專利名稱：一種采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)檢測探針的電化學(xué)dna檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因雜交檢測領(lǐng)域，具體涉及一種采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)檢測探針 的電化學(xué)DNA檢測方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
基因(DNA)檢測和分析在很多方面都有巨大的潛在用途，例如人 類疾病診斷和食品中病原體檢測。分子信標(molecular beacon, MB)檢測是19%年Tyagi等根據(jù)熒光共 振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，以定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)為 基礎(chǔ)而設(shè)計的分子生物學(xué)檢測方法。分子信標是一段具有特殊結(jié)構(gòu)的單鏈 DNA探針，其兩端分別含有一段特定長度的莖，兩端的莖可以互補配對， 而中間環(huán)結(jié)構(gòu)與靶向DNA (脫氧核糖核苷酸)互補，當耙分子不存在或不 能完全互補時，分子信標呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)。當有靶分子存在時，分子信標的環(huán) 序列與靶分子特異性結(jié)合，形成更穩(wěn)定的雙鏈體。美國專利US20050221329A1公開了 Peter H.key等人的研究他們設(shè) 計了一段分子信標探針，在這種探針的一端修飾有熒光基團，另一端修飾 有淬滅基團，當沒有和中間環(huán)區(qū)域互補的耙向DNA存在時，分子信標探 針兩端的莖互補配對，自身形成環(huán)狀的結(jié)構(gòu)，使熒光基團和淬滅基團之間 的距離足夠小，熒光基團的熒光被淬滅基團淬滅；當有耙向DNA存在時， 分子信標和靶向DNA雜交形成支鏈結(jié)構(gòu)，熒光基團和淬滅基團之間的距 離拉大，熒光基團發(fā)出可以被檢測到的熒光。由于含有甲基化結(jié)構(gòu)的靶向 DNA和正常的DNA在分子信標雜交之后Tm值不同，通過改變雜交溫度 條件，就可以找到一個解鏈溫度，使得正常DNA已經(jīng)和分子信標分開，而甲基化的靶向DNA仍然和分子信標保持雜交狀態(tài)。歐洲專利EP1669464公開了 Inouye等人的研究他們采用一種特殊的 分子信標探針，在這種探針兩端都修飾有芘基，當分子信標探針和靶雜交 之后，形成支鏈結(jié)構(gòu)，這時兩端的熒光基團互相遠離，發(fā)出的熒光是單體 的熒光；當分子信標沒有和靶向DNA雜交的時候，兩端環(huán)區(qū)域互補形成 環(huán)狀結(jié)構(gòu)，兩端的芘基靠近形成激發(fā)態(tài)二聚體，這時熒光特性和單體明顯 不同，通過檢測熒光的變化就可以檢測靶向DNA的存在。作者還證明了 用這種方法可以靈敏檢測SNP (單堿基多態(tài)性)。對于DNA檢測，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針比直鏈探針在很多方面都有明顯的 優(yōu)勢，最明顯的優(yōu)勢就是無需對靶向DNA進行任何標記，而且莖環(huán)探針 可以用于靈敏的單堿基錯配檢測。因此莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針很早就被用于溶液相 的DNA檢測，例如實時定量PCR (聚合酶鏈式反應(yīng))、單核苷酸多態(tài) 性和突變的檢測、病原體鑒定、原位熒光雜交。也有科學(xué)家將莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針固定在表面上應(yīng)用于生物傳感器的研 發(fā)。但是表面固定化的莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針檢測時的信噪比一直比在溶液中要低。2003年P(guān)NAS報道了一個新的電化學(xué)DNA檢測方法(Chunhai Fan, Kevin W. Plaxco， and Alan J. Heeger， PNAS (100): 9134-9137, August 5， 2003 )，他們將一端修飾二茂鐵基團的莖環(huán)結(jié)構(gòu)檢測探針固定在電極表面， 當沒有和探針環(huán)序列互補的靶向DNA時，探針自身形成兩端互補的環(huán)形 結(jié)構(gòu)，因此另一端的二茂鐵基團被拉近工作電極表面并產(chǎn)生一個可以被感 知的氧化還原電流，當有靶向DNA存在時，探針和靶向DNA雜交，形成 直線狀的雙鏈結(jié)構(gòu)，二茂鐵基團和工作電極表面分離，從而增大了二茂鐵 和電極表面的距離，阻礙了電子傳遞，氧化還原電流明顯減小，這種傳感 器成功的將DNA的檢測限降低到30pM，在靈敏度方面有了很大的提高， 但是這種傳感器是"signal-off"傳感器，這種傳感器和"signal-on"傳感 器相比，更容易受假陽性信號的影響。2005年Nucleic Acids Research報道了 Benjamin Bockisch等科學(xué)家的 研究成果(NudeicAcidsResearch,2005, Vol. 33，No. 11)，他們在莖環(huán)結(jié) 構(gòu)探針的一端修飾特定基團，用于將探針固定在基底表面，而探針另一段 修飾有親和性的基團，用來捕獲信號標記分子，雜交之前探針形成莖環(huán)結(jié) 構(gòu)，親和基團被拉近到基底表面，使得親和基團受到空間保護作用，不能 捕獲信號標記分子；當雜交之后探針形成支鏈構(gòu)型的雙鏈結(jié)構(gòu)，親和集團 離開基底表面，從而可以特異性的捕獲信號標記分子，可以提供可感知的 比色分析信號。該方法可以檢測到10pM目標DNA，并且有很好的區(qū)分單 堿基錯配的能力。這種方法是"signal on"體系，很好的避免了假陽性信 號的影響，但是這種方法是采用酶催化之后的比色法檢測，靈敏度受到一 定的限制。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就在于結(jié)合酶催化的高效、特異和電化學(xué)檢 測迅速、靈敏、操作簡便的特點，提供一種以固定在電極表面的莖環(huán)結(jié)構(gòu) DNA序列為檢測探針，對目標DNA (靶向DNA)序列進行檢測的方法， 從而克服現(xiàn)有DNA檢測技術(shù)的缺陷，實現(xiàn)無標記，高靈敏度，操作簡便， 檢測迅速，多樣品同時檢測的電化學(xué)DNA檢測。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題在于提供一種相應(yīng)的采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)檢 測探針的電化學(xué)DNA檢測試劑盒，該試劑盒采用上述方法檢測DNA。表面固定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的檢測探針在生物傳感器領(lǐng)域得到很多的應(yīng)用，但 是檢測限的提高卻是急需解決的問題。本發(fā)明人利用生物素和親和素之間 親和力強的優(yōu)點，將修飾有生物素的莖環(huán)結(jié)構(gòu)檢測探針組裝到固定有親和 素的電化學(xué)芯片的工作電極表面，發(fā)現(xiàn)這種電極具有表面檢測探針密度高， 本底電流小的特點，可大大提高檢測信噪比。本發(fā)明人采用能催化氧化還 原反應(yīng)的酶，催化其底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，例如采用辣根過氧化物酶(HRP酶)催化TMB (鄰二甲基對二氨基聯(lián)苯)和雙氧水之間的氧化反 應(yīng)，發(fā)現(xiàn)酶催化效率高，特異性好，有利于分析方法的提高。本發(fā)明人還 發(fā)現(xiàn)電化學(xué)檢測DNA的方法靈敏度高，成本低，操作簡便，具有開發(fā)便 攜式檢測儀器的潛力。因此，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為 一種采用莖環(huán) 結(jié)構(gòu)檢測探針的電化學(xué)DNA檢測方法，包括以下步驟1) 將含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA檢測探針的一端結(jié)合于電化學(xué)裝置的工作電極表面；2) 將耙向DNA與上述的DNA檢測探針進行雜交反應(yīng)；3) 加入能催化氧化還原反應(yīng)的酶，使其連接于DNA檢測探針的游離4山頓；4) 加入步驟3)所述的酶催化反應(yīng)的底物，進行電化學(xué)檢測分析。 優(yōu)選的，本發(fā)明步驟1)中所述的電化學(xué)裝置可以是多通道的電化學(xué)芯片，較佳的是裸金(bare gold)芯片，更優(yōu)選的可以為現(xiàn)有的16通道的 裸金芯片。通常，金電極上DNA檢測探針的組裝是使用巰基和金之間的金硫鍵， 如采用修飾有巰基的DNA檢測探針，與金電極結(jié)合。本發(fā)明為加強結(jié)合 力，提高特異性，較佳地，所述的DNA檢測探針的一端可以通過鏈霉親 和素與生物素的親和作用結(jié)合于該裸金芯片的工作電極表面。由于組裝有生物素分子的DNA檢測探針易購得，本發(fā)明可以相應(yīng)地 在該裸金芯片，特別是工作電極表面上組裝鏈霉親和素分子。更佳的，本發(fā)明可以通過多步化學(xué)結(jié)合作用在所述的裸金芯片上組裝 鏈霉親和素分子，步驟包括a)在裸金芯片工作電極表面滴加巰基和羥基/羧基之間碳鏈長度相同的巰基au醇和巰基<:6. 酸的混合溶液，禾U用金和巰基之間的特異性結(jié)合，可以將巰基C6.u酸組裝在工作電極表面，巰基 C6.u醇共組裝可以調(diào)控巰基C6. 酸的組裝密度，更有利于后續(xù)組裝步驟；b ) 然后滴力卩 EDC[l-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，EDC.HCI]和 NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)的混合溶液，然后加入修飾有氨基的生物 素，禾IJ用氨基和羧基在EDC和NHS活化的條件下的特異性結(jié)合，可以將 修飾有氨基的生物素固定在電極表面，超純水沖洗，氮氣吹干；c)最后加入鏈霉親和素，利用生物素和親和素的特異性結(jié)合，可以將 親和素固定在電極表面上，而且一個親和素分子一共有4個可以結(jié)合生物 素的活性位點，剩余的活性位點可以用來結(jié)合檢測探針上的修飾的生物素。當然，如果檢測探針上修飾的生物素帶有氨基，也可以將其與步驟a) 中巰基修飾的電極直接結(jié)合，但是這種結(jié)合力不如親和素和生物素的結(jié)合 力；而且步驟a)的電極穩(wěn)定性不如步驟c)中組裝有親和素的電極。優(yōu)選的，步驟a)中所述的巰基Q，u醇和巰基C6-u酸的終摩爾濃度可 以是4:1 2:1。更優(yōu)選的，所述的巰基C6. 醇和巰基C6.n酸可分別是巰基十一醇(巰 基Cu醇)和巰基十一酸(巰基Cn酸)，兩者的終摩爾濃度是3.-l。優(yōu)選的，步驟b)中所述的EDC和NHS的終摩爾濃度比例可以是 6:1 2:1，更優(yōu)選的是4:1。如上所述的表面連接好鏈霉親和素的芯片且稱為鏈霉親和素芯片。如 果不馬上使用，可選擇地，本發(fā)明所述的鏈霉親和素芯片，可在氮氣(或 者其他惰性氣體)環(huán)境中保護，在低于4'C的干燥環(huán)境中可保存不超過一 個月。優(yōu)選的，步驟3)中所述的DNA檢測探針的游離端和能催化氧化還原 反應(yīng)的酶可以分別修飾能特異性結(jié)合的基團，通過該基團之間的特異性結(jié) 合來連接。例如，DNA檢測探針的游離端可修飾有地高辛(Digoxigenin) 或熒光素分子，而酶可以連接抗地高辛或抗熒光素分子，通過地高辛分子 與抗地高辛分子或者熒光素與抗熒光素分子的結(jié)合連接酶和DNA檢測探針的游離端。根據(jù)本發(fā)明，步驟3)中所述的能催化氧化還原反應(yīng)的酶可以包括辣 根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶等氧化還原酶，但不限于此。本發(fā)明優(yōu)選的 是辣根過氧化物酶，而步驟4)中所述的催化反應(yīng)的底物可以是TMB和雙 氧水，但不限于此；還可以是其他的底物，如ABTS[ (2，2-連氮-雙-(3-乙 基苯并噻唑-6-磺酸))]或變色酸2R (CT2R)等。高價態(tài)的TMB在電極表 面得到電子被還原，從而產(chǎn)生可感知的電流信號。進而可以對待測樣品中 的目標DNA序列進行檢測分析。優(yōu)選的，本發(fā)明可以使用含有0.1M 0.2M NaCl的低鹽濃度的緩沖溶 液配制抗地高辛分子標記的辣根過氧化物酶復(fù)合物溶液，并且加入 0.5%~5%(w/v， g/ml)低濃度的小分子蛋白，如酪蛋白、胎牛血清或羊血清 等封閉劑，以封閉抗地高辛標記的辣根過氧化物酶復(fù)合物在一些空白位點 上的非特異性吸附。優(yōu)選的，低鹽濃度的緩沖溶液可以是低鹽PBS緩沖溶 液(100mMPBS): 100mMNaCl， O.IMPB， pH7.0。優(yōu)選的，步驟1)中所述的檢測探針可以用0.5M 1.5MNaCl的高鹽濃 度的緩沖液配制，如0.1MPB， pH7.0 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS);并在 步驟2)中與靶向DNA雜交結(jié)合，雜交完成后在4'C 1(TC下靜置，使未 和靶向DNA雜交的DNA檢測探針形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。高鹽濃度和低溫環(huán)境更 加有利于使沒有和靶向DNA雜交結(jié)合的檢測探針形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。檢測探 針的游離端修飾著能特異性結(jié)合酶的親和基團，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)后，親和基 團被拉近到基底表面，由于受到空間保護作用，不能與酶結(jié)合，從而可以 降低檢測本底值。更優(yōu)選的，所述的高鹽濃度的緩沖液可以是1 mol/LNaCl的上述磷酸 鹽緩沖液(PBS)。優(yōu)選的，在每一步反應(yīng)結(jié)束后可以用洗液洗去反應(yīng)體系中的游離物， 所用的洗液在步驟2)中待測DNA溶液(靶向DNA)與檢測探針雜交反應(yīng)后至步驟3)加酶之前為0.1M 0.2MNaCl的低鹽濃度的洗液，在其余的 反應(yīng)中為超純水，洗完后都用氮氣吹干。因為用水沖洗可能會破壞DNA 的雜交配對結(jié)合，更可能會破壞檢測探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。所以雜交之前都用 水清洗，而雜交后的步驟采用低鹽濃度的洗液清洗以防止破壞雜交。但加 酶之后可以用水清洗，因為這時候地高辛和抗地高辛的結(jié)合作用已經(jīng)完成， 溶液中游離的酶會被水沖洗掉，所以檢測探針和靶DNA的雜交以及莖環(huán) 結(jié)構(gòu)是否被破壞都不會影響檢測結(jié)果。更優(yōu)選的，所述的低鹽濃度的洗液可以為100mM NaCl， 0.1% (v/v) tween (吐溫)，0.01 MPB， pH7.0~7.4的PBS。本發(fā)明還提供了一種采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)檢測探針的電化學(xué)DNA檢測試劑 盒，該試劑盒包括1) 工作電極上組裝有鏈霉親和素分子的電化學(xué)芯片，2) 兩端分別標記有生物素和地高辛的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA檢測探針，3) 高鹽濃度的磷酸鹽緩沖液以及低鹽濃度的洗液，4) 標記抗地高辛的辣根過氧化物酶，5) 辣根過氧化物酶催化反應(yīng)的底物。優(yōu)選的，所述的電化學(xué)芯片可以是裸金芯片，該裸金芯片表面組裝上 鏈霉親和素分子的方法可如上所述。優(yōu)選的，該試劑盒中的辣根過氧化物 酶催化反應(yīng)的底物可以是TMB和雙氧水；高鹽濃度的磷酸鹽緩沖液可以 是0.5M 1.5MNaCl、優(yōu)選lmol/LNaCl的0.1 MPB， pH7.0 7.4的磷酸鹽 緩沖液；低鹽濃度的洗液可以是加有0.1M 0.2M NaCl、優(yōu)選為100mM NaCl, 0.1°/。(v/v)tween， 0.01MPB, pH7.0 7.4的磷酸鹽緩沖液。綜上所述，本發(fā)明檢測方法，或采用試劑盒工作的較佳實施例的技術(shù) 原理如下-首先通過金巰鍵、羧氨鍵以及生物素和親和素的高特異性的結(jié)合作用， 在裸金芯片上固定一層活性的親和素。然后，再在親和素上固定生物素標記的檢測探針，并在高鹽、低溫的 條件下使檢測探針形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而使檢測探針另一端標記的地高辛被 拉近到裸金芯片表面，處于空間構(gòu)型的保護作用之下，失去反應(yīng)的活性。加入檢測樣品(耙向DNA)之后，雜交條件下，只有靶向DNA才能和檢 測探針互補配對結(jié)合，形成直線型的雙鏈，標記在檢測探針游離端的地高 辛失去了空間保護作用，具有了和抗地高辛修飾的辣根過氧化物酶結(jié)合能 力。這時加入抗地高辛修飾的辣根過氧化物酶，檢測探針就可以特異性的 捕獲抗地高辛修飾的辣根過氧化物酶，而游離的酶則被洗去。最后，滴加TMB和雙氧水底物，辣根過氧化物酶可以催化TMB和雙 氧水的電化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生電流信號，可使用現(xiàn)有的電化學(xué)檢測或分析儀進 行電化學(xué)檢測或分析。為進一步理解上述原理，可參見圖l。本發(fā)明采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)檢測探針和多通道的電化學(xué)檢測方法，實現(xiàn)對靶 向DNA的定量檢測。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點1、靈敏 度高。本發(fā)明對DNA的檢測限是10fM，比現(xiàn)有技術(shù)中的檢測限是10pM， 大大提高了檢測的靈敏度，有望達到靶基因無需擴增即可得到檢測的目的； 2、多通道的電化學(xué)檢測方法，操作簡便、迅速，通量高，成本低；3、特 異性高，可用于單堿基錯配的檢測；4、是"signal on"體系，不易受假陽 性信號影響。


圖1是本發(fā)明方法的技術(shù)原理圖。圖2是待測DNA與對應(yīng)的電化學(xué)電流信號大小圖。圖中的待測DNA 依次分別為人工合成的濃度為10pM、 lpM、 O.lpM、 10fM的靶向DNA2， lnM錯配DNA3和lnM非互補任意DNA4。圖3是人工合成的lnM耙向DNA2和lnM非互補任意DNA4對應(yīng)的TMB氧化還原反應(yīng)的循環(huán)伏安圖。圖4是用含有0.1MKC1的0.5mM K3Fe(CN)6溶液標定裸金芯片及修 飾好鏈霉親和素的裸金芯片的結(jié)果對比圖。圖5是本發(fā)明使用的16通道裸金芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施方式
下面用實施例進一步說明本發(fā)明的工作流程和功效，但本發(fā)明并不受 其限制。實施例1 試劑盒包括試驗用16通道電化學(xué)裸金芯片，購自Genefluidics公司，型號-SC1000-16-B，共16組3電極系統(tǒng)，每一組都可以同時進行組裝和檢測， 其中中間的圓形電極是工作電極1，最外面環(huán)形電極是對電極2，最小的方 形電極是參比電極3，參照圖5;檢測探針DNA1:5'曙Digoxigenin-ggccgt TACTCCCTTCCTCCCCGC acggcc國biotin-3';低鹽PBS緩沖溶液(100mMPBS): 100mMNaCl， 0.1MPB， pH7.0;高鹽PBS緩沖溶液(1MPBS): 1MNaCl， 0.1MPB， pH7.0;0.1MMES (2-(N國morpholine)國ethanesulphonicacid， 2- (N-嗎啉)乙磺 酸)緩沖溶液0.1MMES，pH5.0;低鹽濃度的洗液100mM NaCl, 0.1%(v/v) tween， 0.01M PB， pH 7.0~7.4;鏈霉親和素(streptavidin)，購自Promega公司，參考產(chǎn)品說明書使用前 用lOOmM PBS配置成0.5mg/L溶液；EZ-biotin(Biotin-PEO-Amine)，即帶氨基的生物素，購自PIECE公司， 使用前用0.1M MES緩沖液配成5mg/mL溶液；抗地高辛修飾的辣根過氧化物酶(anti-digoxigenin-POD)，購自Roche 公司，參考產(chǎn)品說明書使用前用lOOmM PBS稀釋成500mU/mL anti-digoxigenin-POD，并添加0.5% (w/v)酪蛋白(casein)封閉非特異性位 點；TMB底物(TMB substrate Low activity)，購自NEOGEN公司，其中 含有TMB和雙氧水。待檢測的目的DNA為耙向DNA2:GTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATA。本發(fā)明的檢測步驟如下，其流程如圖1所示。第一步制備鏈霉親和素芯片。試驗前以無水乙醇為溶劑配制2mM的ll-巰基H"—酸和6mM的11-巰基十一醇溶液。組裝前分別取11-巰基十一酸和ll-巰基十一醇兩種溶液 各16(HU混合均勻，配成組裝液。在16通道電化學(xué)裸金芯片的每個工作電 極上滴加20|il組裝液，4。C過夜組裝。試驗前配制400mM的EDC和lOOmM 的NHS，各取40^1混勻后取4^1滴加在每個工作電極上，室溫放置IO分 鐘后用超純水沖洗然后用氮氣吹干。接著在每個工作電極滴加4^1 EZ-biotin溶液，室溫放置15分鐘后用超純水沖洗之后用氮氣吹干。然后 在每組電極上滴加25pl乙醇胺(1Methanolamine)，保證溶液覆蓋包括圓 形對電極以內(nèi)的整組電極，室溫放置10分鐘，以封閉剩余的羧基位點，超 純水沖洗之后用氮氣吹干。最后在每個工作電極上滴加4nl鏈霉親和素 (0.5mg/L鏈霉親和素)，室溫放置30分鐘后超純水沖洗，然后用氮氣吹干。 這樣制好的鏈霉親和素芯片可以在氮氣干燥的條件下暫時保存。經(jīng)過含有0.1MKC1的0.5mMK3Fe(CN)6溶液標定，發(fā)現(xiàn)結(jié)合了鏈霉 親和素的電極表面的本底值變小，和裸金電極表面的電化學(xué)特性明顯不同， 結(jié)果見圖4。第二步，用鏈霉親和素芯片進行耙向DNA檢測。在鏈霉親和素芯片的每個工作電極上滴加4M1 1MPBS配制的lpM檢 測探針DNA1， 4'C過夜反應(yīng)，利用生物素和鏈霉親和素的特異性結(jié)合，將 檢測探針固定在芯片的工作電極上。超純水沖洗然后氮氣吹干。在工作電 極上滴加10pM到10fM靶向DNA2， 37'C雜交反應(yīng)30分鐘。然后冷卻到 4"C反應(yīng)10分鐘，使沒有和耙向DNA2雜交的檢測探針DNA1在高鹽濃度 及低溫的條件下恢復(fù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，以減少本底。然后用低鹽濃度的洗液沖洗 后氮氣吹干。接著在每組電極上滴加25^1 PEG (polyethylene glycol,聚乙 二醇)溶液(0.05 w/vn/。PEG溶液，使用1MPBS配制)，反應(yīng)10分鐘， 封閉雜交層表面非特異性位點，確保溶液覆蓋圓形對電極以內(nèi)的整組三電 極區(qū)域。在每個工作電極表面滴加4pl 0.5U/mL anti-digoxigenin-POD，當 檢測探針DNA1和靶向DNA2雜交形成直鏈時，抗地高辛辣根過氧化物酶 就可以和檢測探針DNA1另一端修飾的地高辛結(jié)合，從而被捕獲。最后用 超純水沖洗、用氮氣吹干之后，在每組電極上滴加25nl的TMB底物(含 雙氧水)，使用PM3000電化學(xué)分析儀檢測。所檢測的靶向DNA2的濃度分別為10pM， lpM， O.lpM， 10fM。結(jié) 果見圖2。從圖2可以看出，靶向DNA2的濃度和得到的電化學(xué)信號有比 較好的對應(yīng)關(guān)系，所以可以用這種方法對耙向DNA進行定量。實施例2試劑盒同實施例1。將待檢測的目的DNA換成含有一個錯配堿基的DNA3: GTACTTTCA GCGGGGAGGAAGGCAGAAGAGTTAATA。 將實施例1第二步中不同濃度的靶向DNA2換成lnM錯配DNA3重復(fù)實驗。結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，錯配DNA即使?jié)舛群芨咭矌缀鯔z測不到電流信號。 實施例3試劑盒同實施例1。待檢測的目的DNA為任意非互補DNA4: GC AAATCCTAC AAAACGAAC ATC AT 。將實施例1第二步中不同濃度的耙向DNA2換成lnM任意非互補 DNA4重復(fù)實驗。結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，任意非互補DNA即使?jié)?度很高也幾乎檢測不到電流信號。實施例4將實施例1第二步中不同濃度的靶向DNA2換成lnM耙向DNA2和 lnM任意非互補DNA4，最后使用循環(huán)伏安法檢測。結(jié)果因為含有目的 DNA的檢測過程中特異性的捕獲了 HRP酶，所以催化了 TMB與雙氧水 的反應(yīng)，導(dǎo)致氧化峰減小，還原峰增大。而同樣的試驗過程，只將目的DNA 換成任意非互補DNA卻沒有發(fā)現(xiàn)還原電流變大的現(xiàn)象。結(jié)果見圖3。本發(fā)明上述實施例中所用的各種DNA序列都是人工合成的，均購自 上海生工生物工程有限公司。其它未特殊說明的條件按照常規(guī)條件或按照 藥品或以其制造廠商所建議的條件。
權(quán)利要求
1、一種采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)檢測探針的電化學(xué)DNA檢測方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)將含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA檢測探針的一端結(jié)合于電化學(xué)裝置的工作電極表面；2)將靶向DNA與上述的DNA檢測探針進行雜交反應(yīng)；3)加入能催化氧化還原反應(yīng)的酶，使其連接于DNA檢測探針的游離端；4)加入步驟3)所述的酶催化反應(yīng)的底物，進行電化學(xué)檢測分析。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中所述的電化學(xué)裝置 為裸金芯片。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的DNA檢測探針的一端 通過鏈霉親和素與生物素的親和作用結(jié)合于該裸金芯片的工作電極上。
4、 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的DNA檢測探針上組裝 有生物素分子，相應(yīng)地在裸金芯片的工作電極上組裝鏈霉親和素分子，該組 裝步驟包括a) 在裸金芯片工作電極表面滴加碳鏈長度相同的巰基CV 醇和巰基<:6~ 酸的混合溶液；b) 然后滴加EDC和NHS的混合溶液、以及修飾有氨基的生物素，將 生物素固定在電極表面；c) 最后加入鏈霉親和素。
5、 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟a)中所述的巰基C6~ 醇和巰基C6~ 酸的終摩爾濃度比是4:1 2:1 。
6、 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的巰基C6~ 醇和巰基C^ 酸分別是巰基十一醇和巰基十一酸，兩者的終濃度是3:1。
7、 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟b)中所述的EDC和NHS 的終摩爾濃度比例是6:1 2:1。
8、 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述的EDC和NHS的終摩 爾濃度比例是4:1。
9、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中所述的能催化氧化 還原反應(yīng)的酶是辣根過氧化物酶，其修飾有抗地高辛分子；所述的DNA檢 測探針的游離端修飾有地高辛分子，通過地高辛分子與抗地高辛分子的結(jié)合 連接辣根過氧化物酶和DNA檢測探針的游離端。
10、 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于步驟4)中所述的催化反應(yīng) 的底物是TMB和雙氧水。
11、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中所述的DNA檢 測探針用0.5M 1.5M NaCl的高鹽濃度的緩沖液配制，并在步驟2)雜交反 應(yīng)完成后在4'C 1(TC下靜置，使DNA檢測探針形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
12、 如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述的高鹽濃度的緩沖溶 液是lmol/LNaCl， O.IMPB， pH7.0~7.4的磷酸鹽緩沖液。
13、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在每一步反應(yīng)結(jié)束后洗去反 應(yīng)體系中的游離物，所用的洗液在步驟2)中耙向DNA與檢測探針雜交反 應(yīng)后至步驟3)加酶之前為0.1M 0.2M NaCl的低鹽濃度的洗液，在其余的 反應(yīng)中為超純水，洗完后都用氮氣吹干。
14、 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述的低鹽濃度的洗液為 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) tween, 0.01M PB， pH7.0~7.4的磷酸鹽緩沖液。
15、 一種采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)檢測探針的電化學(xué)DNA檢測試劑盒，其特征在 于該試劑盒包括1) 組裝有鏈霉親和素分子的電化學(xué)芯片，2) 兩端分別標記有生物素和地高辛的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA檢測探針，3) 高鹽濃度的磷酸鹽緩沖液以及低鹽濃度的洗液，4) 標記抗地高辛的辣根過氧化物酶，5) 辣根過氧化物酶催化反應(yīng)的底物。
16、 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其特征在于所述的的電化學(xué)芯片是 裸金芯片，該裸金芯片工作電極表面先通過滴加巰基十一醇和巰基十一酸的 混合溶液、以及EDC和NHS的混合溶液修飾帶氨基的生物素，再通過鏈霉 親和素與生物素的親和作用組裝上鏈霉親和素分子。
17、 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其特征在于所述的高鹽濃度的磷酸 鹽緩沖液是lmol/LNaCl， 0.1MPB, pH 7.0 7.4的磷酸鹽緩沖液；所述的低 鹽濃度的洗液為100 mM NaCl， 0.1 v/v°/。 tween， 0.01M PB, pH7.0~7.4的磷酸 鹽緩沖液；所述的辣根過氧化物酶催化反應(yīng)的底物為TMB和雙氧水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)檢測探針的電化學(xué)DNA檢測方法，該方法依次包括以下步驟1)將含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA檢測探針的一端結(jié)合于電化學(xué)裝置的工作電極表面；2)將靶向DNA與上述的DNA檢測探針進行雜交反應(yīng)；3)加入能催化氧化還原反應(yīng)的酶，使其連接于DNA檢測探針的游離端；4)加入步驟3)所述的酶催化反應(yīng)的底物，進行電化學(xué)檢測分析。本發(fā)明還公開相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明結(jié)合了酶催化的高靈敏和多通道電化學(xué)檢測迅速、操作簡便的特點，從而提供了一種無標記，高靈敏度，檢測迅速，多樣品同時檢測的電化學(xué)DNA檢測方法。
文檔編號G01N27/26GK101241097SQ200710046090
公開日2008年8月13日 申請日期2007年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月18日
發(fā)明者剛 劉, 樊春海 申請人:中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所