待測血清樣本中的III型前膠原(PIIIP)，IV型膠原及其片段(IV-C)，層粘連蛋白(LN)，透明質(zhì)酸酶(HA)的量。本發(fā)明所公開的肝纖維化檢測液相芯片只需25pL的血清樣本即可一次反應(yīng)同時完成肝纖維化的四種血清標志物的定量檢測。同時，與放射免疫，化學發(fā)光檢測及酶聯(lián)免疫吸附等方法相比，液相芯片平臺檢測范圍更寬，靈敏度更高，重復性更好。由于所有反應(yīng)均處在液相環(huán)境，更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，使探針和被檢測物的反應(yīng)更快更完全，因此檢測靈敏度和線性范圍均得到極大的提高。因此，本發(fā)明利用液相芯片平臺進行肝纖維化四項檢測，能達到準確快速診斷肝纖維化的目的，具有檢測效率高，所需樣本量少，特異性強，靈敏度高等優(yōu)點。另外，本發(fā)明的技術(shù)方案中的各種工藝參數(shù)如微球和抗體的量、反應(yīng)過程等均是在大量試驗基礎(chǔ)上得出的，為制備過程最佳的參數(shù)值。具體實施方式實施例l:本實施例中，所述各種溶液的配方如下1.50mM的MES緩沖液(pH5.0)配方(250ml):<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(一)用于肝纖維化檢測的液相芯片1)包括有4-plex包被微球III型前膠原(PIIIP)的捕獲抗體(C.Ab-PIIIP)包被的20號微球，IV型膠原及其片段(IV-C)的捕獲抗體(C.Ab-IV-C)包被的36號微球，層粘連蛋白(LN)的捕獲抗體(C.Ab-LN)包被的53號微球，透明質(zhì)酸酶(HA)的捕獲抗體(C.Ab-HA)包被的微球56號，上述微球分別具有不同顏色編碼；2)4-plex生物素標記檢測抗體分別用生物素標記的III型前膠原(PIIIP)的檢測抗體(D.Ab-PIIIP)，IV型膠原及其片段(IV-C)的檢測抗體(D.Ab-IV-C)，層粘連蛋白(LN)的檢測抗體(D.Ab-LN)，透明質(zhì)酸酶(HA)的檢測抗體(D.Ab-HA);3)鏈親和素藻紅蛋白(SA-PE);還按照現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)配套設(shè)有4)分析緩沖液；5)4-plex標準品；6)質(zhì)控液I;7)質(zhì)控液II;8)血清基質(zhì)液；9)封口膜；10)濾板。(二)制備上述用于肝纖維化檢測的液相芯片的方法，其步驟包括如下(1)捕獲抗體與微球偶聯(lián)(微球包被)1.分別選取各色微球(Luminex公司)，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球，大約20S;2.分別取上述各號微球50pL，分別轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，8,000g以上速度離心l-2min;3.去掉上清夜，將微球重懸于100pL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約20s，8000g速度離心1一2min;4.吸棄上清，加入80pL的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約20s:5.加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；6.力口入10pL50mg/mLEDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；7.室溫避光靜置20min，每10min用渦漩振蕩器輕輕地混勻；8.活化后的微球，^8000g，離心l-2min;9.吸棄上清，將微球重懸于250pL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s;10.將微球于^8000g，離心l-2min;11.重復步驟9和10;12.吸棄上清，將微球重懸于lOOpL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s;13.往懸浮的微球中分別加入相應(yīng)的l嗎抗體，用50mM的MES(pH5.0)溶液將總體積補至50(^L;14.用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩2hr;15.偶聯(lián)抗體后的微球以28000g的速度，離心l-2min;16.吸棄上清，將所述微球重懸于50(HiLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20S;17.室溫避光振蕩30min;18.所述微球^8000g,離心l-2min;19.吸棄上清，將微球重懸于lmLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s;20.微球^8000g，離心2min;21.重復步驟18和19一次；22.吸棄上清，將偶眹好好的微球重懸于600pLPBS-TBN溶液中；其它的抗體偶聯(lián)微球的制備如上述方法，即得PIIIP捕獲抗體與20號微球的偶聯(lián)體，IV-C與36號微球的偶聯(lián)體，LN與53號微球的偶聯(lián)體，HA與56號微球的偶聯(lián)體。23.包被好的微球通過luminex儀器計數(shù)；24.包被好的微球置于2-8'C避光保存。一般每種抗體偶聯(lián)的微球單獨保存，使用時，依據(jù)檢測項目選擇混合。(2)每種檢測抗體的生物素標記-考馬斯亮藍法測定蛋白濃度；-依據(jù)蛋白濃度計算反應(yīng)體系，填寫表格；-依據(jù)蛋白濃度計算抗體溶液稀釋至lmg/ml的體積，視為目標體積(V):-配置NHS-Biotin反應(yīng)液；-按摩爾比1:100于反應(yīng)管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin(10mg/ml)反應(yīng)液;-加入1/10目標體積的NaHC03(pH8.9)溶液；-加入PBS(pH7.4)補至目標體積；-包上鋁箔，將反應(yīng)管置于振蕩器上，于25。C恒溫箱中避光孵育4h，轉(zhuǎn)速為900rpm-將反應(yīng)液轉(zhuǎn)至透析盒內(nèi)，于PBS緩沖液中透析過夜，以去除未反應(yīng)的NHS-Biotin-測定蛋白濃度；-加入0.02%NaN3于已結(jié)合有生物素的抗體溶液中。-在4'C避光保存。使用時，依據(jù)檢測項目選擇混合。(三)利用本發(fā)明所述肝纖維化四項平行檢測液相芯片進行檢測1.使用前先取出所有試劑，放置平衡至室溫。2.標準品的稀釋分別根據(jù)四種血清標志物的血清學濃度的范圍，配制4種肝纖維化血清標志物的標準品，每個標準品設(shè)6個稀釋度，然后等比例混合，使各自得終濃度為所需的濃度。各管稀釋方法及理論濃度如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>3.樣品處理所有樣品須用分析緩沖液作l:5稀釋后才可用于測定。4.設(shè)置96孔板布局，確定96孔板上標準品、質(zhì)控品、待測樣品及空白孔的位置。考慮到儀器讀數(shù)的順序是按照從第1列到第12列、從第A行到第H行的順序縱向讀數(shù)，在設(shè)置96孔板布局時應(yīng)遵循從第1列到第12列、從第A行到第H行的順序排列。5.按照設(shè)置好的96孔板布局，每孔加25nl分析緩沖液，再分別加入25ul標準品、質(zhì)控品、待測樣品到各自孔中，空白孔加25ul分析緩沖液。6.分別取出上述制備的針對肝纖維化四項血清標志物的捕獲抗體偶聯(lián)微球，用渦旋混合儀混勻30鈔，再用超聲清洗儀處理30秒，按等比例混合，使混合液中每種捕獲抗體偶聯(lián)的微球濃度均為40個/pl。往每孔中加入四種微球混合的懸液25^1。包被微球應(yīng)在臨用前混勻，且混勻后應(yīng)立即使用，否則放置過久微球會再沉淀。7.用封口膜封住所有加樣孔口，并用錫箔紙包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振蕩器上以600轉(zhuǎn)速度震蕩，孵育60分鐘。8.孵育完成后每孔加入25ul上述制備的生物素標記的檢測抗體的混合液(其中所述四種生物素標記的檢測抗體事先按等比例混合，搖勻)，用封口膜封住所有加樣孔口，并用錫箔紙包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振蕩器上以600轉(zhuǎn)速度震蕩，再孵育60分鐘。9.孵育完成后每孔加入25ul鏈親和素藻紅蛋白，用封口膜封住所有加樣孔口，并用錫箔紙包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振蕩器上以600轉(zhuǎn)速度震蕩，再孵育30分鐘。10.于Luminex系列液相芯片分析儀上讀取結(jié)果。儀器可自動繪制標準曲線，并計算出待測樣品的測值。(四)實驗結(jié)果如下(請參見圖1至圖4)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實驗結(jié)果顯示，PinP，IV-C，HA,LN各指標標準曲線的線性在檢測的濃度范圍內(nèi)R2》0.99，實測濃度與預期濃度的相對誤差不超過5%。通過四項指標的聯(lián)合檢測，預計可使肝纖維化診斷的靈敏度達到85%以上，特異性達到92%以上，準確率達到90%，陽性檢出率達92%。圖1是檢測PIIIP的標準曲線示意圖;圖2是檢測IV-C的標準曲線示意圖;圖3是檢測HA的標準曲線示意圖；圖4是檢測LN的標準曲線示意圖。權(quán)利要求1.一種用于肝纖維化檢測液相芯片，其特征是，主要包括有4-plex包被微球III型前膠原的捕獲抗體包被的微球，IV型膠原及其片段的捕獲抗體包被的微球，層粘連蛋白的捕獲抗體包被的微球，和透明質(zhì)酸酶的捕獲抗體包被的微球，上述微球分別具有不同顏色編碼；4-plex生物素標記檢測抗體分別用生物素標記的III型前膠原的檢測抗體，IV型膠原及其片段的檢測抗體，層粘連蛋白的檢測抗體，和透明質(zhì)酸酶的檢測抗體；以及鏈親和素藻紅蛋白。2.—種制備如權(quán)利要求1所述的用于肝纖維化檢測的液相芯片的方法，其特征是，主要包括以下步驟(1)相應(yīng)的捕獲抗體包被微球-將5(HiL微球活化后，28000g，離心；-吸棄上清，將微球重懸于pH5.0的230-280^L50mM的MES的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s，再將微球于28000g，離心l-2min;重復該步驟；-吸棄上清，將微球重懸于100pL50mMpH5.0的MES的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s;-往懸浮的微球中加入相應(yīng)的0.8-1.2嗎抗體，用50mM的pH5.0的MES溶液將總體積補至450-550(iL;-用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩1.5-2.5hr;-偶聯(lián)了抗體后的微球以28000g的速度，離心l-2min;-吸棄上清，將微球重懸于500nLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲振蕩約20s;-室溫避光振蕩30min;再于^8000g，離心l-2min;-吸棄上清，將微球重懸于lmLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s;微球28000g，離心l-2min;重復該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸于500-1OOOpLPBS-TBN溶液中；-每種包被好的微球通過luminex儀器計數(shù)后置于2-8X:避光單獨保存，使用時，依據(jù)檢測需要等比例混合；(2)每種檢測抗體的生物素標記-依據(jù)檢測抗體濃度計算出檢測抗體溶液稀釋至lmg/ml的體積，視為目標體積；-配置10mg/ml的NHS-Biotin反應(yīng)液；-按摩爾比l:IOO于反應(yīng)管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin反應(yīng)液；-加入體積為目標體積的pH8.9的1/10的NaHC03溶液；-加入pH7.4的PBS補至目標體積；-包上鋁箔，將反應(yīng)管置于振蕩器上，于25。C恒溫箱中避光孵育3-5小時，轉(zhuǎn)速為訓rpm-腦Orpm;-將反應(yīng)液轉(zhuǎn)至透析盒內(nèi)，于PBS緩沖液中透析過夜，以去除未反應(yīng)的NHS-Biotin;-使用時根據(jù)需要將標記好的每種檢測抗體等比例混合。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述活化微球的步驟如下-用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球；-取50pL微球離心l-2min;-去掉上清夜，將微球重懸于10(HiL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約20s，S8000g離心l一2min;-吸棄上清，加入pH6.2的80pL的磷酸鹽緩沖液，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約20S;-加入10nL50mg/mLSulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-力口入10pL50mg/mLEDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-室溫避光靜置20min，每10min用渦漩振蕩器輕輕地混勻。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于肝纖維化檢測的液相芯片，主要包括有(1)4-plex包被微球含有分別包被了III型前膠原(PIIIP)捕獲抗體、IV型膠原及其片段(IV-C)捕獲抗體、層粘連蛋白(LN)捕獲抗體及透明質(zhì)酸酶(HA)捕獲抗體的不同顏色編碼微球；(2)4-plex生物素標記檢測抗體分別用生物素標記的PIIIP、IV-C、LN、HA的檢測抗體；以及(3)鏈親和素藻紅蛋白。本發(fā)明還公開了該液相芯片的制備方法。本發(fā)明所述的用于肝纖維化檢測液相芯片具有無副作用，高通量，多指標并行檢測；敏感度高，重復性好，檢測快速，準確，費用低等優(yōu)點。文檔編號G01N33/544GK101178403SQ200710031660公開日2008年5月14日申請日期2007年11月26日優(yōu)先權(quán)日2007年11月26日發(fā)明者楊惠夷,林一群,許嘉森申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司