專利名稱：：一種血清小分子代謝產(chǎn)物的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分析化學和醫(yī)學領(lǐng)域，是一種血清小分子代謝產(chǎn)物檢測方法。
背景技術(shù)：
：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(Gaschromatography/Massspectrometry,GC/MS)最早發(fā)明于上世紀六十年代，結(jié)合了氣相色譜儀的高效分離能力與質(zhì)譜儀的快速、高靈敏度檢測、高鑒別分子結(jié)構(gòu)的能力，迄今已經(jīng)是一項非常成熟和穩(wěn)定的化學分析技術(shù)。其工作的原理是多組分混合物樣品經(jīng)過色譜柱分離(可以通過化學衍生化的方法使混合物更容易分離)，得到各個單一組分，按保留時間順序隨同載氣逐一進入質(zhì)譜儀的離子源，單組分樣品被電離成碎片(離子)，經(jīng)質(zhì)量分析器和檢測器檢測，可給出單一組分的質(zhì)譜圖，根據(jù)對所得質(zhì)譜圖進行計算機檢索的結(jié)果，對這些單一組分進行定性、定量分析。儀器檢測物質(zhì)的質(zhì)量范圍廣，測定質(zhì)量范圍為質(zhì)荷比(m/z)10900。物質(zhì)衍生化后分子量增加也可被充分測定。當今，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀已經(jīng)普遍應(yīng)用于環(huán)保、食品、石油化工、輕工、農(nóng)藥等各個領(lǐng)域中，在醫(yī)學領(lǐng)域，主要用于醫(yī)藥、法醫(yī)、毒品和興奮劑的檢測分析，在人體代謝組學領(lǐng)域的應(yīng)用也日趨廣泛。我國上海交通大學、北京大學都應(yīng)用了該項技術(shù)對動物疾病模型的血液或尿液進行代謝組學的研究。國外有人成功地探討了如何對人體血清用化學衍生化氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測血清中的小分子代謝產(chǎn)物，進行代謝組學研究。我國浙江大學利用該技術(shù)進行了肝衰竭病人的血清代謝組學研究。但是，目前尚無采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測肝癌患者血清特異小分子代謝峰的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種操作方便、敏感性好、準確度高的血清小分子代謝產(chǎn)物檢測方法。本發(fā)明提供了一種血清小分子代謝產(chǎn)物的檢測方法，該方法包括以下步驟(1)對血清樣本進行蛋白沉淀和小分子代謝產(chǎn)物的萃??；(2)對萃取物進行衍生化；(3)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對上述衍生化產(chǎn)物進行分離和鑒定，獲得各小分子代謝產(chǎn)物圖譜；(4)計算各小分子代謝產(chǎn)物指紋圖譜的峰面積數(shù)據(jù)，并用判別方程檢測結(jié)果。本發(fā)明中，(2)中采用甲氧胺吡啶溶液和N-甲基-N-(三甲基硅垸)三氟乙酰胺含1X三甲基氯硅烷(N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺含1%三甲基氯硅垸，是德國sigma公司生產(chǎn)的衍生化試劑，買來的成品就是混合物，其中二者的體積比99:1)這二種衍生化試劑依次進行二步衍生化。本發(fā)明中，將圖譜峰面積按判別方程相加得到Zl和Z2的值；Zl的判別方程式為Zl=-67.60609+152.91327*峰84-19.26355*峰31-35.97298*峰76+58.68575*峰18-2.68238*峰30-114.53660*峰14+31.99892*峰28-67.37426*峰81+22.88033*峰62-19.31615*峰43+122.83181*峰4-82.09541*峰87-57.71720*峰2+38.14089*峰22-7.57512*峰91;Z2=_6.07158+32.34580*峰84-3.52482*峰31-4.80436*峰76+9.69755*峰18-0.56240*峰30-16.88349*峰14+5.01229*峰28-5.98591*峰81+3.84596*峰62-2.06431*峰43+16.92177*峰4-11.38467*峰87-5.45394*峰2+5.14309*峰22-2.09113*峰91;其中，峰84、峰31、峰76、峰18、峰30、峰14、峰28、峰81、峰62、峰43、峰4、峰87、峰2、峰22、峰91分別代表各圖譜峰的峰面積，峰后面的數(shù)字代表該峰的出峰序號。"*"表示乘法。本發(fā)明中，色質(zhì)譜條件為進樣口溫度200-30CTC，柱箱起始溫度40-100。C，以1-20°C/min升至300°C，保持5-20min;惰性氣體作為載氣，流速0.5-5.Oml/min;四級桿溫度120-180°C，離子源溫度200_280°C;溶劑切除時間0-5min。本發(fā)明中，所述惰性氣體可以是氦氣。另一方面，本發(fā)明提供了上述方法在鑒別小分子代謝產(chǎn)物變異中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述方法在鑒別肝癌患者中的應(yīng)用。本發(fā)明中，Z1值小于Z2值者為肝癌患者的代謝檢測結(jié)果。本發(fā)明中，小分子代謝產(chǎn)物與保留時間、圖譜峰對應(yīng)關(guān)系如下:編號保留時間物質(zhì)名稱編號保留時間物質(zhì)名稱<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，可檢測疾病患者血清小分子代謝產(chǎn)物指紋峰值，尤其如檢測肝癌患者和健康人血清的小分子代謝產(chǎn)物譜，利用現(xiàn)有統(tǒng)計工具分析肝癌與正常人血清小分子代謝產(chǎn)物的不同之處，篩選出有強鑒別能力的峰群，利用現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建判別方程，用于了解小分子代謝產(chǎn)物的成分和含量，以便診斷肝癌。本發(fā)明將肝癌、正常人空腹血清進行蛋白沉淀、溶劑萃取、衍生化后，通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(如美國安捷倫公司生產(chǎn))檢測，得到血清完整的小分子代謝譜，對其中所有小分子代謝產(chǎn)物進行定性、定量(峰面積計算)，再根據(jù)統(tǒng)計分析篩選出可以鑒別肝癌患者和正常人并且鑒別能力強的特異峰群，由現(xiàn)有的統(tǒng)計軟件構(gòu)建判別方程。利用判別方程，只要將受檢人血清中相應(yīng)特異代謝峰的峰面積代入，就可以用于肝癌的診斷。本發(fā)明提出的用于診斷肝癌的血清小分子代謝圖譜模型的制備方法具體如下1)收集多例經(jīng)病理明確診斷的肝癌患者空腹血清及經(jīng)體檢確定為健康者的儲存于一80'C冰箱冷凍備用。檢測時融解冰凍血清，混勻。2)采用甲醇去離子水溶液(v/v8:1)對上述肝癌患者和正常人的兩組血清標本進行蛋白沉淀和小分子代謝產(chǎn)物的萃??；3)對萃取物用甲氧胺吡啶溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)含1%三甲基氯硅烷(TMCS)二種衍生化試劑依次進行二步衍生化；4)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國安捷倫公司，型號6980/5973)對上述衍生化產(chǎn)物進行分離和鑒定，獲得兩組小分子代謝產(chǎn)物圖譜；色譜條件進樣口溫度250。C，柱箱起始溫度80°C，以15。CAiin升至30(TC，保持5min。氦氣作為載氣，流速lml/min。四級桿溫度150°C，離子源溫度230°C。溶劑切除時間3min;5)收集肝癌患者和正常人血清的小分子代謝產(chǎn)物指紋圖譜的所有峰面積數(shù)據(jù)；6)對所得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，根據(jù)處理結(jié)果可篩選出15個有強判別能力的特異峰群，包括丁酸、乙亞胺酸、丙三醇、纈氮酸、異亮氨酸、氨基丙二酸、赤鮮糖、棕櫚酸、硬脂酸、9,12-十八碳二烯酸(亞油酸)、二乙基己基鄰苯二甲酸酯，還有的為目前庫譜尚不能檢索出來的物質(zhì)。將這15個物質(zhì)作為判別肝癌患者和正常人的特異峰；7)選取上述15個特異峰構(gòu)建判別方程，判別肝癌組和正常組。本發(fā)明提供了一種準確了解樣品中特定小分子代謝產(chǎn)物的組分及含量的檢測方法，該方法具有高度的敏感性和特異性，可以用于精確了解某一種小分子代謝產(chǎn)物的含量，鑒定癌癥患者，特別適用于鑒別肝癌患者。利用本技術(shù)可以對肝癌患者與正常人，尤其是AFP陰性的肝癌患者進行鑒別診斷，也可用于肝癌的普查，對于早期診斷、早期治療肝癌，提高肝癌患者的生存率有著重要的意義。本發(fā)明用于肝癌的早期檢測和篩査，與肝癌其他的診斷方法比較，具有以下優(yōu)點第一、本發(fā)明采用化學衍生化、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法對肝癌患者和正常人的血清進行檢測，篩選出來的具有強判別能力的肝癌患者與正常人具有差異的小分子代謝產(chǎn)物峰群構(gòu)建的判別模型是肝癌早期檢測和篩査的新方法，為進一步發(fā)現(xiàn)新概念的肝癌生物標記物提供了基礎(chǔ)；第二、與以往的血清學檢測方法比較具有高度的敏感性(100%)和特異性(100%)，是一種在小分子代謝產(chǎn)物水平上的診斷，對肝癌的早期診斷提供了新標準；第三、本發(fā)明模型的構(gòu)建方法設(shè)計合理可行，為降低我國肝癌的病死率、提高肝癌的生存率提供了一種新的篩査方法；第四、應(yīng)用支持向量機對本實驗構(gòu)建的判別模型進行交叉驗證，得到其判別有效率為75%。圖1為隨機抽取的正常人的小分子代謝產(chǎn)物TIC圖。縱坐標為出峰的豐度；橫坐標為出峰的保留時間。圖2為隨機抽取的肝癌患者的小分子代謝產(chǎn)物TIC圖。圖3為衍生化樣本1(重復(fù)試驗l)的TIC圖。圖4為衍生化樣本2(重復(fù)試驗2)的TIC圖。圖5為衍生化樣本3(重復(fù)試驗3)的TIC圖。圖6為衍生化樣本4(重復(fù)試驗4)的TIC圖。圖7為衍生化樣本5(重復(fù)試驗5)的TIC圖。圖8為衍生化樣本6(重復(fù)試驗6)的TIC圖。圖9為區(qū)分肝癌病人和正常人的判別模式圖(決策樹)。具體實施例方式實施例1小分子代謝物質(zhì)的檢測1.材料1.l檢測血清取受檢者清晨空腹靜脈血0.5mL，在4'C冰箱靜置lh后離心(3000rpm，10min)。取血清，裝入Eppendorf管(每管內(nèi)100uL)，置深低溫冰箱(一80°C)保存，備用。1.2所需主要試劑甲醇(農(nóng)殘級)美國Sigma公司鹽酸甲氧胺(分析純)美國Sigma公司N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)含1%三甲基氯硅垸(TMCS)(分析純)美國Sigma公司吡啶(分析純)美國Sigma公司1.3所需主要儀器4"C冰箱海爾公司一80。C冰箱Revco公司恒溫高速臺式離心機(型號Z400K):HERMLE公司烘箱(型號FD):Binder公司加樣器Eppendorf公司純水系統(tǒng)Millipore公司第U冰機Scotsman公司電子天平(BD202):METTLERTOLEDO公司渦旋混合儀(型號H101):上?？岛坦怆妰x器有限公司超聲混合儀(型號DL—120A):上海之信儀器有限公司高效樣品濃縮儀(型號NS—2A):上海強運科技有限公司氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(型號6980/5973):安捷倫公司2.方法2.l試劑配置甲氧胺吡啶溶液鹽酸甲氧胺1.5gP比啶100mL振蕩、超聲混勻，密封膜密封瓶蓋，置于4'C保存。2.2血清樣品準備(1)每個樣本從深低溫冰箱中取出一管血清，放入烘箱(37°C)10min;(2)從烘箱中取出融解的血清，置于渦旋混合儀上混勻15s。2.3蛋白沉淀和溶劑萃取(1)每管(100yL)血清內(nèi)加入lOOuL去離子水、800yL甲醇，置于渦旋混勻儀上混勻10min;(2)冰浴10min，放入超聲混勻儀內(nèi)超聲混勻5min，繼續(xù)冰浴10min;(3)放入恒溫高速臺式離心機中，4度12000rpm離心10min;(4)取上清液800uL放入安剖瓶中，置于高效樣品濃縮儀上，室溫下用氮氣吹干。2.4衍生化反應(yīng)(1)每個安剖瓶內(nèi)加入400uL甲氧胺吡啶溶液(濃度15ug/uL)，火焰上灌封，渦旋混合儀上混勻10min，放入37度烘箱10h后取出，置于高效樣品濃縮儀上，室溫下用氮氣吹干；(2)加入400uLMSTFA含1%TMCS，火焰上灌封，渦旋混合儀上混勻10min，放入120度烘箱1.5h;(3)取出，室溫冷卻，待GC/MS上樣。2.5GC/MS檢測(1)取1PL衍生化樣本，無分流進樣；(2)色譜條件進樣口溫度250'C柱箱升溫程序起始溫度8(TC，以15'C/min升至30(TC，保持5min載氣氦氣，流速lml/min，四級桿溫度150°C，離子源溫度230°C，溶劑切除時間3min;(3)保存每個樣本的總離子流色譜圖(totalionschromatogram，TIC)，如圖1-圖2;(4)對TIC中的每個峰進行NIST譜庫的査詢，鑒定該峰為何物質(zhì)，并對出現(xiàn)的峰進行手動峰面積積分；由此，獲得樣品中各小分子物質(zhì)的成分和含量。實施例2血清樣品重復(fù)性和進樣準確性分析(1)取同一份血樣的三管血清，重復(fù)上述實驗步驟，得到的TIC圖重疊性咼；(2)取一份衍生化后的樣本，連續(xù)重復(fù)6次進樣，得到的TIC圖重疊性高，出峰的保留時間、峰面積差異小(圖3-圖8)。實施例3用于鑒別肝癌患者和非肝癌患者人群采用SAS8.0統(tǒng)計軟件，選用逐步判別分析法篩選可以鑒別二組的特征峰(15個，包括丁酸、乙亞胺酸、丙三醇、纈氨酸、異亮氨酸、氨基丙二酸、赤鮮糖、棕櫚酸、硬脂酸、9,12-十八碳二烯酸、二乙基己基鄰苯二甲酸酯，還有的為目前庫譜尚不能檢索出來的物質(zhì))，用所得的峰構(gòu)建判別方程Zl=-67.60609+152.91327PEAK84-19.26355PEAK31-35.97298PEAK76+58.68575PEAK18-2.68238PEAK30-114.53660PEAK14+31.99892PEAK28-67.37426PEAK81+22.88033PEAK62-19.31615PEAK43+122.83181P隱4-82.09541PEAK87-57.71720PEAK2+38.14089PEAK22-7.57512PEAK91;Z2=-6.07158+32.34580PEAK84-3.52482PEAK31-4.80436PEAK76+9.69755PEM18-0.56240PEAK30-16.88349PEAK14+5.01229PEAK28-5.98591PEAK81+3.84596PEAK62-2.06431PEAK43+16.92177PEAK4-11.38467PEAK87-5.45394PEAK2+5.14309PEAK22-2.09113PEAK91(其中PEAK代表的是峰面積，PE線后面的數(shù)字代表的是該峰的序號)，采用LIBSVM軟件對判別模式進行支持向量機k-折交叉驗證(k=20)。結(jié)果分析使用SAS8.O統(tǒng)計軟件對受檢者血清小分子代謝產(chǎn)物譜進行分析，得到能夠判斷肝癌的特征小分子代謝產(chǎn)物群，可用于肝癌的診斷。本發(fā)明方法判別結(jié)果匯總表如下:實際組別判別為正常組判別為腫瘤組判別有效率的百分比的百分比正常組100%0%100%腫瘤組0%100%100%權(quán)利要求1.一種血清小分子代謝產(chǎn)物的檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)對血清樣本進行蛋白沉淀和小分子代謝產(chǎn)物的萃??；(2)對萃取物進行衍生化；(3)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對上述衍生化產(chǎn)物進行分離和鑒定，獲得各小分子代謝產(chǎn)物圖譜；(4)計算各小分子代謝產(chǎn)物指紋圖譜的峰面積數(shù)據(jù)，并用判別方程檢測結(jié)果。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，(2)中采用甲氧胺吡啶溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺含1%三甲基氯硅烷這二種衍生化試劑依次進行二步衍生化。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，將圖譜峰面積按判別方程相加得到Zl和Z2的值；Zl的判別方程式為Zl=-67.60609+152.91327*峰84-19.26355*峰31-35.97298*峰76+58.68575*峰18-2.68238*峰30-114.53660*峰14+31.99892*峰28-67.37426*峰81+22.88033*峰62-19.31615*峰43+122.83181*峰4-82.09541*峰87-57.71720*峰2+38.14089*峰22-7.57512*峰91;Z2=_6.07158+32.34580*峰84-3.52482*峰31-4.80436*峰76+9.69755*峰18-0.56240*峰30-16.88349*峰14+5.01229*峰28-5.98591*峰81+3.84596*峰62-2.06431*峰43+16.92177*峰4-11.38467*峰87-5.45394*峰2+5.14309*峰22-2.09113*峰91;其中，峰84、峰31、峰76、峰18、峰30、峰14、峰28、峰81、峰62、峰43、峰4、峰87、峰2、峰22、峰91分別代表各圖譜峰的峰面積，峰后面的數(shù)字代表該峰的出峰序號。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，色質(zhì)譜條件為進樣口溫度200-300。C，柱箱起始溫度40-100。C，以1-20。C/min升至300。C，保持5-20min;惰性氣體作為載氣，流速0.5-5.Oml/min;四級桿溫度120-180。C，離子源溫度200-280°C;溶劑切除時間0-5min。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，惰性氣體為氦氣。6.如權(quán)利要求1所述方法在鑒別小分子代謝產(chǎn)物變異中的應(yīng)用。7.如權(quán)利要求l所述方法在鑒別肝癌患者中的應(yīng)用。8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，Z1值小于Z2值者為肝癌患者的代謝檢測結(jié)果。全文摘要本發(fā)明涉及分析化學和醫(yī)學領(lǐng)域，是一種血清小分子代謝產(chǎn)物檢測方法。本發(fā)明提供了一種準確了解樣品中特定小分子代謝產(chǎn)物的組分及含量的檢測方法，即首先對人血清樣本進行蛋白沉淀和小分子代謝產(chǎn)物的萃取并衍生化，然后用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對上述衍生化產(chǎn)物進行分離和鑒定，獲得各小分子代謝產(chǎn)物圖譜；最后計算各小分子代謝產(chǎn)物指紋圖譜的峰面積數(shù)據(jù)，并用判別方程檢測結(jié)果。本發(fā)明的方法具有高度的敏感性和特異性，可以用于精確了解某一種小分子代謝產(chǎn)物的含量，鑒定癌癥患者，特別適用于鑒別肝癌患者。文檔編號G01N1/28GK101122600SQ200710044918公開日2008年2月13日申請日期2007年8月16日優(yōu)先權(quán)日2007年8月16日發(fā)明者沈錫中,玲董,薛如意,鄧春暉申請人:復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院;復(fù)旦大學