專利名稱：：一種能早期、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)肝臟功能的檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)用檢測(cè)試劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種能早期、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)肝臟功能的檢測(cè)試劑盒，即對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen)與對(duì)乙酰氨基苯乙醚(phenacetin)色譜一分光光度檢測(cè)試劑盒及其制備和用途。
背景技術(shù)：
：在臨床工作中，經(jīng)常遇到一些病人，過去只是乙肝病毒攜帶者，與肝臟相關(guān)的各項(xiàng)檢査都正常。體檢時(shí)，一發(fā)現(xiàn)就是肝硬化，甚至肝癌。有些脂肪肝、長(zhǎng)期飲酒或慢性肝病的病人，組織學(xué)或影像學(xué)檢査，肝臟的組織結(jié)構(gòu)已明顯破壞，但肝功能試驗(yàn)正常。其中部分病人一旦接受肝臟手術(shù)或介入治療，常出現(xiàn)嚴(yán)重肝功能衰竭。在我國(guó)，慢性肝病是常見病和多發(fā)病，僅乙型肝炎病毒攜帶者就高達(dá)一億多人，占我國(guó)總?cè)丝诘?0%以上。每年有IOO萬新生兒由于母嬰垂直傳播，可能會(huì)感染乙肝病毒。另外，藥物、環(huán)境污染以及自身免疫性疾病也是引起肝損害的常見原因。由于慢性肝損害主要發(fā)生在青壯年，一旦轉(zhuǎn)變成肝硬化，除誘發(fā)肝癌外，其自身也是一種不可逆轉(zhuǎn)的病理過程；給社會(huì)和家庭在經(jīng)濟(jì)和精神上造成極大的負(fù)擔(dān)和痛苦。目前，臨床上將谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(SGOT)、Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(Y-GT)和乳酸脫氧酶等測(cè)定，統(tǒng)稱為肝功能檢査，這是不正確的。正如Rochling等人(ClinCornerstone2001;3(6):l-12)指出的那樣，這些檢查是肝細(xì)胞受到損害的指標(biāo)，并不能反映肝臟的功能。肝臟功能是指肝臟的解毒功能、肝臟的消化功能、肝臟的生物轉(zhuǎn)化功能、肝臟的排泄功能、肝臟的三大物質(zhì)代謝功能和肝臟在胚胎期的造血功能。而與這些功能相關(guān)的常規(guī)檢査主要有三個(gè)指標(biāo)，即血漿白蛋白含量測(cè)定、血清膽紅素含量測(cè)定和凝血酶原時(shí)間測(cè)定。但這三項(xiàng)指標(biāo)的靈敏度低，特異性差，不能滿足臨床的需要。正確評(píng)價(jià)肝臟功能，是肝臟疾病早期診斷、早期預(yù)防和早期治療的關(guān)鍵。正如Schneider最近在北美臨床外科雜志(SurgClinNorthAm2004;84(2):355-373)撰文所說開發(fā)研制一種能早期、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)肝臟功能的診斷試劑非常必要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能夠同時(shí)測(cè)定藥物制剤或生物樣品中的對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量，從而能早期、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)肝臟功能的檢測(cè)試劑盒。近年來，我們?cè)谶@一領(lǐng)域進(jìn)行了探索性研究，取得重大進(jìn)展。主要包括(1)建立了一個(gè)研究肝外代謝的在體模型，解決了以往無法采用在體實(shí)驗(yàn)(invivoexperiment)論證肝外代謝的難題。(2)以CYP4503A2酶為靶點(diǎn)，研究了肝外組織中利多卡因氮位去乙基酶活性。發(fā)現(xiàn)利多卡因氮位去乙基代謝產(chǎn)物(MEGX)有30%以上來自肝外代謝。說明采用利多卡因氮位去乙基代謝實(shí)驗(yàn)(MEGXtest)評(píng)價(jià)肝臟功能有明顯缺陷。(3)以CYP4501A2酶為靶點(diǎn)，研究了大鼠肝外組織中對(duì)乙酰氨基苯乙醚氧位去乙基酶活性及其首過效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)對(duì)乙酰氨基苯乙醚肝外代謝率極低，且不被經(jīng)典肝藥酶誘導(dǎo)劑苯巴比妥鈉所誘導(dǎo)。說明CYP4501A2酶是評(píng)價(jià)大鼠肝臟功能或肝臟貯備功能的理想靶點(diǎn)。(4)研究了探針?biāo)幬锎x的種族差異及其在肝硬化病人的代謝變化。(5)研究了探針?biāo)幬镌诟伟┐笫蟮拇x變化；并進(jìn)行了相關(guān)的分子藥理學(xué)研究。(6)最近，我們采用對(duì)乙酰氨基苯乙醚氧位去乙基代謝試驗(yàn)，評(píng)價(jià)了肝硬化和肝癌病人的肝臟功能或肝臟貯備功能。發(fā)現(xiàn)正常人口服對(duì)乙酰氨基苯乙醚后2小時(shí)，其血漿中氧位去乙基代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚含量高達(dá)80%，而失代償肝硬化病人小于25%。說明CYP4501A2酶也是評(píng)價(jià)人肝臟功能或肝臟貯備功能的理想靶點(diǎn)對(duì)乙酰氨基苯乙醚是肝臟細(xì)胞色素P4501A2氧化酶的特異性底物。該酶在肝臟呈組成型表達(dá)。正常人口服或注射對(duì)乙酰氨基苯乙醚后，肝臟的細(xì)胞色素P4501A2氧化酶能將其全部或絕大部分轉(zhuǎn)化成代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚。在慢性肝病病人，由于肝臟P4501A2氧化酶活性降低，口服或注射對(duì)乙酰氨基苯乙醚后，其代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚的生成減少，因此，血液中對(duì)乙酰氨基酚的濃度比正常人明顯降低。對(duì)乙酰氨基苯乙醚副作用少，不良反應(yīng)小，是臨床實(shí)驗(yàn)的一個(gè)理想探針?biāo)幬?。令人遺憾的是，對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚的測(cè)定，基本上都是采用高效液相色譜等精密儀器分析法進(jìn)行的。這些方法的技術(shù)要求高，操作復(fù)雜，很難走出實(shí)驗(yàn)室，被臨床推廣應(yīng)用。本發(fā)明采用色譜柱技術(shù)，特異性吸附藥物制劑或生物樣品中的對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚，用洗脫液解吸后，將對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚衍生成能夠被分光光度計(jì)測(cè)定的衍生物，以便采用差示光譜法，進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的一種能早期、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)肝臟功能的檢測(cè)試劑盒，即對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，能夠同時(shí)測(cè)定藥物制劑或生物樣品中的對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量，具有極大的臨床實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種能早期、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)肝臟功能的檢測(cè)試劑盒，由色譜柱、解吸液、水解液、水和顯色劑組成，其特征在于色譜柱內(nèi)充填有能吸附對(duì)乙酰氨基酚及對(duì)乙酰氨基苯乙醚的填料；解吸液為35%乙醇；水解液為2N鹽酸；水為雙蒸去離子水；顯色劑分別為0.1%1-2奈醌-4-磺酸鈉試液、1NNaOH和lNNa2C03試液；用分光光度法檢測(cè)。在選擇色譜柱填料時(shí)，我們驗(yàn)證了活性炭、球形活性炭、炭纖維、乙烯樹脂、丙烯樹脂、苯乙烯樹脂和聚氨脂樹脂等填料，這些填料對(duì)對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚有較好的吸附性，解吸完全?？紤]到外觀觀感，性價(jià)比和臨床實(shí)用性等綜合因素，本發(fā)明最后選擇了LMHS180樹脂，生產(chǎn)樹脂的公司為ROHMANDHAAS。本發(fā)明的一種能早期、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)肝臟功能的檢測(cè)試劑盒，即對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒屬于體外藥物濃度測(cè)定試劑，主要是由色譜柱、解吸液、水解液和顯色液所組成。試劑盒的組成見下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>色譜柱和試液的制備與質(zhì)控1、裝柱與質(zhì)控(1)用水清洗柱套(3*10cm)，將其晾干，(2)吸取LMHS180樹脂0.5毫升，填充色譜柱，加樣誤差為±15%(3)用封口紙封閉色譜柱加樣口，室溫保存。(4)質(zhì)量控制吸取10|Jg/ml的對(duì)乙酰氨基酚水溶液1毫升上柱，用35%乙醇1毫升解吸。用10|Jg/ml的對(duì)乙酰氨基酚乙醇溶液作對(duì)照，解吸液在245nm處的吸光度不低于對(duì)照管的95%。2、35%乙醇(解吸液)(1)購置市售95%的乙醇，AR級(jí)，(2)每次分裝時(shí)稀釋，用酒精比重計(jì)測(cè)定其濃度。:，乙醇濃度〉30%3、2N的鹽酸溶液(水解液，按中華人民共和國(guó)藥典2005年版配制)(1)吸取AR級(jí)鹽酸180毫升，(2)加水至1000毫升。濃度誤差〈±5%4、0.1%l-2奈醌-4-磺酸鈉試液(顯色液l)的配制與質(zhì)控(1)稱取l-2奈醌-4-磺酸鈉l克，(2)加水溶解后，定容至1000毫升。(3)質(zhì)量控制吸取1毫升，定容至10毫升。在405nm處的吸光度為0.7±0.035。避光保存5.1NNa2C03試液(按中華人民共和國(guó)藥典2005年版配制)(1)取一水合Na2C03l2.5g或無水Na2C0310.5g(AR級(jí))，(2)加水使其溶解，定容至100毫升。6.1NNaOH試液(按中華人民共和國(guó)藥典2005年版配制)56毫升NaOH飽和液加水定容至100毫升。測(cè)定原理對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒適用于檢測(cè)藥物制劑或生物樣品中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚的含量。其特點(diǎn)是能夠同時(shí)準(zhǔn)確定量測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量，特異性強(qiáng)。生物樣品通過色譜柱，對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚被特異性吸附。解吸后，對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚被水解、顯色，用分光光度計(jì)在535、600、610和735nm處讀數(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。藥物制劑不需要上柱，可直接解、顯色，然后用分光光度計(jì)測(cè)定。操作步驟如下將色譜柱置于試管架上，打開上下蓋；血漿、血清或其它樣品lml上柱，棄去流出液；加去離子水6ml，棄去流出液；滴完后加解吸液2ml，同時(shí)收集流出液；加水解液200H1;96-99t;水浴2小時(shí)；依次加顯色劑1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)各200ul;735nm調(diào)零后讀數(shù)。技術(shù)性能指標(biāo)l準(zhǔn)確度1.1儀器島津2450型UV-分光光度計(jì)，比色杯光徑為lcm。1.2測(cè)定步驟取高濃度和低濃度的對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚定值血清作為檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，每一檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行五次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算每個(gè)檢測(cè)標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果平均值，用相對(duì)偏差表示。以定值血清為樣品時(shí)，測(cè)試值與標(biāo)定值的相對(duì)偏差應(yīng)小于10%。計(jì)算方法如下RE%=^^xioo%式中REn/。一相對(duì)偏差^一每個(gè)定值血清測(cè)定結(jié)果平均值TV—定值血清標(biāo)定值2精密度2.1儀器同l.l2.2測(cè)定步驟取高濃度和低濃度的對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚定值血清作為檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，每一檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行20次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算每個(gè)檢測(cè)標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，用變異系數(shù)表示結(jié)果。以定值血清為樣品時(shí)，測(cè)試值與標(biāo)定值的相對(duì)偏差應(yīng)小于10%。計(jì)算方法如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>式中CV—變異系數(shù)，重復(fù)性指標(biāo)Xi—定值血清的對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚濃度測(cè)定值；X—定值血清濃度的平均值；SD—絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差i一l，2，3，……，(本實(shí)驗(yàn)11=20);3批間差取三批試劑，每批取三份，分別測(cè)定血清標(biāo)本或定值血清，計(jì)算9份試劑測(cè)定的平均值、嘲每批試劑的測(cè)定平均值api，p2;3)，按下列公式求出三個(gè)批號(hào)試劑測(cè)定平均值的相對(duì)極差(％)，批間相對(duì)極差應(yīng)小于10%。公式相對(duì)極差(%)=Xmax-Xminx100%Xp式中又郵x為又P，.又P^PS的最大值為又p1,又p2,又p3的最/j、值4線性范圍4.1儀器同1.14.2不同濃度對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚混合血清的制備取5支試管依次編號(hào)，按表1配制不同濃度對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚的混合血清，并分別混勻。表1.不同濃度對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚的混合血清(ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4.3測(cè)定步驟對(duì)表l中配制的5個(gè)不同濃度標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，每一濃度重復(fù)3次，根據(jù)下列公式計(jì)算相關(guān)系數(shù)r，截距b和斜率a-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>式中r相關(guān)系數(shù)；'a—回歸方程的斜率；b—回歸方程截距的絕對(duì)值；Xi—測(cè)定管溶液的對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚濃度的測(cè)定值；yi—與測(cè)定管溶液濃度相適應(yīng)的吸光度；i—1，2，3，......n;n—測(cè)定樣品數(shù)；線性范圍對(duì)乙酰氨基酚為2—18pg/ml，對(duì)乙酰氨基苯乙醚為2—18pg/ml，相關(guān)系數(shù)r應(yīng)大于0.999。5裝量色譜柱中的樹脂和每個(gè)試管中的試液裝量不少于標(biāo)示量的95%。6干擾試驗(yàn)在對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚定值血清中，分別加入臨床67種治療濃度的常用藥物作為檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，每一檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算每個(gè)檢測(cè)標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果平均值，用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示測(cè)定結(jié)果。以定值血清為樣品時(shí)，測(cè)試值與標(biāo)定值的相對(duì)偏差小于10%。7穩(wěn)定性試劑盒在室溫下避光保存18個(gè)月，質(zhì)量檢查符合有關(guān)規(guī)定。在整個(gè)研制過程中，我們同時(shí)采用高效液相色譜儀，隨機(jī)抽樣檢測(cè)，比較兩種不同方法的測(cè)定結(jié)果，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確、可靠。與其它肝功能試驗(yàn)的比較*Child-Pugh分級(jí)法是目前臨床評(píng)價(jià)肝臟功能最常用的方法。正如Rochling等人所說，該方法是以血漿白蛋白含量、膽紅素含量、凝血酶原時(shí)間、體重、腹水、精神狀態(tài)等綜合指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)，所以靈敏度低，特異性差。*探針?biāo)幬?Probedrug)和雞尾酒試驗(yàn)(cock-tailtest)。探針?biāo)幬锖碗u尾酒試驗(yàn)的基本原理是，口服或靜脈注射一種或幾種探針?biāo)幬铮瑴y(cè)定其代謝產(chǎn)物或體內(nèi)動(dòng)力學(xué)過程，評(píng)價(jià)肝臟的生物轉(zhuǎn)化功能。該方法的主要缺點(diǎn)是①對(duì)絕大多數(shù)探針?biāo)幬飦碚f，肝臟不是其唯一的代謝器官，甚至肝外代謝的能力還很強(qiáng)；②代謝產(chǎn)物的形成及探針?biāo)幬锏膭?dòng)力學(xué)過程除與肝臟功能有關(guān)外，還受吸收、組織分布、血漿蛋白結(jié)合率、腎臟排泄功能等因素的影響。對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒比現(xiàn)有其它方法靈敏度高，特異性好的主要原因①對(duì)乙酰氨基苯乙醚氧位去乙基酶在肝臟呈組成型表達(dá)，肝外活性極低；②我們對(duì)傳統(tǒng)研究方法一即口服或注射探針?biāo)幬镆粶y(cè)定其代謝產(chǎn)物一評(píng)價(jià)肝臟功能，做了重大改進(jìn)。我們采用探針?biāo)幬锱c代謝產(chǎn)物的比值，替代單純測(cè)定代謝產(chǎn)物作為指標(biāo)，評(píng)價(jià)肝臟功能。由于母核藥物與其代謝產(chǎn)物理化性質(zhì)極為近似，采用探針?biāo)幬锱c代謝產(chǎn)物的濃度比值作為指標(biāo)，消除了因組織分布，血漿蛋白結(jié)合率、腎臟排泄功能等個(gè)體間差異造成的非特異性干擾，使檢測(cè)方法的特異性大大增加。臨床應(yīng)用范圍該發(fā)明填補(bǔ)了臨床評(píng)價(jià)肝臟功能的空白，其應(yīng)用范圍十分廣泛。對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒的臨床應(yīng)用至少包括-參檢查乙肝病毒攜帶者肝臟功能是否受到影響；*評(píng)價(jià)慢性肝病病人肝臟功能的損害程度；*脂肪肝和長(zhǎng)期飲酒者肝臟功能是否正常；*為肝移植病人選擇一個(gè)好的供肝；*在肝臟手術(shù)時(shí)，確定病人肝臟是否能接受手術(shù)，肝臟能切除多少；*肝癌的病人能否接受介入治療；*藥物損害和自身免疫性疾病病人的肝功能受損程度；*其他動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、新藥設(shè)計(jì)與開發(fā)、藥物不良反應(yīng)的檢測(cè)等。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一《對(duì)乙酰氮基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》測(cè)定藥物中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量實(shí)驗(yàn)?zāi)康难芯俊秾?duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》是否能夠用于測(cè)定藥物制劑中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量。儀器與試驗(yàn)藥物島津2450型UV-分光光度計(jì)(日本島津公司制造)；復(fù)方阿斯匹林片(APC，每片含對(duì)乙酰氨基苯乙醚0.15克、阿斯匹林0.22克和咖啡因0.035克，武漢遠(yuǎn)大制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，H42021758);對(duì)乙酰氨基酚片(0.3克/片，東北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司提供)。操作步驟隨機(jī)抽取復(fù)方阿斯匹林9片和對(duì)乙酰氨基酚9片，分別分成三份，每份三片。充分研磨后，加適量雙蒸去離子水混勻。過濾后，定容至1000毫升。樣品l:取復(fù)方阿斯匹林水溶液20毫升，定容至1000毫升，每毫升含對(duì)乙酰氨基苯乙醚9pg。樣品2:取對(duì)乙酰氨基酚水溶液10毫升，定容至1000毫升，每毫升含對(duì)乙酰氨基酚9嗎。樣品3:取復(fù)方阿斯匹林水溶液20毫升和對(duì)乙酰氨基酚水溶液10毫升，定容至1000毫升，每毫升含對(duì)乙酰氨基苯乙醚9嗎和對(duì)乙酰氨基酚9pg。對(duì)照品對(duì)乙酰氨基酚和對(duì)乙酰氨基苯乙醚的標(biāo)準(zhǔn)品(購于SigmaCo)。使用《對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》，按《操作步驟》描述的方法操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品l、樣品2和樣品3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。表2.樣品l、樣品2和樣品3的測(cè)定結(jié)果(ng/ml，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>復(fù)方阿斯匹林和對(duì)乙酰氨基酚是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥。復(fù)方阿斯匹林由三種成分組成，其中包括對(duì)乙酰氨基苯乙醚。本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論是單一組分的對(duì)乙酰氨基酚，還是復(fù)方組分的對(duì)乙酰氨基苯乙醚，都能使用《對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》進(jìn)行檢測(cè)。其實(shí)測(cè)值與標(biāo)示量的誤差小于1.4%，變異系數(shù)小于1.6%，復(fù)方阿斯匹林片中的阿斯匹林和咖啡因不影響對(duì)乙酰氨基苯乙醚的測(cè)定。說明該方法準(zhǔn)確、可靠，特異性強(qiáng)。樣品3的測(cè)定結(jié)果表明，《對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》能夠同時(shí)測(cè)定藥物制劑中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚的含量，其結(jié)果同樣準(zhǔn)確、可靠。實(shí)施例二《對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》測(cè)定人血液、唾液和尿液中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)研究《對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》是否能夠用于測(cè)定人血液、唾液和尿液中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量，(2)用《對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》作為檢測(cè)方法，正常人與慢性肝病病人血液中對(duì)乙酰氨基酚和對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量是否有差異，(3)《對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》的測(cè)定結(jié)果與高效液相色譜的測(cè)定結(jié)果是否吻合。儀器與試驗(yàn)藥物島津2450型UV-分光光度計(jì)(日本島津公司制造)；20A型高效液相色譜儀(日本島津公司制造，ODSd8色譜柱4.6X250mm，流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸(30:70)，等度洗脫，流速lmL/min，進(jìn)樣體積為20uL);對(duì)乙酰氨基苯乙醚(佳木斯鹿靈制藥有限公司提供)。受試對(duì)象12例慢性肝病病人，Child-Pugh分級(jí)為C級(jí)。年齡39-58歲，其中男性9例，女性3例。正常對(duì)照組8人，男女參半，年齡22-49歲。所有受試者均知情同意，并經(jīng)倫理委員會(huì)討論、同意。操作步驟所有受試者于晚飯后開始禁食，次日晨口服對(duì)乙酰氨基苯乙醚1.0克，用200毫升溫開水服下。給藥后二小時(shí)，抽取靜脈血3毫升，置于抗凝管內(nèi)。正常對(duì)照組同時(shí)收集唾液2毫升，并收集24的尿液，精確測(cè)定其體積后取樣，-2(rc保存。所有受試者抽血后進(jìn)早餐，飲水不限。使用《對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》，按《操作步驟》描述的方法操作，測(cè)定上述所有標(biāo)本中對(duì)乙酰氨基酚和對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量。另外，使用高效液相色譜法，測(cè)定肝硬化病人和正常人血液中對(duì)乙酰氨基酚和對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量，比較兩種不同測(cè)定方法的測(cè)定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果8例正常人唾液和尿液中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚的含量見表3。表3.8例正常人唾液和尿液中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚的含量(pg/ml，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>12例慢性肝病病人和8例正常人血液中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚的含量見表4。表4.慢性肝病病人和正常人血液中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚的含量(pg/ml，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>與正常人比，*尸<0.01實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，《對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》能夠用于測(cè)定人血液、唾液和尿液中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量。與正常人相比，無論使用《對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》作為檢測(cè)方法，還是使用高效液相色譜法，慢性肝病病人血液中對(duì)乙酰氨基酚含量明顯減少，而對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量顯著增加。與高效液相色譜法比，使用《對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》測(cè)定血液中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)不需要用有機(jī)溶劑萃取血液中的對(duì)乙酰氨基酚和對(duì)乙酰氨基苯乙醚，(2)操作方便、簡(jiǎn)單。另外，本實(shí)施例還表明，使用《對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》測(cè)定血液中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量，所得結(jié)果與高效液相色譜法極為近似，相對(duì)偏差小于5%。說明采用《對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒》測(cè)定血液中對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量，方法準(zhǔn)確、可靠。權(quán)利要求1.一種能早期、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)肝臟功能的檢測(cè)試劑盒，由色譜柱、解吸液、水解液、水和顯色劑組成，其特征在于色譜柱內(nèi)充填有能吸附對(duì)乙酰氨基酚及對(duì)乙酰氨基苯乙醚的填料；解吸液為35％乙醇；水解液為2N鹽酸；水為雙蒸去離子水；顯色劑分別為0.1％1-2奈醌-4-磺酸鈉試液、1NNaOH和1NNa2CO3試液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種能早期、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)肝臟功能的檢測(cè)試劑盒，其特征在于色譜柱內(nèi)充填的能吸附對(duì)乙酰氨基酚或?qū)σ阴０被揭颐训奶盍线x自活性炭、球形活性炭、炭纖維、乙烯樹脂、丙烯樹脂、苯乙烯樹脂和聚氨脂樹脂、以及LMHS180樹脂。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種能早期、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)肝臟功能的檢測(cè)試劑盒，其特征在于色譜柱內(nèi)充填的能吸附對(duì)乙酰氨基酚或?qū)σ阴０被揭颐训奶盍蠟長(zhǎng)MHS180樹脂。全文摘要本發(fā)明提供一種能早期、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)肝臟功能的檢測(cè)試劑盒，即對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚色譜-分光光度檢測(cè)試劑盒及其制備和用途。試劑盒由色譜柱、解吸液、水解液、水和顯色劑組成，其特征在于色譜柱內(nèi)充填有能吸附對(duì)乙酰氨基酚及對(duì)乙酰氨基苯乙醚的填料；解吸液為35％乙醇；水解液為2N鹽酸；水為雙蒸去離子水；顯色劑分別為0.1％1-2奈醌-4-磺酸鈉試液、1NNaOH和1NNa₂CO₃試液。填料選自活性炭、球形活性炭、炭纖維、乙烯樹脂、丙烯樹脂、苯乙烯樹脂和聚氨脂樹脂、以及LMHS180樹脂。該試劑盒操作簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果可靠，能同時(shí)測(cè)定藥物制劑或生物樣品中的對(duì)乙酰氨基酚與對(duì)乙酰氨基苯乙醚含量，具有臨床實(shí)用價(jià)值。文檔編號(hào)G01N30/02GK101349678SQ200710041869公開日2009年1月21日申請(qǐng)日期2007年6月12日優(yōu)先權(quán)日2007年6月12日發(fā)明者李曉冬,平賀申請(qǐng)人:賀平;李曉冬