專利名稱：：測定糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬分析化學領域，具體涉及一種測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇在糧食中含量的方法。背錄技術脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，又名為嘔吐毒素(vomitoxinorvomitingtoxin,VT)，以及雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)都是某些鐮刀菌(主要是禾谷鐮刀菌)產(chǎn)生的毒素，屬B族單端孢霉稀族毒素。DON的結構為3a，7a，15-三羥基-12、13-環(huán)氧單端孢霉_9烯-8酮，NIV的結構為3a，4e，7a，15-四羥基-12、13-環(huán)氧單端孢烯-9烯-8酮。DON和NIV的結構式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>DON和NIV的毒性包括急性毒性、慢性和亞慢性毒性、細胞毒性、致突變、致崎、致癌作用及免疫毒性。它們主要在田間浸染小麥、玉米等谷類作物。DON是赤霉病麥中毒的主要病原物質。當人誤食入受污染的糧谷作物時，其典型癥狀是嘔吐，有地方稱其為"醉谷病"?，F(xiàn)有技術公開的測定糧谷中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的方法有薄層色譜法；填充柱氣相色譜法；酶聯(lián)免疫法(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測)等。其中，薄層色譜法，由于隨機誤差以及不確定因素太多，導致其測定結果不是很穩(wěn)定；并且薄板測定方法的檢出限大于125yg/kg;填充柱氣相色譜法，其中填充柱的制備較為繁復，且與毛細氣相色譜相比分離能力較低；酶聯(lián)免疫法，影響因素太多以及抗體制備復雜，且在一系列研究方面與毛細氣相色譜法比較顯示出了,聯(lián)免疫方法的缺點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種簡便而準確的能同時測定糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪Hii刀菌烯醇含量的方法。本發(fā)明方法采用毛細氣相色譜法測定谷物以及豆類中的脫氧雪腐鐮刀菌烯酵的含量。本發(fā)明方法對糧食類待測樣品經(jīng)過樣品預處理后，加入反應溶劑以及衍生化試劑進行衍生化反應，然后采用毛細色譜法測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與雪腐鐮刀菌烯醇衍生物的濃度，再經(jīng)過換算成糧食類樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及雪腐鐮刀菌烯,的含量。本發(fā)明釆用DB-5MS毛細氣相色譜柱以及微池電子捕獲檢測器(yECD)，測定谷物以及豆類糧食類樣品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，明顯提高了檢測的靈敏度以及準確度。本方法的毛細氣相色譜儀操作條件為DB-5MS毛細柱，載氣流速1.82.5ml/min;溫度為氣化室300350°C;uECD300350°C，層析柱250300'C。本發(fā)明方法測定糧食類樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與雪腐鐮刀菌烯醇含量準確、可靠。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇出峰時間為4.9分鐘左右，線性范圍9150lig/kg，線性相關系數(shù)ri.99952，最小檢出量1.78ug/kg。雪腐鐮刀菌烯醇出峰時間為7.1分鐘左右，線性范圍50800ug/kg，線性相關系數(shù)ri.99353，最小檢出量24.7yg/kg。谷類中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇回收率86%以上，RSD小于9.8%，毒腐鐮刀菌烯醇回收率80%以上，RSD小于6。/q。本發(fā)明對面粉，玉米，豆類共20份糧食樣品進行毛細氣相色譜法與現(xiàn)有技術的國家標維GB/T5009.111-2003的第二法中規(guī)定采用的酶聯(lián)免疫(ELISA)測定結果比較，所得的結果經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗，P=0.5，顯示統(tǒng)計學上沒有顯著差異。本發(fā)明方法與酶聯(lián)免疫法比較，具有回收率高，精密度好，變動系數(shù)小等優(yōu)點，測定結果準確，能極大地提高工作效率，，顯示出如下顯著優(yōu)勢(1)本發(fā)明方法的回收率為86.84%101.85%，變異系數(shù)〈10%;酶聯(lián)免疫方法的回收率為85110%，變異系數(shù)〈10%，本發(fā)明方法的回收率區(qū)間更窄，方法更可靠；(2)最低檢出限酶聯(lián)免疫方法檢測下限為18.5ug/kg，本發(fā)明方法的檢測下限為1.78ug/kg，本發(fā)明方法的靈敏度以及檢測能力可達到酶聯(lián)免疫方法的10倍；(3)成本以及效率本發(fā)明方法采用了DB-5MS毛細柱以及先進的毛細氣相色譜儀自動進樣，且配備精密的紀錄軟件，操作大為簡便；(4)本方法的待測樣品穩(wěn)定時間可維持12個小時以上，但酶聯(lián)免疫法的樣品需要在完成后的IO分鐘以內(nèi)完成；本方法的樣品不受數(shù)量多而影響前后樣品反應時間不同而造成誤差，相反，酶聯(lián)免疫方法由于受到嚴格的時間限制，采用的是微量注射器，所以帶來的系統(tǒng)誤差大，且每批樣品不可太多，檢測操作較繁瑣。表1是本方法(毛細氣相色譜法)與酶聯(lián)免疫法測定糧食中DON的結果比較。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>圖1是DON和NIV的標準色譜圖，其中，在出峰時間為4.9分鐘有一個脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的峰；7.1分鐘有一個雪腐鐮刀菌烯醇的峰。具體實施方式實旛例l色譜條件美國Agilent6890型氣相色譜儀(包括微池電子捕獲檢測器、自動進樣系統(tǒng))；色譜柱DB-5MS毛細氣相色譜柱載氣流速1.82.5ml/min;溫度為氣化室300350。C;uECD300350°C,層析柱250300°C。樣品制備1.提取稱取20g粉碎過篩的谷類樣品置于250ml具塞錐型瓶中，加30ml石油醚和100ml甲醇-水(3:1)溶液，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴防漏。振蕩30分鐘，靜置片刻，以快速定性濾紙過濾于分液漏斗中，待分層后，放出下層甲醇-水溶液于另一錐型瓶中，水浴蒸干。加入4ml甲醇，置超聲波發(fā)生器內(nèi)超聲2分鐘，取4ml上柱。2.柱層析層析柱制備按照Tanaka方法制備層析柱。在層析柱底端塞上少許玻璃棉，加入5g無水硫酸鈉，加入約30ml石油醚后，再加入10克弗羅里硅土，振搖、敲緊后再覆兼5g無水硫酸鈉。柱層析取4ml甲醇提取液上柱。先用30ml石油醚以2ml/min的速度淋洗，洗脫雜質。再用150ml氯仿一甲醇(9:1)以2ml/min的速度洗脫毒素。收集氯仿一甲醇液，水浴蒸干。殘渣用2ml甲醇溶解。3.衍生取上述甲醇提取液0.5ml于具塞試管中，在45'C下用氮氣吹干。加入O.lmlTMS衍生劑,塞緊瓶蓋，作用20分鐘，加入lml乙酸乙酯，搖勻后以2000轉/分的速度離心3分鐘，取lul進氣相色譜儀分析。線性試驗配制標準系列，使DON的濃度分別為0.045、0.09、0.15、0.3、0.75yg/ml,NIV的濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0ixg/ml，取1y1進樣。以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，以下按"樣品制備"項處理。以衍生物峰面積對脫氧雪腐鐮刀菌烯衍生物濃度進行線性回歸，其回歸方程為f-MZ.67《75J-7fti^^^,相關系數(shù)r=0.99952(n=5);以衍生物峰面積對雪腐鐮刀菌烯衍生物濃度進行線性回歸，其回歸方程為P幼忍似WLT-3銀2浙私相關系數(shù)戶O.99353(n=5)精密度和回收率試驗-取空白谷類樣品，加入18、30、60ug/kg的DON標準樣品和100、500和1000ug/kg的NIV標準樣品。每個濃度取4個平行樣品，以下按"樣品制備"項處理。根據(jù)線性回歸方程計算其實測濃度，計算每種濃度的實測平均值及相對標準偏差，精密度以相對標準偏差(RSD)表示，(C./C)乂100%即為回收率。表2是D0N的精密度和回收率試驗結果。表3是NIV的精密度和回收率試驗結果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3脫氧雪腐鐮刀菌100400800烯醇加入量(ug/kg)78.776.285.7回收率(%)79.479.281.776.686.285.286.578.487.9RSD%(n=4)5.35.43.0平均回收率(%)80.3080.0085.13(n=4)權利要求1.測定糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的方法，其特征是采用毛細氣相色譜法測定糧食中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，包括下述步驟(1)對糧食類待測樣品預處理；取粉碎過篩的糧食樣品，加石油醚和甲醇-水3∶1溶液，振蕩，靜置，過濾分層后，放出甲醇-水溶液，水浴蒸干，加入甲醇，超聲后，得提取液；(2)加入反應溶劑以及衍生化試劑進行衍生化反應；取上述甲醇提取液上柱，用石油醚淋洗，洗脫雜質后，用氯仿-甲醇9∶1洗脫毒素，收集氯仿-甲醇液，水浴蒸干；取上述甲醇提取液，45℃氮氣吹干，加入TMS衍生劑作用后，加入乙酸乙酯，搖勻、離心，取樣品進氣相色譜儀分析；(3)采用毛細色譜法測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與雪腐鐮刀菌烯醇衍生物的濃度；(4)換算成糧食類樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及雪腐鐮刀菌烯醇的含量，以衍生物峰面積對脫氧雪腐鐮刀菌烯衍生物濃度進行線性回歸，其回歸方程為Y＝1272.81675X-10.28932，；以衍生物峰面積對雪腐鐮刀菌烯衍生物濃度進行線性回歸，其回歸方程為Y＝2832.04931X-348.28655。2、按權利要求1所述的方法，其特征是步驟1所述的糧食類待測樣品是谷物或豆類樣品。3、按權利要求1所述的方法，其特征是步驟3所述的毛細色譜法的條件為DB-5MS毛細柱，載氣流速1.82.5ml/min;溫度為氣化室300350°C;uECD30035(TC,層析柱250300°C。全文摘要本發(fā)明屬分析化學領域，具體涉及一種測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇在糧食中含量的方法。本發(fā)明采用DB-5MS毛細氣相色譜柱以及微池電子捕獲檢測器，測定谷物以及豆類糧食類樣品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，能明顯提高檢測的靈敏度以及準確度。本發(fā)明方法測定結果準確，能極大地提高工作效率，與現(xiàn)有技術比較，具有回收率高，精密度好，變動系數(shù)小等優(yōu)點。文檔編號G01N30/00GK101226173SQ20071003651公開日2008年7月23日申請日期2007年1月16日優(yōu)先權日2007年1月16日發(fā)明者星李,郭紅衛(wèi),馬易怡申請人:復旦大學