專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用FPLC測(cè)定脫氧胞苷激酶(dCK)活性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種酶活力測(cè)定方法，具體涉及一種脫氧胞苷激酶(dCK)的酶活測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
脫氧胞苷激酶(dCK)是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的四大激酶之一，它廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)及一 些細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞體內(nèi)，dCK可以催化天然核苷的磷酸化，也可催化一些核苷類(lèi)藥物的 磷酸化。研究表明，抗病毒核苷類(lèi)藥物在人體內(nèi)通過(guò)dCK催化進(jìn)行磷酸化，產(chǎn)生與逆轉(zhuǎn)錄 酶結(jié)合的底物，而發(fā)揮藥效。但是，在一些患者體內(nèi)細(xì)胞的dCK含量很低，無(wú)法催化核苷 類(lèi)藥物的磷酸化，因而導(dǎo)致了病毒的抗藥性。因此，利用從各種來(lái)源提取dCK，并將其用 于核苷類(lèi)似物的體外磷酸化，對(duì)核苷類(lèi)藥物的發(fā)展來(lái)說(shuō)是一個(gè)嶄新的領(lǐng)域。故對(duì)于從各種 來(lái)源純化的dCK進(jìn)行酶活表征，是利用dCK進(jìn)行催化反應(yīng)的重要步驟。
自1970年以來(lái)，有多個(gè)專(zhuān)家對(duì)于dCK的酶活測(cè)定方法進(jìn)行了研究，主要有放射性 同位素薄層層析色譜法、放射性同位素連續(xù)分光光度法以及非放射性反相HPLC色譜法。 其中，放射性同位素薄層層析色譜法的發(fā)明年代較早，對(duì)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室測(cè)量來(lái)說(shuō)是落后且費(fèi) 時(shí)的；放射性同位素連續(xù)分光光度法雖然是第一種方法的改進(jìn)，但是同樣也需要用到放射 性同位素，大大增加了時(shí)間上和經(jīng)濟(jì)上的成本；而非放射性反相HPLC色譜法是2004年 發(fā)表的利用高效液相色譜進(jìn)行dCK酶活測(cè)定的一種新方法，簡(jiǎn)單易懂，簡(jiǎn)化了以往的復(fù)雜 操作，但是其對(duì)液相色譜柱要求較高。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用非放射性反相HPLC色譜法， 在相同條件下進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)，所得的結(jié)果存在差異，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不夠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種脫氧胞苷激酶(dCK)酶活測(cè)定方法，該方法克服了以往的 dCK酶活測(cè)定方法的繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，重復(fù)性不高的缺陷。
本發(fā)明的利用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)測(cè)定dCK酶活的方法，包括如下步驟
(1) 將反應(yīng)混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中反應(yīng)后，加入冰甲醇終止反應(yīng)，冰浴后， 離心，取上清液；
(2) 用Tris-HCI緩沖液稀釋上清液，過(guò)濾，利用FPLC的反相液相色譜柱進(jìn)行層析，通過(guò) 與空白對(duì)比測(cè)得CdA減少的量，計(jì)算dCK的活性。
所述步驟(1)中的反應(yīng)液包括2-氯-2-脫氧胞苷(CdA)、三磷酸尿苷(UTP)、氯化 鎂MgCl2、氯化鈉NaCl、氟化鈉NaF、 二硫代蘇糖醇DTT、 dCK，濃度分別為0.1 lmmoI/L CdA、 1 1Ommol/LUTP、 l 10mmol/LMgCl2、 10 20mmol/LNaCl、 10 20mmol/LNaF、 1 2mmol/LDTT，優(yōu)選lmmol/LCdA、 10mmol/LUTP、 10mmol/L MgCl2、 20mmol/LNaCl、 20mmol/L NaF 、 2mmol/L DTT 。
所述步驟(1)中的反應(yīng)液用0.005 0.02mol/L的Tris-HCl (pH6.0 8.0)溶液定容， 優(yōu)選0.01 moi/L的Tris-HCl (pH7.4);
所述的脫氧胞苷激酶(dCK)是指從小牛胸腺中提取的dCK;
所述步驟(1)中的反應(yīng)是指30'C 4(TC， 120 150轉(zhuǎn)條件下，反應(yīng)2 3小時(shí)，反 應(yīng)后冰浴5 20分鐘，優(yōu)選37°C，搖床轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，反應(yīng)后冰浴 IO分鐘;
所述的歩驟(2)中的層析條件是反相液相色譜柱為RESOURCE" RPClml，洗脫液 A為0.05 0.02mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH6.0 8.0)，洗脫液B為乙腈，平衡為5 10 個(gè)柱床，沖洗為5 7個(gè)柱床，洗脫梯度為洗脫液B在10 20個(gè)柱床內(nèi)由0%線性增加至 100%，流速為l 2ml，優(yōu)選洗脫液A為O.Olmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，平衡為 10個(gè)柱床，沖洗為7個(gè)柱床，洗脫梯度為洗脫液B在20個(gè)柱床內(nèi)由0%線性增加至100 %，流速為1ml;
所述的dCK酶活的計(jì)算方法dCK酶活U=CdA反應(yīng)量(picomol)/蛋白含量(u g) *h， CdA反應(yīng)量二CdA空白標(biāo)準(zhǔn)量一CdA剩余量；
所述的CdA剩余量的測(cè)定為內(nèi)標(biāo)法。
本發(fā)明提供的方法快速、簡(jiǎn)便，結(jié)果可信，重復(fù)性高，為大批量測(cè)定氧胞苷激酶(dCK) 酶活，提供依據(jù)。


圖1為用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)對(duì)小牛胸腺dCK催化CdA磷酸化反應(yīng)混合液空白 進(jìn)行反相色譜層析所得的色譜圖2為用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)對(duì)小牛胸腺dCK催化CdA磷酸化反應(yīng)混合液進(jìn)行 反相色譜層析所得的色譜圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一歩闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限 定的范圍。
實(shí)施例1
1 、 dCK催化CdA的單磷酸化反應(yīng)
(1) 將反應(yīng)混合液包括lmmol/LCdA、 10mmol/LUTP、 10mmol/LMgCl2、 20mmol/L NaCl、 20mmol/LNaF、 2mmol/L DTT以及l(fā)mldCK用0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.4) 定容到5ml。
(2) 將反應(yīng)混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中，在37'C、 150rpc下，反應(yīng)2小時(shí)。
(3) 反應(yīng)完畢后將混合液取出，加入lml冰甲醇，放入冰浴中反應(yīng)10分鐘，另蛋白 質(zhì)完全沉淀。
(4) 從冰浴中取出混合液，放入離心機(jī)中10000rpc離心10分鐘，留取上清液等待 FPLC測(cè)定。
(5) 樣品空白的準(zhǔn)備在反應(yīng)混合液中直接加入lml冰甲醇，再放入氣浴/水浴恒溫 振蕩器中，在37。C、 150rpc下，反應(yīng)2小時(shí)。冰浴10分鐘后，離心留取上清液。
2、 FPLC測(cè)定dCK酶活
(1) 樣品的準(zhǔn)備。取上述反應(yīng)混合物清液0.5ml，用0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液 (pH7.4)稀釋至lml。將稀釋的混合液用0.45y的濾頭過(guò)濾，等待上樣。
(2) 反相液相色譜層析。用FPLC系統(tǒng)中反相液相色譜對(duì)上述處理過(guò)的樣品和樣品空 白進(jìn)行層析，條件是反相層析柱RESOURCE RPC lml;洗脫液A: O.Olmol/L的Tris-HCl
緩沖液(pH7.0);洗脫液B:乙腈；上樣量5ml;平衡IO個(gè)柱床；沖洗7個(gè)柱床；洗
脫梯度洗脫液B在20個(gè)柱床內(nèi)由0%線性轉(zhuǎn)變到100%;流速lml/min。
實(shí)施例2
1、 dCK催化CdA的單磷酸化反應(yīng)
(l)將反應(yīng)混合液包括lmmol/LCdA、 10mmol/LUTP、 1 Ommol/LMgCl2、 20mmol/L NaCl、 20mmol/LNaF、 2mmol/L DTT以及l(fā)mldCK用O.Olmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.0) 定容到5ml。(2) 將反應(yīng)混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中，在37。C、 150rpc下，反應(yīng)2小時(shí)。
(3) 反應(yīng)完畢后將混合液取出，加入lml冰甲醇，放入冰浴中反應(yīng)10分鐘，另蛋白 質(zhì)完全沉淀。
(4) 從冰浴中取出混合液，放入離心機(jī)中10000rpc離心10分鐘，留取上清液等待 FPLC測(cè)定。
(5) 樣品空白的準(zhǔn)備在反應(yīng)混合液中直接加入lml冰甲醇，再放入氣浴/水浴恒溫 振蕩器中，在37"C、 150rpc下，反應(yīng)2小時(shí)。冰浴10分鐘后，離心留取上清液。
2、 FPLC測(cè)定dCK酶活
(1) 樣品的準(zhǔn)備。取上述反應(yīng)混合物清液0.5ml，用0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液 (pH7.0)稀釋至lml。將稀釋的混合液用0.45u的濾頭過(guò)濾，等待上樣。
(2) 反相液相色譜層析。用FPLC系統(tǒng)中反相液相色譜對(duì)上述處理過(guò)的樣品和樣品 空白進(jìn)行層析，條件是反相層析柱RESOURCE RPC ltnl;洗脫液A: 0.005mol/L的
Tris-HCl緩沖液(pH7.0);洗脫液B:乙腈；上樣量5ml;平衡IO個(gè)柱床；沖洗7個(gè)
柱床；洗脫梯度洗脫液B在IO個(gè)柱床內(nèi)由0%線性轉(zhuǎn)變到100%;流速2ml/min。
實(shí)施例3
1、 dCK催化CdA的單磷酸化反應(yīng)
(1) 將反應(yīng)混合液包括0.5mmol/LCdA、 5mmol/LUTP、 10mmol/LMgCl2、 20mmol/L NaCl、20mmol/LNaF、2mmol/L DTT以及0.5mldCK用O.Olmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)
定容到5ml 。 、
(2) 將反應(yīng)混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中，在37。C、 120rpc下，反應(yīng)3小時(shí)。
(3) 反應(yīng)完畢后將混合液取出，加入lml冰甲醇，放入冰浴中反應(yīng)10分鐘，另蛋白
質(zhì)完全沉淀。
(4) 從冰浴中取出混合液，放入離心機(jī)中10000rpc離心10分鐘，留取上清液等待 FPLC測(cè)定。
(5) 樣品全白的準(zhǔn)備在反應(yīng)混合液中直接加入lml冰甲醇，再放入氣浴/水浴恒溫 振蕩器中，在37。C、 150rpc下，反應(yīng)2小時(shí)。冰浴10分鐘后，離心留取上清液。
2、 FPLC測(cè)定dCK酶活
(1)樣品的準(zhǔn)備。取上述反應(yīng)混合物清液0.5ml，用0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液 (pH7.0)稀釋至lml。將稀釋的混合液用0.45u的濾頭過(guò)濾，等待上樣。
(2)反相液相色譜層析。用FPLC系統(tǒng)中反相液相色譜對(duì)上述處理過(guò)的樣品和樣品空白進(jìn) 行層析，條件是反相層析柱RESOURCE RPC lml;洗脫液A: 0.01 mol/L的Tris-HCl
緩沖液(pH7.0);洗脫液B:乙腈；上樣量5ml;平衡IO個(gè)柱床；沖洗7個(gè)柱床；洗
脫梯度洗脫液B在20個(gè)柱床內(nèi)由0%線性轉(zhuǎn)變到100%;流速lml/min。
權(quán)利要求
1.利用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)測(cè)定脫氧胞苷激酶(dCK)酶活的方法，包括如下步驟(1)30℃～40℃，將反應(yīng)混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中，120～150轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)2～3小時(shí)，加入冰甲醇終止反應(yīng)，冰浴5～20分鐘后，離心，取上清液；(2)用Tris-HCl緩沖液稀釋上清液，過(guò)濾，利用FPLC的反相液相色譜柱進(jìn)行層析，通過(guò)與空白對(duì)比測(cè)得CdA減少的量，計(jì)算dCK的活性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用FPLC測(cè)定dCK的方法，其特征在于所述步驟(1)中的 反應(yīng)液包括2-氯-2-脫氧胞苷(CdA)、三磷酸尿苷(UTP)、氯化鎂MgCl2、氯化鈉NaCl、 氟化鈉NaF、二硫代蘇糖醇DTT、c!CK，濃度分別為0.1 lmmol/LCdA、 1 1Ommol/LUTP、 l 10mmol/LMgCl2、 10 20mmol/L NaCl、 10 20mmol/LNaF、 l 2mmol/L DTT。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用FPLC測(cè)定dCK的方法，其特征在于反應(yīng)液濃度為lmmol/L CdA、 1Ommol/LUTP、 10mmoI/L MgCl2、 20mmol/LNaCl、 20mmol/LNaF、 2mmol/LDTT。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用FPLC測(cè)定dCK的方法，其特征在于所述步驟(1)中的 反應(yīng)液用0.005 0.02mol/L的Tris-HCl (pH6.0 8.0)溶液定容。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用FPLC測(cè)定dCK的方法，其特征在于定容液為0.01 mol/L 的Tris-HCl (pH7.4)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用FPLC測(cè)定dCK的方法，其特征在于所述的脫氧胞苷激 酶(dCK)是指從小牛胸腺中提取的dCK。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用FPLC測(cè)定dCK的方法，其特征在于所述步驟(1)中的 反應(yīng)是指37'C， 150轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)2小時(shí)，冰浴10分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用FPLC測(cè)定dCK的方法，其特征在于所述的步驟(2)中 的層析條件是反相液相色譜柱為RESOURCE RPC lml，洗脫液A為0.05 0.02mol/L的 Tris-HCl緩沖液(pH6.0 8.0)，洗脫液B為乙腈，平衡為5 10個(gè)柱床，沖洗為5 7個(gè) 柱床，洗脫梯度為洗脫液B在10 20個(gè)柱床內(nèi)由0%線性增加至100%,流速為1 2ml。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用FPLC測(cè)定dCK的方法，其特征在于洗脫液A為O.Olmol/L 的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，平衡為10個(gè)柱床，沖洗為7個(gè)柱床，洗脫梯度為洗脫液B 在20個(gè)柱床內(nèi)由0%線性增加至100%，流速為lml。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用FPLC測(cè)定dCK的方法，其特征在于所述的dCK酶活 的計(jì)算方法dCK酶活U=CdA反應(yīng)量(picomol) /蛋白含量(μg) h， CdA反應(yīng)量= CdA空白標(biāo)準(zhǔn)量一CdA剩余量，CdA剩余量的測(cè)定為內(nèi)標(biāo)法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)測(cè)定脫氧胞苷激酶(dCK)酶活的方法，包括步驟(1)30℃～40℃，將反應(yīng)混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中，120～150轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)2～3小時(shí)，加入冰甲醇終止反應(yīng)，冰浴5～20分鐘后，離心，取上清液；(2)用Tris-HCl緩沖液稀釋上清液，過(guò)濾，利用FPLC的反相液相色譜柱進(jìn)行層析，通過(guò)與空白對(duì)比測(cè)得CdA減少的量，計(jì)算dCK的活性。該方法快速、簡(jiǎn)便，結(jié)果可信，重復(fù)性高，為大批量測(cè)定氧胞苷激酶(dCK)酶活，提供依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N30/89GK101201338SQ20071004473
公開(kāi)日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2007年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月9日
發(fā)明者朱利民, 柴艷倩 申請(qǐng)人:東華大學(xué)