專利名稱：：用于抗體分型的蛋白質(zhì)芯片及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)芯片，尤其涉及一種用于單克隆抗體分型的蛋白質(zhì)芯片及其制備方法和應(yīng)用。技術(shù)背景生物芯片技術(shù)是基于生物大分子(核酸、蛋白質(zhì)等)相互作用的大規(guī)模并行分析方法，已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)展最快的技術(shù)之一。蛋白質(zhì)芯片是檢測蛋白質(zhì)之間相互作用的生物芯片，它是基于抗原和抗體特異性結(jié)合的原理，利用微點陣技術(shù)將多種蛋白質(zhì)結(jié)合在固相基質(zhì)上，從而使傳統(tǒng)的生物學(xué)分析手段能夠在極小的范圍內(nèi)快速完成，達(dá)到一次實驗同時分析多個生物標(biāo)本或檢測多種指標(biāo)的目的。隨著制備和檢測技術(shù)的曰趨成熟，蛋白質(zhì)芯片己經(jīng)成為生物、醫(yī)學(xué)研究中的重要技術(shù)平臺。微孔板蛋白質(zhì)芯片是將數(shù)量相對較少，經(jīng)過高度純化，具有相關(guān)生理作用的功能蛋白質(zhì)固定于一個反應(yīng)倉中，研究蛋白質(zhì)與其他生物分子的相互作用?？贵w尤其是單克隆抗體，在有關(guān)蛋白質(zhì)的功能研究、免疫學(xué)研究和藥物靶點的發(fā)現(xiàn)以及抗體藥物的研制方面有極其重要的應(yīng)用。人類蛋白質(zhì)組計劃最重要的工作之一就是要進(jìn)行人類所有蛋白質(zhì)的識別，進(jìn)行蛋白質(zhì)的測序是一個重要的技術(shù)方案，而另外一個非常有效的方案是建立在經(jīng)典的抗體識別的基礎(chǔ)上的，即建立高覆蓋的抗體組，來識別所有的人類表達(dá)蛋白?？贵w藥物是以細(xì)胞工程技術(shù)和基因工程技術(shù)為主體的抗體工程技術(shù)制備的藥物。由于其特異性高，性質(zhì)均一，可針對特定靶點制備，抗體藥物應(yīng)用于各種疾病治療、特別是腫瘤治療的前景備受關(guān)注。美國食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)了17種治療性抗體，其中8種抗體類藥物用于腫瘤治療(SternM，HerrmannR，Overviewofmonoclonalantibodiesincancertherapy:presentandpromise，CriticalReviewsinOncologyHematology,2005，54(1):11-29)。因此，高通量抗體制備技術(shù)體系的建立對于蛋白質(zhì)組研究和抗體藥物的開發(fā)起著推動的作用。目前主要有三種高通量抗體制備技術(shù)即雜交瘤技術(shù)，工程抗體技術(shù)和人記憶B細(xì)胞分選技術(shù)(TraggiaiE，BeckerS，SubbaraoK，etal.，AnefficientmethodtomakehumanmonoclonalantibodiesfrommemoryBcells:potentneutralizationofSARScoronavirus，NatMed，2004，10(8):871-5)。各種高通量技術(shù)制備的單克隆抗體都需要進(jìn)行相關(guān)亞型的分型檢測，普遍使用的方法為ELISA方法，但是ELISA檢測工作量大，試劑與樣品需求多。在高通量的進(jìn)行抗體制備中，需要一種快速、靈敏的方法進(jìn)行單克隆抗體的分型。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于抗體分型的蛋白質(zhì)芯片，在正確進(jìn)行單克隆抗體分型的同時，能減少試劑與樣品用量，提高檢測效率。為此，本發(fā)明還要提供該蛋白質(zhì)芯片的制備方法和應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種用于抗體分型的蛋白質(zhì)芯片，包括基片和固定于該基片上的蛋白質(zhì)，所述固定于基片上的蛋白質(zhì)為分型用抗體，該分型用抗體識別包括IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM的抗體亞型。所述分型用抗體的濃度可由抗體濃度梯度芯片確定。所述基片選材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于抗體分型的蛋白質(zhì)芯片的制備方法，包括如下步驟(1)構(gòu)建分型用抗體濃度梯度芯片，并利用該濃度梯度芯片確定合適的分型用抗體濃度；(2)常規(guī)清潔處理固體基片，并將基片表面進(jìn)行活化使其具有吸附蛋白的活性；(3)用芯片點樣儀將分型用抗體按步驟(1)確定的合適濃度點制在基片上；(4)37。C干燥后，04匸保存待用。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種應(yīng)用上述蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行抗體分型的方法，包括如下步驟(1)選取上述的蛋白質(zhì)芯片；(2)在適于與所選芯片上的分型用抗體進(jìn)行相互作用的條件下，加入待測樣品，并使其反應(yīng)足夠時間；(3)洗去未與分型用抗體結(jié)合的樣品后，加入經(jīng)標(biāo)記的抗體，并使其在合適的條件下反應(yīng)足夠時間，所述標(biāo)記抗體可與結(jié)合在分型用抗體上的樣品進(jìn)行特異性結(jié)合；(4)洗去未與樣品特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體；(5)檢測雜交結(jié)果，以確定待測樣品的抗體亞型。其中，步驟(3)所述的標(biāo)記抗體釆用的標(biāo)記物包括熒光素、生物素、放射性元素和酶。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于抗體分型的試劑盒，包括(1)本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片；(2)酶標(biāo)抗體；(3)底物顯色液；(4)用于稀釋待測樣品的稀釋液；(5)蛋白質(zhì)芯片的洗滌液；(6)分型用抗體的標(biāo)準(zhǔn)品。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述蛋白質(zhì)芯片在制備抗體藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的用于抗體分型的蛋白質(zhì)芯片，能快速、簡便、正確地對單克隆抗體進(jìn)行分型鑒定，每種待檢測單克隆抗體僅需要使用芯片上的2孔就可進(jìn)行鑒定，待檢測樣品僅需0.5-10ul;而ELISA實驗中，每種待檢測單克隆抗體需要96孔板包被12孔進(jìn)行鑒定，待檢測樣品需要1.2ml。無論是待檢測單克隆抗體的用量還是檢測試劑、顯色試劑的用量，與ELISA實驗比較，本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片檢測的用量都大大減少，降低了成本，提高了工作效率。下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是本發(fā)明的分型用抗體濃度梯度芯片的設(shè)計示意圖；圖2是本發(fā)明的使用IgM濃度梯度芯片確定分型抗體濃度的掃描結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明的用于抗體分型的蛋白質(zhì)芯片的設(shè)計示意圖；圖4是本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行抗體分型的檢測結(jié)果圖。具體實施方式本發(fā)明用于抗體分型的蛋白質(zhì)芯片的基本原理為酶聯(lián)免疫吸附實驗,該蛋白質(zhì)芯片包括識別IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM六種抗體亞型的抗體。實施例1分型用抗體濃度梯度芯片設(shè)計及最佳抗體濃度的篩選單克隆抗體分型用抗體試劑盒IS0-2(Sigma)中的6種分型用抗體(分別識別IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM)使用pH7.0，50mMPBS濃度梯度稀釋(1:10，1:40，1:160，1:640，1:2560，1:10240,1:40960)，與陰性質(zhì)控點(pH7.0，50mMPBS)組成3X3的平面陣列式芯片，抗體濃度梯度芯片的設(shè)計示意圖如圖1所示，在圖1中，Al、A2、A3、Bl、B2、B3、Cl為l:10，1:40，1:160，1:640，1:2560，1:10240，1:40960稀釋的分型用抗體，C2、C3為芯片陰性質(zhì)控點。使用構(gòu)建好的分型用抗體濃度梯度芯片，加入梯度稀釋(1:10，1:40，1:160，1:640，1:2560，1:10240)的單克隆抗體細(xì)胞株的培液50ul進(jìn)行檢測，芯片雜交結(jié)果以IgM為例，如圖2所示。芯片實驗結(jié)果如表1所示，在l:IO稀釋度下，所有6種分型抗體均能識別相對應(yīng)的單克隆抗體，而在l:40稀釋度下，IgG2b分型抗體未能識別對應(yīng)的單克隆抗體，后又選擇l:20的稀釋度進(jìn)行檢測，可以正確識別。因此統(tǒng)一選擇1:20稀釋的濃度為構(gòu)建抗體分型芯片的分型抗體試劑濃度，選擇l:100稀釋的單克隆抗體細(xì)胞株的培液50ul進(jìn)行檢測。表l分型用抗體濃度梯度實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例2單克隆抗體分型芯片設(shè)計、其檢測過程及結(jié)果(1)抗體分型芯片設(shè)計將1:20稀釋的6種分型用抗體與陰性質(zhì)控點組成3X3的平面陣列式芯片，芯片設(shè)計示意圖如圖3所示，在圖3中，A2、A3、Bl、B2、B3、Cl分別對應(yīng)l:20稀釋的分型抗體IgGl、IgG2a、IgG2b、IgA、IgM、IgG3，Al、C2、C3為芯片陰性質(zhì)控點。(2)抗體分型芯片制備微孔板按照Millipore的實驗手冊使用70%甲醇進(jìn)行活化，PBS平衡后，使用點樣儀進(jìn)行芯片制備，每種樣品噴點25nl。芯片制備完成后，37"C干燥1小時，04"C保存待用。(3)抗體分型芯片檢測將待檢測樣品按照一定比例使用5%脫脂奶粉稀釋后，直接加入單克隆抗體分型芯片的檢測孔中，每種樣品兩或三復(fù)孔，加入的樣品量為50ul。室溫振蕩孵育l小時后，使用PBST(0.5%Tween20)洗滌芯片3次，加入使用5X脫脂奶粉稀釋的HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的羊抗鼠抗體(1:3000)，室溫振蕩孵育0.5小時后，PBST洗滌3次，每孔加入30ulOPD顯色液(Sigma)顯色，室溫顯色2分鐘后，目測或掃描儀進(jìn)行掃描記錄實驗結(jié)果。(4)檢測結(jié)果對本研究室制備的針對8種蛋白的14株單抗以及2種多抗進(jìn)行芯片鑒定，檢測加入l:100稀釋的單克隆抗體細(xì)胞株的培液50ul進(jìn)行，雜交檢測結(jié)果如圖4和表2所示，其中單抗7種為IgGl型，3種為IgG2a型，3種為IgG2b型(與IgA型有交叉)，l種IgM型(與IgG3型有交叉)；2種多抗均為5種亞型的混合抗體，在圖4中，l為mAb-Ol，2為mAb-09，3為pAb-02。該芯片檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的ELISA檢測結(jié)果完全一致。表2抗體名稱與分型結(jié)果抗體編號蛋白名稱ELISA檢測結(jié)果芯片檢測結(jié)果mAb-01LM02IgG2aIgG2amAb-02BIRC5IgG2b(與IgA有交叉)IgG2b(與IgA有交叉)mAb-03MYCIgGlIgGlmAb-04GNAZIgG2aIgG2amAb-05PLAUIgG2b(與IgA有交叉)IgG2b(與IgA有交叉)mAb-06Paf-AHIgGlIgGlmAb-07Paf-AHIgG2aIgG2amAb-08Paf-AHIgG2b(與IgA有交叉)IgG2b(與IgA有交叉)mAb-09Paf-AHIgM(與IgG3有交叉)IgM(與IgG3有交叉)mAb-lOMLPIgGlIgGlmAb-11MLPIgGlIgGlmAb-12MLPIgGlIgGlmAb-13MLPIgGlIgGlmAb-14MLPIgGlIgGlpAb-OlPECIIgGl，IgG2a,IgG2b，IgM，IgG3IgGl，IgG2a，IgG2b,IgM，IgG3pAb-02MLPIgG]，IgG2a，IgG2b，IgM,IgAIgGl，IgG2a，IgG2b，IgM,IgA本發(fā)明制備的單克隆抗體分型芯片實現(xiàn)了快速直接地進(jìn)行抗體分型，通過一次制備(8小時之內(nèi)可以完成10塊以上96孔3X3的單克隆抗體分型芯片)，可實現(xiàn)對300種單克隆抗體進(jìn)行三重復(fù)的檢測。實驗證明，制備完成的單克隆抗體分型芯片在4'C干燥的環(huán)境保存二個月以后，仍然能夠正確對單克隆抗體進(jìn)行分型鑒定。權(quán)利要求1.一種用于抗體分型的蛋白質(zhì)芯片，包括基片和固定于該基片上的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述固定于基片上的蛋白質(zhì)為分型用抗體，該分型用抗體識別包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IGm的抗體亞型。2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，所述分型用抗體的濃度可由抗體濃度梯度芯片確定。3.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，所述基片選材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。4.一種權(quán)利要求1所述的用于抗體分型的蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)構(gòu)建分型用抗體濃度梯度芯片，并利用該濃度梯度芯片確定合適的分型用抗體濃度；(2)常規(guī)清潔處理固體基片，并將基片表面進(jìn)行活化使其具有吸附蛋白的活性；(3)用芯片點樣儀將分型用抗體按步驟(1)確定的合適濃度點制在基片上；(4)37'C干燥后，04。C保存待用。5.—種應(yīng)用權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行抗體分型的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)選取權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)芯片；(2)在適于與所選芯片上的分型用抗體進(jìn)行相互作用的條件下，加入待測樣品，并使其反應(yīng)足夠時間；(3)洗去未與分型用抗體結(jié)合的樣品后，加入經(jīng)標(biāo)記的抗體，并使其在合適的條件下反應(yīng)足夠時間，所述標(biāo)記抗體可與結(jié)合在分型用抗體上的樣品進(jìn)行特異性結(jié)合；(4)洗去未與樣品特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體；(5)檢測雜交結(jié)果，以確定待測樣品的抗體亞型。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的標(biāo)記抗體采用的標(biāo)記物包括熒光素、生物素、放射性元素和酶。7.—種用于抗體分型的試劑盒，其特征在于，包括(1)權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)芯片；(2)酶標(biāo)抗體；(3)底物顯色液；(4)用于稀釋待測樣品的稀釋液；(5)蛋白質(zhì)芯片的洗滌液；(6)分型用抗體的標(biāo)準(zhǔn)品。8.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片在制備抗體藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)芯片，公開了一種用于抗體分型的蛋白質(zhì)芯片，包括基片和固定于該基片上的蛋白質(zhì)，所述固定于基片上的蛋白質(zhì)為分型用抗體，該分型用抗體識別包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM的抗體亞型。本發(fā)明還公開了一種上述蛋白質(zhì)芯片的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的用于抗體分型的蛋白質(zhì)芯片，能快速、簡便、正確地對單克隆抗體進(jìn)行分型鑒定，且能減少試劑與樣品用量，提高檢測效率。文檔編號G01N33/50GK101236198SQ20071003690公開日2008年8月6日申請日期2007年1月29日優(yōu)先權(quán)日2007年1月29日發(fā)明者賽葉,周佳菁,凱宋,張慶華,彭海林,王升年,肖華勝申請人:上海生物芯片有限公司