專利名稱：一種量子點生物探針及其制備方法和基于其的微流控蛋白質(zhì)芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測領域，特別涉及一種量子點生物探針及其制備方法 和基于其的微流控蛋白質(zhì)芯片。
背景技術：
隨著對微觀生物世界研究的深入，研究者們往往需要收集極少數(shù)量甚至
單個生物分子反應所釋放的信號，如在微型化生物檢測中收集痕量DNA分 子、蛋白質(zhì)分子、藥物分子或病毒分子等與信號探針相互作用所產(chǎn)生的信號， 以便進行后續(xù)分析。但如此超微量級的信號是極其微弱的，甚至采用最精密 的儀器也無法探測到，這也是先進的探測手段如蛋白質(zhì)芯片等難以走向真正 應用的原因之一。就蛋白質(zhì)芯片而言，靈敏度問題嚴重影響了其技術性能， 因為蛋白質(zhì)芯片的各個反應單元所能采集到的信息量遠遠低于常規(guī)反應，所 以要收集這些微量信息必須采用高靈敏的信號探針，才能達到對樣品中多種 低豐度蛋白質(zhì)的分析目的。所以為了提高探測靈敏度，采用高亮信號探針用 于超微量生物分子的檢測是目前檢測技術發(fā)展的重要趨勢之一。
具體而言，在應用蛋白質(zhì)芯片探測未知靶蛋白質(zhì)的時候，需要加入一種 信號標記的靶蛋白質(zhì)配體分子等作為信號探針，并實現(xiàn)其與靶蛋白的結合， 形成復合物。然后，相應數(shù)量的復合物發(fā)出相應數(shù)量的信號。當單個配體分 子上所標記的信號量不足的時候，在探測極少量受體分子時，所形成的極少 量復合物發(fā)出的信號是極其微弱的，因此嚴重影響了探測的靈敏度，進而降 低了探測的準確度，造成不同程度的分析誤差。如果采用高亮信號物質(zhì)標記 配體分子，可以構建一個高亮信號探針，實現(xiàn)對靶蛋白分子的超微量探測與分析。
1998年Alivisatos和Nie等分別首次報道了利用量子點替代有機熒光染 料制備生物分子標記物，預示了量子點生物標記物(QDbioconjugates)在生 物檢測中的應用潛力。自此，量子點生物標記物開始被應用于核酸或蛋白質(zhì) 的生物分析，逐步證實了量子點作為新型熒光試劑的優(yōu)越性，比較典型的例 子是Ornberg和Bakalova等分別建立了基于量子點標記的免疫印跡技術，靈 敏度較傳統(tǒng)的免疫印跡提高了兩個數(shù)量級以上。目前納米量子點已被應用于 常規(guī)體外分析(US2001/0023078、 CN1515909)或傳感器制作(US6379622), 以及作為生物偶聯(lián)的光學成像探針進行組織和細胞的研究 (WO2006/001848、 WO2006/005065)等。遺憾的是，在量子點標記物用于 蛋白質(zhì)芯片研究方面，雖然也有少數(shù)個例的嘗試，但其結果只是建立了分析 模型，或是展示了其在克服雜蛋白自身熒光背景方面的性能，而在提高芯片 的靈敏度方面并未取得實質(zhì)性進展。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種用于蛋白質(zhì)芯片的量子點生物探 針及其制備方法，其中量子點選用包覆有高分子聚合物的量子點納米微球。
本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，由高分子聚合物包覆量子點構成的量子點納米 微球，在生物分子特別是蛋白質(zhì)標記中，它不僅較單純的量子點具有更高的 量子效率，而且物化性質(zhì)更加穩(wěn)定，與生物分子的相容性更佳，非常適合在 蛋白質(zhì)芯片中的應用。
因此，本發(fā)明提供的一種量子點生物探針，其是量子點納米微球和靶蛋 白配體連接而成的量子點-生物復合探針。
根據(jù)本發(fā)明，所說的量子點納米微球是由常規(guī)量子點和高分子聚合物聚 合而成，其粒徑通常為35 50nm;其中所說的常規(guī)量子點可以是水溶性量子 點，也可以是有機相量子點，而所說的高分子聚合物可包括聚乳酸、聚丙烯 胺、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚異丙烯酰胺、聚乙烯亞胺和聚乙烯醇等，通
過高分子聚合物的包覆，使常規(guī)量子點表面衍生出各種活性官能團，如羧基
(—COOH)、醛基(一CHO)、氨基(一NH2)、環(huán)氧基等；所述的量子點 納米微球可參照現(xiàn)有技術，如CN1912047A公開的方法制備。本發(fā)明優(yōu)選 CdTe及核殼量子點CdTe/CdS等水溶性量子點，包覆聚丙烯酸、聚丙烯酰胺 等高分子聚合物構成的水溶性量子點納米微球為例來進行說明。
根據(jù)本發(fā)明，所述的靶蛋白配體為各種可與靶蛋白質(zhì)分子特異性結合的 生物分子，如免疫球蛋白、抗體片斷、核酸適體、融合蛋白和蛋白質(zhì)復合體 等。
而本發(fā)明所述的量子點生物探針的制備方法，其包括將量子點納米微球 和靶蛋白配體進行偶聯(lián)反應，并將偶聯(lián)產(chǎn)物進行純化。量子點納米微球通過 其表面所衍生的各種活性官能團，來實現(xiàn)與靶蛋白配體的偶聯(lián)。從理論上說， 可以通過調(diào)整量子點納米微球與靶蛋白配體之間的比例，在量子點納米微球 表面連接一個或一個以上不同數(shù)目的靶蛋白配體。為減少交聯(lián)物的形成，采 用耙蛋白配體過量的方法，使量子點納米微球表面的偶聯(lián)基團充分飽和，使 得量子點納米微球之間不會交聯(lián)在一起。較佳地，每個量子點納米微球上組 裝10 200個靶蛋白配體分子。
在配體分子與量子點納米微球之間通過物理吸附結合的基礎上，為制備 更穩(wěn)定的復合探針，更佳地可以選擇化學偶聯(lián)方式增強二者之間的有效連 接；換言之，本發(fā)明偶聯(lián)反應中還可采用偶聯(lián)劑，諸如生物偶聯(lián)反應中常選 用的碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺等。
同其他生物偶聯(lián)反應，本發(fā)明反應完畢后需進行純化，即除去未反應的 原料及副產(chǎn)物。所述的純化方法也可以選用現(xiàn)有技術，例如離心、超濾和/ 或滲濾等方法。其中超濾或滲濾可選用300K左右的超濾離心管或500K左 右滲濾膜包，收集各組分，選擇高分子量組分，即通常分子量》靶蛋白配體 單體分子量10 50倍，作為最后產(chǎn)物。
由于不同粒徑和結構的量子點具有不同熒光，故可以將不同粒徑和/或結
構的量子點與不同的靶蛋白配體進行偶聯(lián)反應得到各種偶聯(lián)物，作為蛋白質(zhì) 芯片中的多色信號探針(檢測探針)。
因此，本發(fā)明還提供一種微流控蛋白質(zhì)芯片，其包括靶蛋白、捕獲探針 和信號探針，其中信號探針采用上述本發(fā)明的量子點生物探針。
根據(jù)本發(fā)明，當所述的微流控蛋白質(zhì)芯片為單向微流控蛋白質(zhì)芯片時，
其中不同靶蛋白所對應的作為信號探針的生物探針帶有不同熒光光譜的量 子點。具體來說在單向微流控芯片反應區(qū)域固定多種靶蛋白捕獲探針，各 種探針在該區(qū)域按一定比例均勻分布；當耙蛋白樣品通過微流控通道流經(jīng)該 區(qū)域時，各種靶蛋白被相應的捕獲探針捕獲并結合為一級復合物；然后通過 微流動力系統(tǒng)及微型管道將包含有不同量子點標記的信號探針引入反應區(qū) 域，并與所形成的各種一級復合物結合，形成各種二級復合物；每種靶蛋白 所對應的二級復合物含有一種量子點的納米微球，不同的靶蛋白對應不同的 量子點的納米微球，具有不同熒光光譜；在一定發(fā)射光譜范圍內(nèi)測量各種量 子點的熒光強度，即可獲得相應靶蛋白的定性和定量信息。
更特別的是，當所述的微流控蛋白質(zhì)芯片為雙向微流控蛋白質(zhì)芯片時， 其中不同耙蛋白所對應的作為信號探針的生物探針可以帶有相同熒光光譜 的量子點，即可以是一種量子點，而無需采用不同量子點的納米微球標記不 同靶蛋白的信號探針。具體來說通過一個方向的多條微流控管道在微流控 芯片反應區(qū)域固定多種靶蛋白捕獲探針，每條微型管道對應一種捕獲探針； 樣品通過與前一方向非平行的一條或多條微型管道流經(jīng)芯片反應區(qū)域，并與 其呈交叉狀態(tài)，靶蛋白與相應交叉區(qū)域的對應捕獲探針結合形成一級復合 物；然后通過微流動力系統(tǒng)及微型管道將包含有相同量子點的納米微球標記 的不同信號探針引入反應區(qū)域，并與所形成的各種一級復合物結合，形成各 種二級復合物；各種靶蛋白所對應的二級復合物均含有相同量子點的納米微 球，具有相同的熒光光譜；在同一固定波段測定量子點的熒光強度，各種二 級復合物將在蛋白質(zhì)芯片的特定空間位置上給出與靶蛋白數(shù)量對應的信號
強度，經(jīng)后續(xù)數(shù)據(jù)分析可以實現(xiàn)特定靶蛋白的定性和定量分析。
本發(fā)明通過量子點納米微球表面所衍生的上述各種活性官能團，實現(xiàn)與
靶蛋白配體的偶聯(lián)，構建多色信號探針，熒光量子效率達到60%以上，蛋白 質(zhì)配體活性保持在50%以上。而本發(fā)明依賴量子點納米微球的高量子效率特 性，可實現(xiàn)靶蛋白的高靈敏同步多元分析。
圖1為基于本發(fā)明水溶性CdTe量子點聚丙烯酸納米微球探針的雙向微 流控蛋白質(zhì)芯片分析圖。
圖2為基于本發(fā)明水溶性CdTe/CdS量子點聚丙烯酰胺納米微球探針的 雙向微流控蛋白質(zhì)芯片分析圖。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。 實施例1 3
1、水溶性CdTe量子點聚丙烯酸納米微球的制備(參照CN1912047A制 備)(1)碲氫化鉀制備將110.5毫克KBH4固體和91.6毫克Te粉放入到 一個小的燒瓶中，加入3毫升水，于0攝氏度下反應20個小時后，可得到 KHTe溶液，備用；(2) CdTe前體溶液制備將36.8毫克CdCl2溶于100 毫升水，加入0.05毫升巰基乙酸，用0.5摩爾/升的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=11.0, 注入0.30毫升KHTe溶液，作為CdTe前體溶液；(3)含有聚合物的碲化鎘 CdTe前體溶液制備將5毫升濃度為0.00001 mol/L的聚丙烯酸(M^2,000) 溶液加入CdTe前體溶液，攪拌20分鐘，作為含有聚合物的碲化鎘CdTe前 體溶液制備；(4)微波輻射制備聚合物包裹的CdTe量子點將所得到的含 有聚合物的碲化鎘CdTe前體溶液進行微波輻射加熱，可得到聚合物包裹的 CdTe量子點，即量子點納米微球?？刂茥l件如下微波功率100W;反應
溫度120°C;反應時間5min。
2、 將150uL表面帶有活性基團為羧基的水溶性CdTe量子點聚丙烯酸納 米微球(5uM)分別與100uL氨基衍生的凝血酶核酸適體(實施例1)、氨基 衍生的血小板生長因子核酸適體(實施例2)或氨基衍生的免疫球蛋白E蛋 白核酸適體(實施例3) lmM (0.5M PBS， 0.1%NaN3， pH6.5)、以及5uL 碳化二亞胺(500mM)和5uL N-羥基琥珀酰亞胺(100mM)混合，室溫反 應2小時后，4'C過夜。
3、 反應液用300K超濾離心管(美國PALL公司)超濾，收集濾膜上層 組分，作為最后產(chǎn)物。
4、 測定收集液在波長260nm處的紫外吸收，并用熒光分析儀檢測熒光 強度。通過標準曲線插入法計算得出，每個水溶性量子點納米微球所偶聯(lián)的 核酸配體分子數(shù)為100 200。熒光光譜法測得熒光量子效率達到75%，雜 交分析法測得配體活性保持在95 % 。
上述實施例中各核酸適體由上海生工生物工程公司合成。 實施例4~6
1、水溶性CdTe/CdS量子點聚丙烯酰胺納米微球的制備(參照 CN1693207A及CN1912047A制備)(1 )碲氫化鈉制備將92.7毫克NaBH4 固體和127.6毫克Te粉放入到一個小的燒瓶中，加入3毫升水，于15攝氏 度下反應7個小時后，可得到NaHTe溶液備用；(2) CdTe量子點制備將 22.5毫克CdCl2溶于100毫升水，加入0.03毫升巰基乙酸，用0.5摩爾/升的 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH-9.5,通氮氣30分鐘，升溫至100攝氏度，注入0.2毫 升NaHTe溶液，反應3小時，得到CdTe量子點溶液；(3) CdTe/CdS前體 溶液制備將18.5毫克CdCl2和5.6毫克Na2S溶于100毫升水，加入0.06 毫升巰基乙酸，用0.5摩爾/升的NaOH容顏調(diào)節(jié)pH=10.5，注入10毫升CdTe 量子點溶液，得到CdTe/CdS前體溶液；(3)含有聚合物的CdTe/CdS前體 溶液制備將0.5毫升濃度為0.05mol/L的聚丙烯酰胺(Mw=15,000)溶液
加入CdTe/CdS前體溶液，攪拌15分鐘，作為含有聚合物的CdTe/CdS前體 溶液制備；(4)微波輻射制備聚合物包裹的CdTe/CdS量子點將所得到的 含有聚合物的CdTe/CdS前體溶液進行微波輻射加熱，可得到聚合物包裹的
CdTe/CdS量子點。控制條件如下微波功率100W;反應溫度100。C; 反應時間20min。
2、 將150uL酰胺基團衍生的水溶性CdTe/CdS量子點聚丙烯酰胺納米微 球(5uM)經(jīng)0.5%戊二醛活化后，與100uLCA125 (實施例4)、 CA19-9 (實 施例5)或CA15-3 (實施例6)等3種蛋白質(zhì)的單克隆抗體(商購自美國 FITZGERALD公司)100uM (0.5MPBS， 0.1%NaN3， pH7.5)混合，室溫反 應2小時后，4'C過夜。
3、 反應液通過蠕動泵及管路進入500k滲濾膜包(美國PALL公司)， 收集各組分，選擇高分子量組分(通常分子量》免疫球蛋白分子量單體10 倍)作為最后產(chǎn)物。
4、 測定收集液在波長280nm處的紫外吸收，并用熒光分析儀檢測熒光 強度。通過標準曲線插入法計算得出，每個量子點聚合體所偶聯(lián)的免疫球蛋 白分子數(shù)為10 50。熒光光譜法測得熒光量子效率達到70%，免疫分析法 測得配體活性保持在90%。
實施例7
采用聚二甲基硅氧垸(PDMS)制備相互垂直的雙向微流控通道，方法 可參考本發(fā)明人的專利申請文件，申請?zhí)枮镃N200610117234,X。該微通道 與芯片基片通過物理方法進行可逆封合。
1、 將凝血酶、血小板生長因子和免疫球蛋白E等3種蛋白質(zhì)的單克隆 抗體(商購自美國FITZGERALD公司)通過3條同一方向的獨立微流控通 道固定在芯片反應區(qū)，3種抗體的濃度均為150mg/L， 2小時后進行洗漆和 封閉等后處理。
2、 將濃度為20pg/ml、 50pg/ml、 100pg/ml、 200pg/ml和500pg/ml的凝
血酶、血小板生長因子和免疫球蛋白E等3種耙蛋白通過與步驟1中微通道 方向垂直的另一方向的微流控通道進入芯片反應區(qū)域，流動速度為2微升/ 小時，5分鐘后停止進樣。
3、 芯片經(jīng)洗滌后，以與步驟2中同樣的進樣方式將實施例1 3獲得的 同種量子點的聚丙烯酸納米微球分別標記的凝血酶、血小板生長因子和免疫 球蛋白E等3種蛋白質(zhì)的核酸適體的混合液注入芯片反應區(qū)域，5分鐘后停 止進樣。
4、 芯片經(jīng)洗滌后在熒光檢測器(德國ZEISS公司AXIOSKOP2型)下 觀察靶蛋白與信號探針的反應情況，采集各空間分離的反應單元內(nèi)的量子點 信號，應用儀器配套軟件進行信號數(shù)據(jù)處理。
結果如圖1所示，基于水溶性CdTe量子點聚丙烯酸納米微球探針的雙 向微流控蛋白質(zhì)芯片可以實現(xiàn)的耙蛋白檢測最低限為5pg/ml。 實施例8
同實施例7，采用雙向微流控通道的蛋白質(zhì)芯片。
1、 將CA125、 CA19-9和CA15-3等3種蛋白質(zhì)的單克隆抗體(分別與 實施例4 6所采用單克隆抗體配對；商購自美國FITZGERALD公司)通過 3條同一方向的獨立微流控通道固定在芯片反應區(qū)，3種抗體的濃度均為 150mg/L， 2小時后進行洗滌和封閉等后處理。
2、 將濃度為10pg/ml、 20pg/ml、 50pg/ml、 100pg/ml、 200pg/ml的CA125、 CA19-9和CA15-3等3種耙蛋白通過與步驟1中微通道方向交叉的另一方向 的微流控通道進入芯片反應區(qū)域，流動速度為2微升/小時，5分鐘后停止進 樣。
3、 芯片經(jīng)洗滌后，以與步驟2中同樣的進樣方式將實施例4 6所得納 米微球單克隆抗體信號探針混合液注入芯片反應區(qū)域，5分鐘后停止進樣。
4、 芯片經(jīng)洗滌后在熒光檢測器(德國ZEISS公司AXIOSKOP2型)下 觀察靶蛋白與信號探針的反應情況，采集各空間分離的反應單元內(nèi)的量子點
信號，應用儀器配套軟件進行信號數(shù)據(jù)處理。
結果如圖2所示，基于水溶性CdTe/CdS量子點聚丙烯酰胺納米微球探 針的雙向微流控蛋白質(zhì)芯片可以實現(xiàn)的靶蛋白檢測最低限為lpg/ml。
可見，本發(fā)明量子點生物探針作為信號探針的微流控蛋白質(zhì)芯片，其檢 測結果具有較佳的靈敏度。
權利要求
1.一種量子點生物探針，其是量子點納米微球和靶蛋白配體連接而成的量子點-生物復合探針。
2、 如權利要求1所述的量子點生物探針，其特征在于所述的量子點納 米微球為包覆有高分子聚合物的量子點，其中所述的高分子聚合物選自聚丙 烯酸和聚丙烯酰胺，所述的量子點選自CdTe和CdTe/CdS。
3、 如權利要求2所述的量子點生物探針，其特征在于所述的量子點為 水溶性量子點。
4、 如權利要求1所述的量子點生物探針，其特征在于所述的靶蛋白配 體選自免疫球蛋白、抗體片斷、核酸適體、融合蛋白和蛋白質(zhì)復合體中的一 種或幾種。
5、 一種如權利要求1~4任一項所述的量子點生物探針的制備方法，其 包括將量子點納米微球和靶蛋白配體進行偶聯(lián)反應，并將偶聯(lián)產(chǎn)物進行純 化，最終偶聯(lián)產(chǎn)物中1分子量子點能帶上10 200個分子的靶蛋白配體。
6、 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的偶聯(lián)反應中還可 采用偶聯(lián)劑。
7、 如權利要求6所述的制備方法，其特征在于所述的偶聯(lián)劑為碳化二 亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺。
8、 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的純化采用離心、 超濾或滲濾的方法。
9、 一種微流控蛋白質(zhì)芯片，其包括靶蛋白、捕獲探針和信號探針，其 特征在于所述的信號探針采用如權利要求1~4任一項所述的量子點生物探 針。
10、 如權利要求9所述的微流控蛋白質(zhì)芯片，其特征在于所述的微流控 蛋白質(zhì)芯片為雙向微流控蛋白質(zhì)芯片，其中不同靶蛋白所對應的作為信號探 針的生物探針帶有相同熒光光譜的量子點納米微球。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種量子點生物探針及其制備方法。該生物探針是由高分子聚合物包覆量子點形成的量子點納米微球和靶蛋白配體通過偶聯(lián)反應連接而成的量子點-生物復合探針。本發(fā)明還提供采用上述量子點-生物復合探針作為信號探針(檢測探針)的微流控蛋白質(zhì)芯片。本發(fā)明采用量子點納米微球，它不僅較單純的量子點具有更高的量子效率，而且物化性質(zhì)更加穩(wěn)定，與生物分子的相容性更佳，非常適合在蛋白質(zhì)芯片中的應用，大大提高了芯片的靈敏度。
文檔編號G01N33/566GK101368943SQ20071004488
公開日2009年2月18日 申請日期2007年8月15日 優(yōu)先權日2007年8月15日
發(fā)明者耀 何, 宋世平, 樊春海, 汪聯(lián)輝, 娟 顏, 維 黃 申請人:蘇州市長三角系統(tǒng)生物交叉科學研究院有限公司