專利名稱：截短的可溶性人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)-重組基因工程領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明報(bào)道了經(jīng)采用重組基因工 程與哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的兩種代號(hào)分別為sFLTl(Dl-7)及sKDR(Dl-7)的重組蛋白及 由這兩種蛋白單體構(gòu)成的其異源雙倍體蛋白。這兩種重組蛋白及其異源雙倍體蛋白都為截短 的可溶性的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)受體 (簡(jiǎn)稱VEGF受體)，其共同特征是其各自都僅包含有VEGF受體的第1至第7個(gè)(D1-7)免疫球 蛋白樣結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中的兩種重組蛋白及其異源雙倍體保留有與VEGF高度結(jié)合的生物活性， 可作為中和吸附VEGF的試劑或藥物成分，用于檢測(cè)與分離體內(nèi)外VEGF蛋白及治療各種與血 管過(guò)度增生有關(guān)的疾病。
背景技術(shù)：
血管增生或新生(angiogenesis)是指體內(nèi)的已存在的血管(如毛細(xì)血管和小靜脈)通過(guò) 出芽或分裂的方式而產(chǎn)生新的血管的過(guò)程。血管增生在維持體內(nèi)很多正常生理過(guò)程如胚胎發(fā) 生、女性生殖、傷口愈合以及缺血組織中的新血管形成與修復(fù)等是必要與有益的。但在一些 病理下如在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中血管的增生或新生則是有害無(wú)益的。血管在正常生理或病理下 能夠保持增生與增長(zhǎng)的關(guān)鍵是因?yàn)槠鋬?nèi)襯的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有不斷分裂增生及定向遷移置入 已有的血管管壁的能力。目前已知維持與刺激體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生與遷移功能的最為 重要的活性物質(zhì)是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) (Leung DW等Science 1989，246:1306;Keck PJ等Science, 1989,246:1309)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是通過(guò)與其相應(yīng)的表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體(VEGFR) 相結(jié)合而介導(dǎo)出刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生與遷移的活性。表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF 受體目前已知的主要有三種即VEGFRl (fms-like tyrosine kinase,簡(jiǎn)稱FLT1) (Shibuya M等Oncogene, 1990，5:519; DeVries等Science 1992, 255: 989) ;VEGFR2(Kinase-insert Domain Receptor,簡(jiǎn)稱KDR;在小鼠中稱FLKl)(Terman BI等Biochem Biophys Res Commun 1992， 187: 1579-1586)和VEGFR3 (簡(jiǎn)稱FLT4)。這三種VEGF受體均為含酪氨酸激酶的I型 跨細(xì)胞膜的嵌膜蛋白，各由一含7個(gè)免疫球蛋白樣的拌環(huán)圈(I鵬unoglobuin-like loop, orIg-like loop)結(jié)構(gòu)的胞膜外區(qū)， 一個(gè)橫穿胞膜區(qū)及一包含有2個(gè)酪氨酸激酶的胞膜內(nèi)區(qū)三部 分組成。其中的胞膜外區(qū)是維持VEGF受體與其配體VEGF高度結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)(Davis-Smyth T等EMB0 J， 1996， 15: 4919; Fuh G等J Biol Chem, 1998, 273, 11197)。 VEGF受體在 與其配體結(jié)合后，發(fā)生二聚體化及激活內(nèi)在的酪氨酸激酶，產(chǎn)生酪氨酸殘基自動(dòng)磷酸化和細(xì) 胞內(nèi)信號(hào)蛋白的酪氨酸磷酸化，傳導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)，從而介導(dǎo)出刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂及血管新 生的生物學(xué)效應(yīng)活性。有趣的是，VEGF受體除都與VEGF-A高度結(jié)合之外，還可與其他相關(guān) 配體結(jié)合。如VEGFR1 (即FLT1)可與胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)及VEGF-B相結(jié)合。體內(nèi)的VEGF受體除了上述以膜嵌蛋白的形式表達(dá)在細(xì)胞膜上的之外，還有另一種以可溶 性蛋白形式存在于細(xì)胞外間質(zhì)或體液中。這類可溶性蛋白實(shí)際上就是截短的VEGF受體。截 短的VEGF受體最早的報(bào)道見于可溶性FH-1受體(即sFltl) (Kendall RL及Thomas KA (Kendall RL and Thomas KA Proc Natl Acad Sci USA, 1993， 90: 1070)。這種可溶性 Flt-1受體蛋白僅含有Flt-1受體胞外結(jié)構(gòu)的前6個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)，而不含穿膜區(qū)及膜內(nèi) 如酪氨酸激酶區(qū)。與鑲嵌在膜上完整的受體一樣，這種截短的可溶性VEGF受體保留與VEGF 高度結(jié)合的生物活性。但與鑲嵌在膜上完整的受體不同的是截短的VEGF受體由于其不含 酪氨酸蛋白激酶區(qū)，故在與VEGF結(jié)合后，并不會(huì)傳導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)及或介導(dǎo)出刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞 分裂與增生的活性。截短的VEGF受體因其與鑲嵌在膜上的VEGF受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合VEGF,故反 而具有中和抑制VEGF及其介導(dǎo)的生物學(xué)活性。而實(shí)際上，目前已有多篇關(guān)于以截短的可溶 性受體(如sFltl)作為拮抗劑，成功地封閉VEGF生物學(xué)活性及抑制體內(nèi)腫瘤血管生成的報(bào) 道。如Goldman等在1998年報(bào)道了以腺病毒-多聚賴氨酸復(fù)合物將sFlt-1基因?qū)肽[瘤細(xì) 胞，而成功抑制了腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的種植與生長(zhǎng)(Goldman et al. Proc Natl Acad Sci USA, ，95: 8795 8800)。
又比如在中國(guó)2003年公布的專利號(hào)為02133546. X—發(fā)明專利中(專利發(fā)明名稱持續(xù)釋放兩種新生血管形成抑制因子的微囊物質(zhì)及制備方法。專利發(fā)明人魏于全等；公告日2003.07.23)，就公開了一種經(jīng)藻酸鹽包裹編碼vasostatin和血管內(nèi)皮 細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1/-2基因的遺傳工程細(xì)胞形成微囊化物質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用。該專利 申明其所制備的微囊物質(zhì)皮下植入體內(nèi)后能持續(xù)釋放這兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體而發(fā) 揮抑制新生血管形成的作用，可用于治療多種與血管生成相關(guān)的疾病和多種腫瘤。鑒于截短的可溶性VEGF受體具有高度結(jié)合VEGF及拮抗血管形成的作用，故該類蛋白及 其變體將可用于開發(fā)為抑制血管生長(zhǎng)的拮抗劑藥物，用于干預(yù)治療包括如惡性腫瘤在內(nèi)的各 種與血管增生相關(guān)的疾病。但是，由于正常人體內(nèi)的編碼可溶性VEGF受體的基因及其蛋白 質(zhì)的表達(dá)水平都很低，故很難從體內(nèi)或體液中直接提取與分離到足夠量的可作藥物之用的可溶性VEGF受體蛋白。解究這一問(wèn)題的理想方案是采用現(xiàn)代重組基因工程技術(shù)在體外高效表 達(dá)與生產(chǎn)截短的可溶性VEGF受體。近來(lái)已有個(gè)別報(bào)道了以重組基因工程技術(shù)在體外表達(dá)生 產(chǎn)重組的可溶性VEGF受體。如安平等2000年發(fā)表的"可溶性VEGF受體Flt-l的基因克隆 及其活性產(chǎn)物在原核中的表達(dá)"(安平，董志偉，壽成超:中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2000 Vol.16 No. 1 P.62-66) —文中就報(bào)道了利用RT-PCR技術(shù)從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增出 Flt-1胞外免疫球蛋白樣1 4區(qū)cDNA片段，再通過(guò)基因重組將該片段克隆于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移 酶(GST)融合蛋白表達(dá)載體PGEX2-T中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得大量穩(wěn)定 表達(dá)的Flt-l-GST融合蛋白。但是，該文報(bào)道生產(chǎn)的可溶性VEGF受體如用于人體內(nèi)治療還 面臨一些問(wèn)題與不足。其問(wèn)題與不足首先在于該方法生產(chǎn)的可溶性VEGF受體是一種含有外 源性蛋白(即GST)的融合蛋白，如將其引入人體會(huì)產(chǎn)生人抗GST-融合蛋白抗體等免疫反應(yīng)， 而這種免疫反應(yīng)將極大地限制Flt-l-GST融合蛋白在體內(nèi)治療上的應(yīng)用。此外，該法采用的 是大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖具有如工藝簡(jiǎn)單，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但以這 種系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)如VEGF受體這樣的富含二硫鍵(S—S)及糖基等結(jié)構(gòu)的大分子蛋白，其表達(dá)的 重組蛋白在其結(jié)構(gòu)折疊，構(gòu)像及功能與內(nèi)源性的蛋白一般會(huì)有偏差，故也不太合適。因此， 更為理想的方案是采用其他高級(jí)表達(dá)系統(tǒng)如哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)表達(dá)生產(chǎn)可溶性VEGF受體。但 由于編碼VEGF受體胞膜外區(qū)的基因相對(duì)較長(zhǎng)(其cDNA 〉2kb)，而可用于特異檢測(cè)與分離 VEGF受體蛋白的試劑又很稀乏，故目前除個(gè)別的帶有如免疫球蛋白-Fc段或堿性磷酸酶等外 來(lái)標(biāo)簽(tag)的VEGF受體融合蛋白已成功表達(dá)分離之外，僅含有人VEGF受體胞膜外區(qū)的全 部7個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)而又不帶其他標(biāo)簽物(tag)的重組蛋白還鮮見有報(bào)道。本發(fā)明在此報(bào)道了經(jīng)采用重組基因工程與哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)生產(chǎn)的兩種代號(hào)分別 為sFLTl(Dl-7)及sKDR(Dl-7)的重組蛋白。這2種重組蛋白的結(jié)構(gòu)特征在于它們是不帶其他 任何標(biāo)簽(tag)成分的截短的可溶性的人VEGF受體。其中的重組蛋白sFLTl(D1-7)為截短 的人VEGF受體-1 (即FLT1)，僅含有FLT1膜外區(qū)的第l至第7個(gè)(Dl-7)免疫球蛋白樣區(qū)；而 重組蛋白sFLTl (Dl-7)為截短的人VEGF受體-2(即KDR)，僅含有KDR膜外區(qū)的第1至第7個(gè) (Dl-7)免疫球蛋白樣區(qū)。本發(fā)明還報(bào)道了制備sFLTl(D1-7)蛋白及sKDR(D1-7)蛋白的方法。其制備步驟包括1) 以反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)從經(jīng)VEGF激活的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中擴(kuò)增出FLT1或 KDR胞外免疫球蛋白樣1 7區(qū)cDNA片段；2)通過(guò)基因重組將該片段克隆于真核細(xì)胞表達(dá)載 體中；3)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)重組蛋白并收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液；4)將收集 的含重組蛋白sFLTl(D卜7)或重組蛋白sKDR(Dl-7)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液上樣至含VEGF為配體的親和層析柱中；5)親和層析柱經(jīng)PBS洗滌后，再以0. 2 M的甘氨酸(glycine, pH為2. 0至 3.0間)洗脫親和層析柱并同時(shí)收集從該親和層析柱上洗脫下來(lái)的蛋白，即獲得sFLTl (Dl-7) 或sKDR(Dl-7)蛋白。本發(fā)明的重組蛋白sFLTl(D1-7), sKDR(Dl-7)及由這兩種蛋白單體構(gòu)成的其異源雙倍體 蛋白保留有與VEGF高度結(jié)合的生物活性。這幾種重組蛋白，可作為中和吸附VEGF的試劑或 藥物成分，以單個(gè)獨(dú)立或組合在一起使用的方式，廣泛用于體內(nèi)外檢測(cè)與分離VEGF蛋白及用 于抑制VEGF介導(dǎo)的血管增生或新生。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明內(nèi)容之一是報(bào)道了兩種重組的可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體蛋白及其制備方 法。這兩種重組的可溶性蛋白的代號(hào)及其結(jié)構(gòu)特征如下l)重組蛋白l，代號(hào)為sFLTl(D1-7)， 是一截短的人VEGF受體-1 (Fit-1)，僅含該受體的胞膜外結(jié)構(gòu)中的第1至第7免疫球蛋白樣 胞區(qū)。2)重組蛋白2，代號(hào)為sKDR(D1-7)，是一截短的人VEGF受體(KDR)，僅含該受體的 胞膜外結(jié)構(gòu)中的第l至第7免疫球蛋白樣區(qū)。sFLTl(D1-7)及sKDR(D1-7)都為不含有酪氨酸 蛋白激酶區(qū)的截短的可溶性VEGF受體，但都保留有與VEGF高度結(jié)合的生物活性。制備本發(fā)明中的可溶性蛋白sFLTl(Dl-7)及sKDR(Dl-7)步驟包括1)以反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈 式多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)從經(jīng)VEGF激活的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中擴(kuò)增出FLT1或KDR胞外 免疫球蛋白樣l 7區(qū)cDNA片段；2)通過(guò)基因重組將該片段克隆于真核細(xì)胞表達(dá)載體中；3) 將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)重組蛋白并收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；4)將收集的細(xì)胞培養(yǎng) 上清上樣至含VEGF為配體的親和柱中分離獲得化的重組蛋白。本發(fā)明的另一大內(nèi)容是提供了sFLTl(Dl-7)及sKDR(Dl-7)蛋白的用途。這2種蛋白由于 保留有與VEGF高度結(jié)合的生物活性而又不含酪氨酸蛋白激酶區(qū)，故在與VEGF結(jié)合后，不會(huì) 介導(dǎo)出剌激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂及血管新生的活性。相反的，sFLTl(D1-7)及sKDR(D1-7)蛋 白如引入體內(nèi)或細(xì)胞中，則可通過(guò)其與鑲嵌在膜上的VEGF受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合VEGF，而達(dá)到中和 抑制VEGF及其介導(dǎo)血管增生的效果。作為可中和吸附VEGF的可溶性蛋白質(zhì)，本發(fā)明的 sFLTl(D1-7)與sKDR(D1-7)至少具有以下幾種用途如1)作為試劑成分，用于檢測(cè)體內(nèi)外 VEGF的表達(dá)水平；2)作為分離劑，用于體內(nèi)外分離吸附VEGF分子及VEGF分泌表達(dá)陽(yáng)性的 細(xì)胞與組織；3)作為藥物成分，用于干預(yù)抑制VEGF介導(dǎo)的血管增生及治療如包括多種腫瘤 在的與血管生成相關(guān)的疾病。本發(fā)明中的sFLTl(Dl-7)及sKDR(Dl-7)重組蛋白及其異源雙倍體蛋白的一大特征在于這 三種蛋白，在作為抗VEGF或抗血管增生的藥物使用時(shí)，既可單個(gè)的獨(dú)立使用，也可幾種組合 在一起使用。重組蛋白sFLTl (Dl-7)除與VEGF-A高度結(jié)合之外，還可與PIGF及VEGF-B結(jié) 合；而重組蛋白sKDR(Dl-7)除與VEGF-A高度結(jié)合之外，還可與VEGF-C及VEGF-D結(jié)合。 因此，與使用單一的重組蛋白相比，將sFLTl(Dl-7)及sKDR(D1-7)蛋白組合在一起使用，將 可取到更為徹底地中和與清除VEGF及其他血管增生因子的作用，在抗血管增生治療上也可望 獲得更好的療效。此外，由于本發(fā)明中的sFLTl(D1-7)， sKDR(Dl-7)及其異源雙倍體蛋白是不帶任何其他 外來(lái)標(biāo)簽(tag)的人源化的重組蛋白，故其如用作藥物，在引入人體后一般不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)該 重組蛋白的抗體等免疫反應(yīng)，可長(zhǎng)期反復(fù)使用。本發(fā)明的具體內(nèi)容如下1.編碼可溶性蛋白sFLTl(Dl-7)與sKDR(Dl-7)基因的克隆擴(kuò)增及其表達(dá)載體的構(gòu)建。本發(fā)明中的sFLTl(D1-7)與sKDR(Dl-7)的編碼基因的克隆擴(kuò)增及其表達(dá)載體的構(gòu)建可分 為兩部分1)克隆擴(kuò)增出FLT1或KDR的胞膜外結(jié)構(gòu)中的第1至第7免疫球蛋白樣區(qū)(Dl-7) cDNA基因片段，2)將克隆擴(kuò)增的基因片段定向插入到表達(dá)載體，獲得含編碼sFLTl(Dl-7) 或sKDR(D1-7)基因的重組載體?；虻目寺U(kuò)增及其表達(dá)載體的構(gòu)建的具體技術(shù)與操作方法 可參見《分子克隆》等書。鑒于sFLTl(Dl-7)與sKDR(D1-7)蛋白具有分子量大，含二硫鍵(S—S) 及糖基等結(jié)構(gòu),其表達(dá)以在真核細(xì)胞中的分泌性表達(dá)最為理想。保證重組蛋白在真核細(xì)胞分泌性表達(dá)的一大關(guān)鍵因素是需要一段信號(hào)肽(signal p印tide)以引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)穿透過(guò)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并最終分泌到細(xì)胞外間質(zhì)。編碼該信號(hào) 肽的基因可來(lái)自于VEGF受體基因，或其他外源基因如IL-2等基因。編碼本發(fā)明中的sFLTl(Dl-7)蛋白的cDNA片段采用RT-PCR方法從經(jīng)VEGF激活的健康人 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells ,HUVEC)中克隆擴(kuò)增獲得。用 于PCR的上、下游引物可參照已報(bào)道的Flt-1核苷序列體外合成。同理，編碼本發(fā)明中的sKDR(Dl-7)蛋白的cDNA片段也采用RT-PCR方法從VEGF激活的 HUVEC中克隆擴(kuò)增獲得。用于PCR的上、下游引物可參照己報(bào)道的KDR核苷序列體外合成。2.可溶性蛋白sFLTl(D1-7)與sKDR(Dl-7)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)生產(chǎn)可溶性蛋白sFLTl(Dl-7)與sKDR(Dl-7)的表達(dá)生產(chǎn)以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中為理想。常用的 哺乳動(dòng)物細(xì)胞有CHO, C0S-7, Hela， HEK-293等。有兩種主要方式即瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 可將含sFLTl(Dl-7)或sKDR(D1-7)基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CH0細(xì)胞)。穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞因可進(jìn)一步用于篩選與擴(kuò)增高表達(dá)細(xì)胞株。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的方法包磷酸鈣法；陽(yáng) 離子脂質(zhì)體法；病毒介導(dǎo)法及電穿孔法等。sFLTl(Dl-7)與sKDR(Dl-7)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞里的表達(dá)可以用免疫組化方法進(jìn)行檢測(cè)；也可以通 過(guò)免疫印跡試驗(yàn)及ELISA方法定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的蛋白。經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)該重 組蛋白后，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則轉(zhuǎn)入含篩選藥物如G418的培養(yǎng)液中進(jìn)行篩選。篩選出的表達(dá)細(xì)胞株 再擴(kuò)增培養(yǎng)，并收集其培養(yǎng)上清液。收集的培養(yǎng)液再用于分離提取重組蛋白。3.可溶性蛋白sFLTl(D1-7)與sKDR(D1-7)的分離提取及其理化活性鑒定可溶性蛋白sFLTl(Dl-7)與sKDR(Dl-7)可用親和層析柱法從收集的細(xì)胞培養(yǎng)液中分離提 取。可用于分離提取該蛋白的親和層析柱有VEGF-或抗FLT1或抗KDR抗體親和層析柱。如 以VEGF親和層析柱分離提取sFLTl (Dl-7)或sKDR(D1-7)重組蛋白為列，其操作步驟如下取 收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)離心及以0.45 ym濾膜過(guò)濾后，將濾液上樣置于親合層析柱， sFLTl (D卜7)或sKDR (D1-7)重組蛋白因其與親合層析柱上的VEGF發(fā)生非共價(jià)的耦聯(lián)而被特異 吸附于親合層吸柱中。層吸柱先以PBS洗脫去除雜蛋白，再以低pH液(如pH 2. 7， 0. 1M甘 氨酸)洗脫被吸附的蛋白。再經(jīng)調(diào)節(jié)pH至7.0及對(duì)PBS透析后即獲得純化的sFLTl(D1-7)或 或sKDR(Dl-7)蛋白。分離提取的蛋白可以用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE),結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色或免疫印跡試驗(yàn)及ELISA等方法加以鑒定。4.可溶性蛋白sFLTl(Dl-7)與sKDR(Dl-7)的生物活性鑒定本發(fā)明的可溶性蛋白sFLTl (D1-7)與sKDR(Dl-7)的一大特征是它們都保持有與VEGF的結(jié) 合的生物活性。 一種鑒定sFLTl(Dl-7)或sKDR(Dl-7)蛋白與VEGF結(jié)合的方法如下先以含 VEGF基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CH0細(xì)胞，24-48 h后，轉(zhuǎn)染的CH0細(xì)胞經(jīng)lx PBS 液漂洗及以固定后，分別加入含sFLTl(Dl-7)或與sKDR(Dl-7)蛋白或?qū)φ盏鞍祝?5° C孵育 1-2 h，以PBS液洗脫，再加入抗FLT1或抗KDR抗5° C孵育1-2 h，以PBS液洗脫；再加入 酶標(biāo)記的抗人Ig抗體，25° C孵育卜2h，再以PBS液洗脫，然后加入顯色液，室溫至顯色， 于顯微鏡下觀察顯色結(jié)果。如加入sFLTl(Dl-7)或與sKDR(Dl-7)蛋白的孔有顯色陽(yáng)性的細(xì) 胞，而加入對(duì)照蛋白的孔里細(xì)胞無(wú)顯色，則證明sFLTl(Dl-7)或與sKDR(Dl-7)蛋白保持有與 VEGF相特異結(jié)合的生物活性。此外，可溶性蛋白sFLTl (Dl-7)或sKDR(Dl-7)與VEGF的特異結(jié)合還可通過(guò)與'25 I標(biāo)記 的VEGF或biotin標(biāo)記的VEGF結(jié)合的實(shí)驗(yàn)而測(cè)定。如以biotin標(biāo)記的VEGF為例先用 sFLTl(Dl-7)或sKDR(D1-7)蛋白包被96孔ELISA板，4"C過(guò)夜，經(jīng)lx PBS液漂洗及2% BSA 液室溫封閉1 2h后，分別加入同濃度biotin-標(biāo)記的VEGF在4° C孵育1-2 h，經(jīng)PBS液 洗脫后，再加入辣根過(guò)氧化物酶(服P)標(biāo)記的Avidin， 4° C孵育l -2 h， PBS液洗脫后， 加入顯色液，室溫至顯色，再以酶聯(lián)免疫儀測(cè)定特定波長(zhǎng)處各孔的吸光值。根據(jù)0D值可測(cè) 定被96孔板上sFLTl(D1-7)或sKDR(Dl-7)蛋白吸附的VEGF量，進(jìn)而推測(cè)出sFLTl(D1-7)或 sKDR(D1-7)與VEGF結(jié)合的強(qiáng)度。本發(fā)明的可溶性蛋白sFLTl(Dl-7)與sKDR(Dl-7)的另一大特征是其可與鑲嵌在膜上的 VEGF受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合VEGF，而達(dá)到中和抑制VEGF介導(dǎo)的促血管增生的效果。 一種體外鑒定與 檢測(cè)sFLTl (D1-7)或sKDR(D1-7)中和抑制由VEGF介導(dǎo)的血管增生的方法如下從健康人外周 血單核細(xì)胞(PBMCs)中提取血管內(nèi)皮細(xì)胞或人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，置于含有重組人VEGF 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，再將待檢測(cè)的sFLTl(Dl-7)或sKDR(D1-7)蛋白按不同劑量(如高、中、 低劑量)分別加入到血管內(nèi)皮細(xì)胞或HUVEC培養(yǎng)中，并以加入抗人VEGF的單抗如avastin為 陽(yáng)性對(duì)照組，以加入正常的白蛋白為陰性對(duì)照組，37° C孵育2-3天后，在顯微鏡下或應(yīng)用 流式細(xì)胞儀觀察血管皮細(xì)胞增殖與凋亡的情況。將sFLTl(Dl-7)或sKDR(D1-7)蛋白檢測(cè)組 的結(jié)果與抗人VEGF的單抗陽(yáng)性對(duì)照組及正常白蛋白陰性對(duì)照組的結(jié)果相比，則可判斷 sFLTl(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白拮抗VEGF介導(dǎo)的促血管細(xì)胞增生的能力。根據(jù)該類體外細(xì) 胞水平的測(cè)試結(jié)果可初步推斷sFLTl(Dl-7)或sKDR(Dl-7)蛋白用于體內(nèi)拮抗抑制VEGF的可能程度。5.可溶性蛋白sFLTl(D1-7)與sKDR(D1-7)的用途本發(fā)明的另一大內(nèi)容則是提供了可溶性蛋白sFLTl(D1-7)及sKDR(D1-7)的用途。這2種 蛋白由于保留有與VEGF高度結(jié)合的生物活性而又不含酪氨酸蛋白激酶區(qū)，故在與VEGF結(jié)合 后，不會(huì)介導(dǎo)出刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂及血管新生的活性。相反的，sFLTl (Dl-7)及sKDR(D卜7) 可通過(guò)其與鑲嵌在膜上的VEGF受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合兩者的共同配體VEGF，而起到中和抑制VEGF介 導(dǎo)的促血管增生的效用。本發(fā)明的可溶性蛋白sFLTl(D1-7)與sKDR(D1-7)至少具有以下幾種 用途，如l)作為試劑成分，用于檢測(cè)體內(nèi)外VEGF的表達(dá)水平；2)作為分離劑，用于體內(nèi) 外分離吸附VEGF分子及VEGF分泌表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞與組織；3)作為藥物成分，用于千預(yù)抑 制VEGF介導(dǎo)的血管增生及治療如包括多種腫瘤在的與血管生成相關(guān)的疾病。有關(guān) sFLTl (D1-7)或sKDR (D1-7)蛋白的這幾項(xiàng)用途更具體地描述如下5. 1.可溶性蛋白sFLTl(D1-7)或sKDR(Dl-7)作為試劑用于檢測(cè)體內(nèi)外VEGF的表達(dá)水平本發(fā)明的sFLTl(Dl-7)或sKDR(D1-7)蛋白可作為試劑成分用于檢測(cè)體內(nèi)外的VEGF表達(dá)水 平。被檢測(cè)的VEGF分子包括存在于體液(如血清、血漿、唾液等)、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中流離 的可溶性分子及表達(dá)于細(xì)胞/組織膜上的蛋白。作為檢測(cè)試劑，sFLTl(Dl-7)或sKDR(D1-7)蛋白可有標(biāo)記處理的及未標(biāo)記處理的兩種主 要形式。可用于標(biāo)記sFLTl(Dl-7)或sKDR(Dl-7)蛋白的標(biāo)記物包括各種酶(如辣根過(guò)氧化物 酶，堿性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，微過(guò)氧化物酶)；熒光素(異硫氰酸熒光素，F(xiàn)ITC);生物 素-抗生物素及膠體金等。作為試劑，經(jīng)標(biāo)記的FLT1(D1-7)或sKDR(Dl-7)蛋白，可直接用于 免疫酶組化、免疫熒光或免疫印跡等試驗(yàn)來(lái)體內(nèi)外檢測(cè)VEGF分子的表達(dá)水平。未標(biāo)記處理的sFLTl(Dl-7)或sKDR(D1-7)蛋白也可與已標(biāo)記的其他試劑一起合并作為試 劑盒成分，用于檢測(cè)VEGF分子。試劑盒中標(biāo)記的其他試劑可包括酶標(biāo)或熒光標(biāo)記的鼠抗人 VEGF抗體，酶標(biāo)或熒光標(biāo)記的抗鼠免疫球蛋白抗體，酶標(biāo)或熒光標(biāo)記的protein-A/protein-G 蛋白，等。如以未標(biāo)記的sFLTl(Dl-7)或sKDR(Dl-7)蛋白與酶標(biāo)記的鼠抗人VEGF抗體合并 組成試劑盒，用夾心ELISA法來(lái)檢測(cè)體液(如血清、細(xì)胞懸液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液)中的VEGF 的表達(dá)水平為例，其檢測(cè)步驟如下先用未標(biāo)記處理的sFLTl(D1-7)或sKDR(Dl-7)蛋白包被 96-孔ELISA板，4'C過(guò)夜，經(jīng)lx PBS液漂洗及2% BSA液室溫封閉1 2h后，分別加入待檢的樣品如血清，37° C孵育l-2h，經(jīng)PBS液洗脫后，再加入酶標(biāo)記的鼠抗人VEGF抗體，37° C 孵育1 -2 h， PBS液洗脫后，加入顯色液，室溫至顯色，再以酶聯(lián)免疫儀測(cè)定特定波長(zhǎng)處各 孔的吸光值。根據(jù)0D值并與VEGF正常參照物相比較，可估測(cè)待檢樣品中的VEGF水平。5. 2.可溶性蛋白sFLTl(D1-7)或sKDR(D1-7)用于吸附及分離VEGF表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞與組織sFLTl(D1-7)或sKDR(D1-7)還可用于體內(nèi)外吸附與分離VEGF表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞與組織。如 用sFLTl (D1-7)蛋白體外吸附分離VEGF表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞與組織為例，可先將sFLTl (D1-7)蛋 白吸附在適當(dāng)?shù)墓滔噍d體上(固相載體包括如細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)皿，硝酸纖維素膜等)， 再加入含VEGF表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞或組織，4° C孵育卜2h，再以lxPBS液洗脫，即達(dá)到吸附 與分離VEGF表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞或組織成分的目的。5.3.可溶性蛋白sFLTl(D1-7)及sKDR(Dl-7)作為藥物成分，用于抑制VEGF介導(dǎo)的血管增生 及治療包括腫瘤在內(nèi)的與血管生成相關(guān)的疾病本發(fā)明的sFLTl(Dl-7)或sKDR(Dl-7)蛋白質(zhì)可作為新型實(shí)驗(yàn)性治療藥物的主要成分，用 于抑制VEGF介導(dǎo)的血管增生及治療包括腫瘤在內(nèi)的與血管生成相關(guān)的疾病。作為治療藥物 成分的sFLTl(D1-7)或sKDR(Dl-7)蛋白質(zhì)可以凍干或液態(tài)的形式保純。凍干或液態(tài)保純的 sFLTl(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白在使用時(shí)再以生理鹽水或PBS稀釋。稀釋的sFLTl(D1-7)或 sKDR(Dl-7)蛋白的給藥途徑可包括經(jīng)皮下，或靜脈注射等。作為實(shí)驗(yàn)性治療藥物，sFLTl (Dl-7) 或sKDR(Dl-7)蛋白質(zhì)的藥理藥效的測(cè)試先是在種植了人腫瘤的裸鼠體內(nèi)進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn) 是測(cè)試FLT1 (Dl-7)或sKDR (Dl-7)在體內(nèi)的抗腫瘤血管增生及抗腫瘤生成的療藥。目前已有多 個(gè)不同的人腫瘤在裸鼠種植生長(zhǎng)的模型可用于進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。在此如以異體種植生長(zhǎng)了人肉瘤 移植腫瘤的模型來(lái)實(shí)驗(yàn)測(cè)試sFLTl(D1-7)或sKDR(Dl-7)的抗腫瘤血管新生及抗腫瘤生長(zhǎng)的藥 效為列，其方法是裸鼠經(jīng)皮下和腹腔種植人腫瘤(S-180肉瘤)，7天后分組，每組的小鼠 分別注射不同劑量的sFLTl(D1-7)， sKDR(Dl-7)，陽(yáng)性對(duì)照蛋白質(zhì)(avast in,—種抗人VEGF 的單抗)或陰性對(duì)照蛋白質(zhì)，治療連續(xù)7-30天。其間記錄觀察種植的腫瘤生長(zhǎng)及種植組小鼠 的活情況。30天后處死小鼠，剝離腫瘤，稱重，并采用免疫組織化學(xué)對(duì)腫瘤組織及其血管進(jìn) 行分析及計(jì)算每組平均瘤重和抑瘤率及治療制劑對(duì)小鼠壽命的影響。如實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示注射了 sFLTl (Dl-7)或sKDR (Dl-7)蛋白質(zhì)的小鼠體內(nèi)腫瘤及其腫瘤組織中血管的生長(zhǎng)被抑制，sFLTl (Dl-7)或sKDR(Dl-7)蛋白則可望進(jìn)一步開發(fā)成為可用于臨床上治療包括腫瘤在內(nèi)的多 種與血管生成相關(guān)疾病的藥物。在作為抗VEGF或抗血管增生的藥物成分時(shí)，本發(fā)明的sFLTl(Dl-7)與sKDR(Dl-7)蛋白， 既可單個(gè)的獨(dú)立使用，也可幾種組合在一起使用，以發(fā)揮最大藥效作用。鑒于重組蛋白 sFLTl (Dl-7)除與VEGF-A高度結(jié)合之外，還可與PIGF及VEGF-B結(jié)合；而重組蛋白sKDR (Dl-7) 除與VEGF-A高度相結(jié)合之外，還可與VEGF-C及VEGF-D相結(jié)合；因此，如果將sFLTl (Dl-7) 及sKDR(Dl-7)這兩種蛋白組合在一起使用，應(yīng)可取到更為徹底地中和與清除VEGF及其他血 管增生因子的作用。sFLTl(D1-7)及sKDR(Dl-7)這兩種蛋白的組合使用也可望在未來(lái)的抗血 管增生臨床治療上獲得更好的療效。


圖l.為可溶性sFLTl(Dl-7)蛋白單體及可溶性sKDR(Dl-7)蛋白單體的結(jié)構(gòu)示意圖.其中的Dl ， D2， D3, D4, D5, D6及D7分別代表VEGF受體-l(FLT-l)或VEGF受體-2(KDR) 的胞膜外結(jié)構(gòu)區(qū)，SP為信號(hào)肽(signal peptide)。圖2.含sFLTl(Dl-7)與sKDR(Dl-7)的異源雙倍體蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3.為以SDS—PAGE結(jié)合免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)分析分離提純的sFLTl (Dl-7)蛋白。本發(fā)明具體實(shí)施方式
實(shí)施例一編碼sFLTl (Dl-7)或sKDR(D1-7)基因的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明中的sFltlD (1-7)蛋白和sKDRD (1_7)蛋白的單體結(jié)構(gòu)如圖1所示。這兩種蛋 白都為截短的可溶性的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)受體；其中sFLTl(D1-7)為截短的VEGF受體_1 (即FLTl)，僅含有FLTl膜外區(qū)的第1 至第7個(gè)(Dl-7)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)；而sFLTl(Dl-7)為截短的VEGF受體-2(即KDR),僅含有KDR膜外區(qū)的第1至第7個(gè)(D1-7)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)。 編碼這兩種蛋白的基因克隆及其達(dá)載體的構(gòu)建如下-1.編碼人類FLT1 (D1-7)基因片段的克隆。編碼人sFLTl(D1-7)FLT1的基因片段采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT — PCR)方法從經(jīng) VEGF激活的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中克隆獲得。其具體實(shí)施如下以Trizol按常規(guī)方法 從HUVEC細(xì)胞中提取總RNA;再取1 u g總RNA，加入到逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)液里(總體積為20 y ， 包括5Xbuffer 4pL、 Oligo(dT)引物2 pL及10咖ol/L dNTP 8 RNasin 1 fiL，反轉(zhuǎn)錄酶5U 10U)， 經(jīng)70。C變性10分鐘，42°C 1小時(shí)，42°C 30分鐘，70°C 15分鐘，逆轉(zhuǎn) 錄反應(yīng)終止，合成得到cDNA。再以PCR擴(kuò)增人sFltl (Dl-7)基因片段。用于PCR擴(kuò)增的引 物為上游弓l物1- FUTl-NcoATG: gcgaagcttgagacc atg gtc agc tac tgg 下游弓l物2. FLT1-TAG-BH: gcgggatcc cta cac aga gcc ctt ctg gtt ggPCR擴(kuò)增用的Taq酶購(gòu)自大連TAKARA生物公司。PCR的反應(yīng)總體積為50 pl。 PCR的反應(yīng)條件 為94°C預(yù)變性2 min后，然后94°C變性40 s， 55°C退火40 s， 72°C延伸120 s， 35 個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)72°C延伸5 niin。
PCR擴(kuò)增后獲得2. 0 kb的DNA片段PCR產(chǎn)物純化及酶切取PCR產(chǎn)物 (2. 0 kb band)用HinD III和BamH I酶切，反應(yīng) 完畢后，經(jīng)l %瓊脂糖電泳后，切下酶切擴(kuò)增片段，再經(jīng)回收純化，用20 pl去離子水溶解 后，置-2(TC保存?zhèn)溆谩NA重組連接及轉(zhuǎn)化感受宿主菌采用以T4 DNA連接酶的方法將上述酶切后的DNA與經(jīng) 同樣酶切處理的表達(dá)載體pcDNA3. 1 (Invitrogen) DNA體外相連。連接反應(yīng)體系總體積為 20 pl，在16'C條件下連接16 h。之后，取2 pi連接反應(yīng)物在4。C條件下轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌宿 主菌DH5a (50pl/管)30分鐘。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將感受細(xì)菌接種于LB/agar培養(yǎng)板(含100嗎/ml Amp)， 37r孵育過(guò)夜，再提取重組質(zhì)粒DNA及酶切鑒定后獲得含F(xiàn)ltl (D1-7)基因片段的重 組質(zhì)粒。經(jīng)酶切及核苷酸序列測(cè)序證明所獲得的重組質(zhì)粒含有編碼人FLT1膜外區(qū)的第1至第 7個(gè)(Dl-7)免疫球蛋白樣區(qū)的基因。2.編碼人類KDR(Dl-7)基因片段的克隆。
編碼人KDR的胞外免疫球蛋白區(qū)D1至D7的基因片段也采用RT-PCR方法克隆獲得。PCR 擴(kuò)增用的引物為
上游弓l物1. KDR-ATG-H3: gcgaagcttccatg gag age aag gtg ctg 下游弓l物2. KDR-TAG-BH: gcgggatcccta cac卿gcc ctt ctg gtt
PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50 ^L。 PCR的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性2 min后，然后94°C變 性40 s， 55°C退火40 s， 72°C延伸120 s, 35個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)72°C延伸5 min。 PCR 擴(kuò)增后獲得2.0 kb的DNA片段。
PCR產(chǎn)物純化及酶切取10 ul PCR產(chǎn)物 (2.0 kb)經(jīng)HinD III和BamH I雙酶切后， 于1%瓊脂糖電泳；電泳分離后，切下酶切后的擴(kuò)增片段，再經(jīng)回收純化及，用20^il去離子 水溶解后，置-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> DNA重組連接及轉(zhuǎn)化感受宿主菌:采用以T4 DNA連接酶的方法將上述酶切后的片段與經(jīng)同 樣雙酶切(HinD III和BamH I )處理的表達(dá)載體pcDNA3. 1在16。C條件下連接。16 h后， 取2^1連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌宿主菌DH5a。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將感受細(xì)菌接種于LB/agar 培養(yǎng)板(含100嗎/ml Amp) ， 37'C孵育過(guò)夜。再提取重組質(zhì)粒DNA及酶切鑒定獲得含擴(kuò)增基 因片段的重組質(zhì)粒。經(jīng)酶切及核苷酸序列測(cè)序證明所獲得的重組質(zhì)粒含有編碼人KDR膜外區(qū) 的第1至第7個(gè)(Dl-7)免疫球蛋白樣區(qū)的基因。
實(shí)施例二 sFLTl(Dl-7)或sKDR(D1-7)蛋白的表達(dá)及其檢測(cè)
鑒于本發(fā)明中的sFLTl(Dl-7)或sKDR(D卜7)蛋白具有分子量大，含二硫鍵S—S及糖基， 其表達(dá)以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞為好。在本發(fā)明實(shí)施中，選以sFLTl(Dl-7)蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 的表達(dá)生產(chǎn)為例，本發(fā)明中的sKDR(Dl-7)蛋白的表達(dá)生產(chǎn)應(yīng)與此例大致相同。
sFLTl(Dl-7)或sKDR(D1-7)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)生產(chǎn)包括三大步驟1)將含 sFLTl(D1-7)或sKDR(D1-7)基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CH0細(xì)胞；2)重組基因表達(dá)陽(yáng)性CHO細(xì)胞 的鑒定與高表達(dá)細(xì)胞株的篩選；3) sFLTl(Dl-7)或sKDR(Dl-7)蛋白的分離純化。
轉(zhuǎn)染CH0細(xì)胞可采用fugen6介導(dǎo)的方法。其步驟為取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞，胰酶 /5mM EDTA常規(guī)消化后，以1 X 105細(xì)胞/孔接種6-孔塑料培養(yǎng)板，37° C， 5% C02培養(yǎng)過(guò)夜.第 2天，在IOO ^L無(wú)血清、無(wú)抗生素的DMEM加入6 pL fugen6與不同量的重組質(zhì)粒及陰性對(duì) 照空載體DNA (l-2iig)混勻，制備成fugen6-DNA混合液，室溫放置15 min后，緩慢滴加至CH0細(xì)胞中，于37'C、 5XC02條件下培養(yǎng)培養(yǎng)4-6 h后，加入3 ml DMEM-5% fcs/孔，轉(zhuǎn) 染24h后，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，48h 72h后，收集培養(yǎng)細(xì)胞上清液。
收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液用ELISA方法測(cè)定可溶性sFLTl(Dl-7)或sKDR(D1-7)蛋白。以 ELISA方法測(cè)定sFLTl(Dl-7)蛋白為列，其操作步驟如下用鼠抗人FLT1抗體(clone FB6， 2 嗎/ml， 50 nL /孔)包被96-well ELISA板，4。C過(guò)夜，經(jīng)lx PBS液漂洗及2% BSA (in PBS-O. 1% tween20液)室溫封閉l 2h后，分別加入經(jīng)含sFLTl (Dl-7)基因的質(zhì)?；蚩蛰d體轉(zhuǎn)染的CHO 細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，37° C孵育2h， PBS-O. 1。/。tween20洗板X3，再加入人源化的抗人FLT1 抗體(clone 18F1)， 37° C 2 h， PBS-0. 1% tween 20洗板X3;再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記 的山羊抗人IgG多克隆抗體(抗體購(gòu)自Sigma, 1 : 1000稀釋)，37° C孵育1 h;以PBS-0.1% tween 20洗板X3，然后加入顯色液(鄰苯二胺)-3% H202,室溫10 min， 1 mol/L HCL終止 反應(yīng)，以酶聯(lián)免疫儀測(cè)定以酶標(biāo)儀(Microplate reader 550， Bio-Rad)測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各 孔的吸光值。ELISA檢測(cè)顯示sFLTl(Dl-7)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞上清液結(jié)果為陽(yáng)性，表明 sFLTl(Dl-7)蛋白在CHO細(xì)胞中分泌表達(dá)成功。收集的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清液可用于分離提純 sFLTl(Dl-7)蛋白。
此外，如將含sFLTl(Dl-7)基因的重組質(zhì)粒和含sKDR(D1-7)基因的重組質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染入 細(xì)胞；則轉(zhuǎn)染細(xì)胞中除可分泌表達(dá)sFLTl(Dl-7)蛋白及sKDR(D1-7)蛋白，還可分泌表達(dá)由 sFLTl(Dl-7)蛋白單體及sKDR(Dl-7)蛋白單體構(gòu)成的異源雙倍體蛋白。該異源雙倍體蛋白的 結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。
實(shí)施例三sFLTl(Dl-7)或sKDR(D1-7)蛋白的分離提純及理化生物活性鑒定
在此例中，從收集的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液中分離提純sFLTl(Dl-7)或sKDR(D1-7)蛋白的方法 為親和層析柱法。親和層析柱中的填充物為交聯(lián)上重組人VEGF165蛋白的粒珠(用于交聯(lián)的 粒珠為cyanogen b畫ide activated agarose,購(gòu)自Sigma)。 以該親和層析柱分離提純 sFLTl (Dl-7)的其操作步驟如下取收集含有sFLTl (D1-7)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液100 ml，經(jīng)離心 及以0.45 um濾膜過(guò)濾后，將濾液上樣于親合層析柱上；上樣結(jié)束后，先以10倍于層析 柱體積的lxPBS液洗脫層吸柱，共2-3次，再以1-2 ml 0. 1M的甘氨酸液(pH 2. 0至3. 0) 洗脫被吸附的蛋白，洗脫下的成分再經(jīng)調(diào)節(jié)pH (pH至7. 0—7. 4)及對(duì)lxPBS透析后即獲得 純化的sFLTl (Dl-7)。上述分離提純的FLT1(D1-7)蛋白以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE),結(jié)合免疫印跡試驗(yàn)方法加以鑒定。其操作步驟如下取不同量的 純化的重組sFLTl (Dl-7)上樣于8% SDS-PAGE凝膠，進(jìn)行電泳分離。SDS-PAGE電泳結(jié)束后， 取下凝膠，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜(30 V，4° C， 16 h),再以1% BSA封閉，室溫l 2h后， 加入人源化的抗人FLT1抗體，37° C 2 h， PBS-0. 1% tween 20洗板X3;再加入辣根過(guò)氧化 物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG多克隆抗體(1 : 1000稀釋)，37° C孵育1 h。膜經(jīng)充分漂洗后， 加入顯色液(鄰苯二胺，3%H202)，至顯色條帶出現(xiàn)后，蒸餾水漂洗終止反應(yīng)。如圖》示免 疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示在110 kd附近有主要顯色帶，其位置與推算出的sFLTl(D1-7)單體的分 子量一致。此結(jié)果表明采用該親和層析柱已成功分離及提純到sFLTl(D1-7)蛋白。
權(quán)利要求
1. 兩種經(jīng)采用重組基因工程與哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的代號(hào)分別為sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)的全人源化的重組蛋白。其特征在于1)這兩種重組蛋白都為截短的可溶性的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)受體；其中重組蛋白sFLT1(D1-7)為截短的VEGF受體-1(即FLT1)，僅含有FLT1膜外區(qū)的第1至第7個(gè)(D1-7)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)；而重組蛋白sFLT1(D1-7)為截短的VEGF受體-2(即KDR)，僅含有KDR膜外區(qū)的第1至第7個(gè)(D1-7)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)；2)這兩種重組蛋白都保留有與VEGF高度結(jié)合的生物活性。
2. —種制備權(quán)利要求1所述的sFLTl(Dl-7)蛋白及sKDR(Dl-7)蛋白的方法；其步驟包括1) 以反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)從經(jīng)VEGF激活的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中擴(kuò)增出FLT1或 KDR胞外免疫球蛋白樣1 7區(qū)cDNA片段；2)通過(guò)基因重組將該cDNA片段克隆于真核細(xì)胞 表達(dá)載體中；3)將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)重組蛋白并收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液；4) 將收集的含重組蛋白sFLTl (Dl-7)或重組蛋白sKDR (D1-7)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液上樣至含VEGF為 配體的親和層析柱中；5)親和層析柱經(jīng)1XPBS洗滌后，再以0. 2 M的甘氨酸(glycine, pH為 2.0至3.0間)洗脫親和層析柱并同時(shí)收集從該親和層析柱上洗脫下來(lái)的蛋白，獲得 sFLTl (D1-7)或sKDR (D卜7)蛋白。
3. —種以權(quán)利要求1所述的sFLTl(Dl-7)或sKDR(Dl-7)重組蛋白為主要成分的試劑盒。該試 劑盒可定性或定量檢測(cè)體內(nèi)或體外的VEGF蛋白；其中可被檢測(cè)的VEGF蛋白包括以可溶性物 質(zhì)形式存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清液中或體液(如血清、血漿、唾液等)中的VEGF及其變體和以膜 蛋白形式表達(dá)存在于細(xì)胞或組織中的VEGF及其變體。
4. 一種以權(quán)利要求1所述的sFLTl (Dl-7)或sKDR(Dl-7)重組蛋白為吸附劑用于分離VEGF蛋 白及其變體的方法。
5. —種以權(quán)利要求1所述的sFLTl (Dl-7)或sKDR(Dl-7)重組蛋白為吸附劑用于分離含VEGF 蛋白及其變體的細(xì)胞或組織的方法。
6. —種以權(quán)利要求1所述的sFLTl(Dl-7)或sKDR(Dl-7)重組蛋白為主要活性成分的藥用物， 該藥用物可用于中和吸附VEGF及治療與血管過(guò)度增生有關(guān)的疾病。
7. —種同時(shí)含有權(quán)利要求1所述的FLTl(Dl-7)及sKDR(Dl-7)兩種重組蛋白的組合藥用物， 該組合藥用物可更徹底地中和吸附VEGF及治療與血管過(guò)度增生有關(guān)的疾病。
全文摘要
本發(fā)明報(bào)道了經(jīng)采用重組基因工程與哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)生產(chǎn)的兩種代號(hào)分別為sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)的重組蛋白。這兩種重組蛋白都為截短的可溶性的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)受體，其共同結(jié)構(gòu)特征是在于其各自都僅包含有VEGF受體-1(FLT1)或VEGF受體-2(KDR)的胞膜外的第1至第7個(gè)(D1-7)免疫球蛋白樣區(qū)。這兩種重組蛋白保留有與VEGF高度結(jié)合的生物活性，可作為中和吸附VEGF的試劑或藥物成分，用于檢測(cè)與分離體內(nèi)外VEGF蛋白及治療包括腫瘤在內(nèi)的多種與血管增生有關(guān)的疾病。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101270150SQ20071003822
公開日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2007年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月20日
發(fā)明者徐一清 申請(qǐng)人:徐一清