專利名稱：腫瘤修復(fù)基因突變的熒光實時pcr檢測方法及試劑系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤修復(fù)基因突變的熒光實時PCR檢測方法 及試劑系統(tǒng)。
技術(shù)背景腫瘤是多因素疾病，許多因素可以引起細(xì)胞的DNA損傷。正常情況下，機體具有自我 修復(fù)損傷的能力。但如果這種修復(fù)能力下降則會引發(fā)腫瘤的產(chǎn)生。隨著社會的發(fā)展和環(huán)境 的污染，以及吸煙率的增高，肺癌已經(jīng)成為許多國家癌癥死亡的首位原因。目前關(guān)于肺癌 的研究主要集中在基因修復(fù)方面。很多因素可以導(dǎo)致基因損傷，如，輻射，烷化劑等。對 于不同的損傷基因修復(fù)的方式也不同，同時，又有許多種修復(fù)基因參與基因的修復(fù)過程中。 DNA修復(fù)是對損傷的主要生物學(xué)反應(yīng)，促使DNA中損傷的、不合適的或錯配的堿基恢復(fù)本來 的生物化學(xué)過程，維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定。一基因修復(fù)的主要方式1 NER (核苷酸切除修復(fù))主要修復(fù)累積性損傷，是人類最主要和最重要的DNA損傷修復(fù)方式。包括連續(xù)性損傷 的識別、染色質(zhì)的重塑、在受損的DNA兩端切開形成切口、切除受損的寡核苷酸、填補缺 口連接DNA鏈。此過程有30多個蛋白參與，包括的修復(fù)基因主要有ERCC1 (剪切修復(fù)交叉互 補組l)、 ERCC2(剪切修復(fù)交叉互補組2，亦稱XPD)。吸煙導(dǎo)致的細(xì)胞DNA損傷主要通過NER 途徑來修復(fù)。2 DSB (DNA雙鏈斷裂修復(fù)) DNA雙鏈斷裂主要由于復(fù)制錯誤或外源因素(離子輻射等)所致，由同源性重組和非同源性DNA末端連接完成修復(fù)。參與的修復(fù)基因中與腫瘤放射敏感性密切相關(guān)的基因主要有 XRCC3 (X線交叉互補組3)。大量研究已經(jīng)證明，機體DNA修復(fù)能力的降低使機體發(fā)生各種腫瘤的風(fēng)險大大增加。 DNA損傷修復(fù)能力的降低可能導(dǎo)致肺癌的形成。然而，降低的DNA修復(fù)能力卻有利于鉑-DNA 加合物持續(xù)的抗腫瘤活性。換句話說，增高的DNA修復(fù)能力會增加抗藥性，這對于患者的 藥物治療方面是不利的。因此，在癌的易感性和對藥物的抗性方面，DNA修復(fù)被認(rèn)為是一 個"雙刃刀"。人們研究還發(fā)現(xiàn)，基因的多態(tài)性的分布與種族差異而不同，且與腫瘤的形成 有關(guān)。人們又發(fā)現(xiàn)不同的基因型與治療的預(yù)后也有關(guān)聯(lián)。例如，XRCC3 Met241Met在預(yù)測用gem/cis治療的年輕的NSCLC患者的生存方面是一個易于評估和有力的預(yù)測指標(biāo)。綜上所 述，基因的多態(tài)性不僅與腫瘤的形成和對藥物的敏感性有關(guān)，還可以用來判斷預(yù)后。臨床 上可以根據(jù)患者不同的個體，制定最佳的治療方案，從而做到個體化治療。二實時熒光定量PCR試劑系統(tǒng)是由前端引物，后端引物，探針組成，與普通常規(guī)PCR 相比，有很高的特異性，敏感性高，通常達(dá)102拷貝/ml,其檢測范圍廣，且重復(fù)性好，以CT 值為閾，能更精確的反映起始模板的拷貝數(shù),可有效的解決模板污染的風(fēng)險。T叫man探針檢 測的是積累熒光。常用的熒光基團(tuán)有FAM， TET， VIC， HEX等等。當(dāng)探針完整的時候，由于 3'端的熒光淬滅基團(tuán)在吸收5'端報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量，本身會發(fā)射波長不同的熒 光而導(dǎo)致本底高，因此TaqMan探針近來又有新的發(fā)展——TaqMan MGB探針。MGB探針的淬 滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(Non-Fluorescent Quencher),本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降 低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團(tuán)，可以將 探針的Tm值提高10C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通T叫Man探針設(shè)計 得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高——因為在模板的DNA堿 基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設(shè)計。實驗證明，TaqMan MGB探針對于富 含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。本發(fā)明基于以上技術(shù)原理，以ERCC1等腫瘤修復(fù)基因突變位點為目的基因，自主設(shè)計 一系列成套特異性寡核苷酸探針序列和引物序列，采用熒光實時定量PCR技術(shù)方法，用于 突變位點的檢測。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于創(chuàng)立一套用于腫瘤相關(guān)修復(fù)基因突變的熒光實時PCR檢測方法及試 劑系統(tǒng)。本發(fā)明提出的腫瘤相關(guān)修復(fù)基因突變的PCR檢測方法，是以腫瘤相關(guān)修復(fù)基因為檢測的 目的基因，使用專門設(shè)計的特異性寡核苷酸引物序列和水解探針，采用Taqman-MGB檢測試 劑系統(tǒng)，通過熒光實時定量PCR方法，對腫瘤相關(guān)基因的特點位點突變進(jìn)行檢測。本發(fā)明中所述的的腫瘤相關(guān)基因是指ERCC1基因及其突變基因位點，ERCC2基因及其 突變基因位點，XRCC3基因及其突變基因位點。所述的特異性寡核苷酸探針序列和引物序列如下引物序列至少包括下述之一種，以及由該引物序列采用任意表記方法或者修飾方法而 生成的寡核苷酸衍生物引物名稱 寡核苷酸序列 針對ERCC1基因GGAATTACGTCGCCAAATTCC GCAATCCCGTACTGAAGTTCGTGAGACGGACGCCCACCT GGAGGCGGGAAAGGGACT CCCTCTCCCTTTCCTCTGTTCT CACTCAGAGCTGCTGAGCAATC或者:ERCC1-118FP ERCC1-118RP 針對ERCC2基因 ERCC2-312FP ERCC2-312RP ERCC2-751FP ERCC2-751RP 針對XRCC3基因 XRCC3-241FP XRCC3-241RP 探針至少包括下述-酸衍生物 探針名稱 針對ERCC1基因 ERCC1-118FAM(C) ERCC1-118FAM(T) 針對ERCC2基因 ERCC2-312FAM(C) ERCC2-312FAM(T) ERCC2-751FAM(T) ERCC2-751層(G) 針對XRCC3基因XRCC3-241FAM(C) FAM-TCACGCAGCGTGGCCCCC-MGBXRCC3-241FAM(T) FAM-CACGCAGCATGGCCCCCAG-MGB 其中，F(xiàn)AM代表FAM基團(tuán)(熒光素基團(tuán))，MGB代表MGB基團(tuán)(淬光基因)，其中FAM可用其他任 意用于標(biāo)記的熒光素替代，如HEX，TET等(1) 在ERCC1基因的片段SEQ.ID.N01中的突變位點(〉表示錯配突變) ERCC1: 19007 C〉T(2) 在ERCC2基因的片段SEQ. ID.N02中的突變位點(〉表示錯配突變) ERCC2: 23591 G〉A(chǔ)(3) 在ERCC2基因的片段SEQ.ID.N03中的突變位點(〉表示錯配突變)ATGGCTCGCCTGGTGGT CCCTGCCTTGGTGCTCAC -種，以及由該探針采用任意標(biāo)記方法或修飾方法而生成的寡核苷寡核苷酸及標(biāo)記集團(tuán)FAM-CAGGGCACGTTGCG-MGB FAM-CAGGGCACATTGC-MGB層-CTTCGTCGGGCAGCA-MGB FAM-TGCTGCCCAACGAA-MGB FAM-CTATCCTCTTCAGCGTCT-MGB FAM- CTATCCTCTGCAGCGTCT-MGB或者:ERCC2: 35931 A>C(4)在XRCC3基因的片段SEQ. ID.N04中的突變位點(〉表示錯配突變) XRCC3: 18067 C〉T本發(fā)明所述Ta卿an-MGB熒光實時檢測試劑系統(tǒng)是指包含有本方法所涉及的任何寡核 苷酸引物序列和探針序列的熒光實時定量PCR系統(tǒng)，下述組成一和組成二組成 組成一Taqman-MGB實時定量PCR試劑系統(tǒng) (2) 5XPCR反應(yīng)緩沖液50-250mmol/LTris Cl (20。C下PH8.3-8.8) 訓(xùn)陽500mmol/L KC1 0.5-25mmol/L MgCI2 25mmol/L 二硫蘇糖醇 0.25-2.5% Triton X-100(2) dNTP0.5-15mmol/L各種dNTP(3) 前端引物和后端引物 由前面所述引物序列合成的引物，各種引物濃度范圍:20-200mmol/L(6) 探針由前面所述探針序列合成的探針,探針濃度范圍:20-200mmol/L(7) 熱啟動DNA聚合酶 酶使用量在0.5-5U組成二:DNA提取系統(tǒng)標(biāo)本DNA提取方法以酚/氯仿法、小量柱式離心法或其他方法提取 本發(fā)明所涉及的ERCC1,ERCC2和XRCC3基因突變及其突變類型的檢測方法具體操作如下本方法的檢測標(biāo)本種類包括手術(shù)標(biāo)本，活檢標(biāo)本，外周血，胸腹水，石蠟包埋組織等本方法的檢測目的基因包括ERCC1， ERCC2和XRCC3本方法所涉及的設(shè)備包括臺式高速離心機，超凈工作臺，熒光定量PCR儀本發(fā)明方法的基本步驟1. 標(biāo)本的處理及其DNA抽提 手術(shù)標(biāo)本和活檢標(biāo)本標(biāo)本量活檢腫瘤標(biāo)本，手術(shù)腫瘤標(biāo)本5 — 50mg。采用下述方法之一抽提DNA(1) 酚/氯仿DNA抽提純化法(2) 微量柱式離心法(3) 其他簡化抽提方法 外周血和胸腹水標(biāo)本量外周血2-5ml，胸腹水2-5ml，均使用非抗凝管。采用下述方法之一抽提DNA(1) 酚/氯仿DNA抽提純化法(2) 微量柱式離心法(3) 其他簡化抽提方法 石蠟包埋組織標(biāo)本量3-5片5-IO陶厚的石蠟包埋組織切片。采用下述方法之一抽提DNA(1) 改良的酚/氯仿DNA抽提純化法(2) Gpel氏石蠟包埋組織DNA提取法2. Taqman-MGB熒光實時定量PCR方法反應(yīng)系統(tǒng)組分包含本發(fā)明所涉及的任何寡核苷酸引物序列和探針序列 本發(fā)明使用的反應(yīng)體系如下(1) PCR反應(yīng)緩沖液20-50腿ol/L Tris Cl (20 。C下PH8.3-8.8),80-160腿ol/L KCl,0.8-5腿ol/L MgCl2,25mmol/L 二硫蘇糖醇,0.5-2.0% Triton X-100(2) dNTP: 0.5-2.0mmol/L各種dNTP(3) 前端引物和后端引物如前面所述引物序列合成的引物，引物濃度范圍:20-200mmol/L(4) 探針如前面所述的探針序列合成的探針，探針濃度范圍80-150mmol/L(5) 熱啟動DNA聚合酶酶使用量在0.5-5U擴增條件實時熒光定量PCR儀，采用如下參數(shù)94°C， l-5分鐘94。Cl-5秒，60。C5-30秒,30-50循環(huán)。 本發(fā)明涉及的用途包括(1)用于腫瘤相關(guān)修復(fù)基因的突變檢測。腫瘤相關(guān)修復(fù)基因具體指ERCC1, ERCC2， XRCC3。具體突變指腫瘤相關(guān)修復(fù)基因的錯配突變(2)用于腫瘤患者的臨床個體化用藥方案的指導(dǎo)及分子靶向抗腫瘤藥物的指導(dǎo)用藥。 分子靶向抗腫瘤藥物包括易瑞沙(Iressa),阿瓦斯汀(Arastin),格列衛(wèi)(Glivec) ， Tarceva 等具體實施方式
實施例l:外周血DNA基因組DNA抽提法的ERCC1， ERCC2, XRCC3的突變檢測(1) 標(biāo)本DNA抽提采集外周靜脈血2ml， 5000r/min離心3分鐘，移去上層血清。取 下層血移入離心管、加入PBS緩沖液溶解、12000r/min離心15分鐘、倒去上層、加入SDS、 蛋白酶K、 37'C搖床過夜，再用酚一氯仿抽提DNA、無水乙醇沉淀、75%乙醇洗漆，自然干 燥，最后融入200ijL TE液中。一2(TC冰箱保存。(2) Taqman-MGB熒光實時定量PCR檢測突變使用下述反應(yīng)體系-5XPCR Buffer dNTP MixtureMg Solution 0.514 XRCC3-241FPXRCC3-241RP 0.5 WXRCC3-241FAM(C) 0.5WXRCC3-241FAM(T) 0.5W(另外一管)ExTaqHS 0,2514標(biāo)本基因組DNA 1M1ddH20 補充至25W若檢測ERCC2 G23591A基因突變，則加入ERCC2-312FP引物，ERCC2-312RP引物 及探針ERCC2-312FAM(C)， ERCC2-312FAM(T)若檢測ERCC2A35931C基因突變，則加入ERCC2-751FP引物，ERCC2-751RP引物及 探針ERCC2-751 FAM(T) ， ERCC2-751 FAM(G)若檢測ERCC2 A35931C基因突變，則加入ERCC2-751FP引物，ERCC2-751RP引物及 探針ERCC2-751FAM(T)， ERCC2-751FAM(G)若檢測ERCC1 C19007T基因突變，則加入ERCC1-118FP引物，ERCC1-118RP引物及 探針ERCC1-118FAM(C) ， ERCC1陽118FAM(T)擴增條件實時熒光定量PCR儀，采用如下參數(shù)94°C， 1-5分鐘94。Cl-5秒，60°C5-30秒，30-50循環(huán)。檢測結(jié)果選取的20例基因組DNA，(其中16例為野生純和子，3例為雜合子，l例為突 變純和子)檢測與XRCC3-241FAM(C)， XRCC3-241FAM(T)的反應(yīng)情況。其中野生純 和子與XRCC3-241FAM(C)反應(yīng)有特異性擴增曲線出現(xiàn)，雜合子與XRCC3-241FAM(C)， XRCC3-241FAM(T)反應(yīng)時都有特異性擴增曲線出現(xiàn)，突變純和子只與 XRCC3-241FAM(T)反應(yīng)有特異性擴增曲線出現(xiàn)。檢測結(jié)論能夠準(zhǔn)確分辨出XRCC3 C18067T位點的基因突變，根據(jù)基因突變指導(dǎo)臨 床用藥。實施例2:腫瘤標(biāo)本基因組DNA抽提法的ERCC1， ERCC2， XRCC3的突變檢測(1) 標(biāo)本DNA抽提酚/氯仿DNA純化法。取腫瘤標(biāo)本2-10mg，倒入液氮，研磨成粉末， 加入lml分裂緩沖液(10mmol/LTris. CLPH7. 5， 10隱ol/LNaCL， 25臓ol/LEDTA);加入O. lml 1(mSDS,混勻;加入O. lmg蛋白酶K， 37。C水浴2-4小時，直到組織塊完全分解。2500rpm離 心20秒，取上清至新離心管。再用酚一氯仿抽提DNA、無水乙醇沉淀、75%乙醇洗滌，自 然干燥，最后融入200fjL TE液中。一20'C冰箱保存。(2) Taqman-MGB熒光實時定量PCR檢測突變 使用下述反應(yīng)體系5XPCR BufferdNTP Mixture 0.75W Mg Solution 0.5rt XRCC3-241FP 0.514 XRCC3-241RP 0.514 XRCC3陽241FAM(C)XRCC3隱241FAM(T) 0.5W(另外一管) ExTaqHS 0.2514標(biāo)本基因組DNA 1M1 ddH20 補充至25W。若檢測ERCC2 G23591A基因突變，則加入ERCC2-312FP引物，ERCC2-312RP引物及 探針ERCC2陽312FAM(C) ， ERCC2-312FAM(T)。若檢測ERCC2 A35931C基因突變，則加入ERCC2-751FP引物，ERCC2-751RP引物及 探針ERCC2-751 FAM(T) ， ERCC2-751 FAM(G)。若檢湖UERCC2 A35931C基因突變，則加入ERCC2-751FP引物，ERCC2-751RP引物 及探針ERCC2陽751FAM(T)， ERCC2陽751FAM(G)。若檢領(lǐng)!]ERCC1 C19007T基因突變，則加入ERCC1-118FP引物，ERCC1-118RP引物 及探針ERCC1-118FAM(C) ， ERCC1-118FAM(T)。擴增條件實時熒光定量PCR儀，采用如下參數(shù)94°C， l-5分鐘94。Cl-5秒，6(TC5-30秒，30-50循環(huán)。檢測結(jié)果選取的20例基因組DNA，(其中16例為野生純和子，3例為雜合子，l例為突 變純和子)檢測與XRCC3-241FAM(C)， XRCC3-241FAM(T)的反應(yīng)情況。其中野生純和子 與XRCC3-241FAM(C)反應(yīng)有特異性擴增曲線出現(xiàn)，雜合子與XRCC3-241FAM(C), XRCC3-241FAM(T)反應(yīng)時都有特異性擴增曲線出現(xiàn)，突變純和子只與XRCC3-241FAM(T) 反應(yīng)有特異性擴增曲線出現(xiàn)。檢測結(jié)論能夠準(zhǔn)確分辨出XRCC3 C18067T位點的基因突變，根據(jù)基因突變指導(dǎo)臨 床用藥。序列表SEQ. ID.恥1:TCCCTATTGATGGCTTCTGCCCTTCGTCCCTCCCCAGAGGGGCAATCCCGTACTGMGTTCGTGCGCAMraSTODO微BsffimiTi紘'孤lCGGGCCCGG SEQ. ID.恥3:GGTGAGTGCAGCCATGTGGTGTGTGCACCTCTGTGCAGGTGCCAGGGGCACAGC
權(quán)利要求
1、一種腫瘤修復(fù)基因突變的實時PCR檢測方法，該方法以檢測腫瘤修復(fù)基因為目的，使用針對腫瘤修復(fù)基因的專門設(shè)計的特異性寡核苷酸引物序列和水解探針，采用Taqman-MGB檢測試劑系統(tǒng)，通過熒光實時定量PCR方法，對腫瘤修復(fù)基因的特定位點進(jìn)行檢測；所述的腫瘤修復(fù)基因包括ERCC1，ERCC2，XRCC3基因；所述的特異性寡核苷酸引物序列至少包括下述之一種，以及由該引物序列采用任意表記方法或者修飾方法而生成的寡核苷酸衍生物引物名稱 寡核苷酸序列ERCC1-118FPGGAATTACGTCGCCAAATTCCERCC1-118RPGCAATCCCGTACTGAAGTTCGTERCC2-312FPGAGACGGACGCCCACCTERCC2-312RPGGAGGCGGGAAAGGGACTERCC2-751FPCCCTCTCCCTTTCCTCTGTTCTERCC2-751RPCACTCAGAGCTGCTGAGCAATCXRCC3-241FPATGGCTCGCCTGGTGGTXRCC3-241RPCCCTGCCTTGGTGCTCAC所述水解探針至少包括下述一種，以及由該探針采用任意標(biāo)記方法或修飾方法而生成的寡核苷酸衍生物探針名稱寡核苷酸及標(biāo)記集團(tuán)ERCC1-118FAM(C)FAM-CAGGGCACGTTGCG-MGBERCC1-118FAM(T)FAM-CAGGGCACATTGC-MGBERCC2-312FAM(C)FAM-CTTCGTCGGGCAGCA-MGBERCC2-312FAM(T)FAM-TGCTGCCCAACGAA-MGBERCC2-751FAM(T)FAM-CTATCCTCTTCAGCGTCT-MGBERCC2-751FAM(G)FAM-CTATCCTCTGCAGCGTCT-MGBXRCC3-241FAM(C)FAM-TCACGCAGCGTGGCCCCC-MGBXRCC3-241FAM(T)FAM-CACGCAGCATGGCCCCCAG-MGB其中，F(xiàn)AM代表FAM基團(tuán)，MGB代表MGB基團(tuán)；而且FAM可用其他任意用于標(biāo)記的熒光素替代；所述的Taqman-MGB檢測試劑系統(tǒng)，由以下兩部分構(gòu)成一Taqman-MGB實時定量PCR試劑系統(tǒng)(1)5XPCR反應(yīng)緩沖液50-250mmol/L Tris·Cl(20℃下PH8.3-8.8)100-500mmol/L KCl0.5-25mmol/L MgCl225mmol/L二硫蘇糖醇0.25-2.5％Triton X-100；(2)dNTP0.5-15mmol/L各種dNTP；(3)前端引物和后端引物由所述引物序列合成的引物，各種引物濃度范圍20-200mmol/L；(4)探針由所述水解探針序列合成的探針，探針濃度范圍20-200mmol/L；(5)熱啟動DNA聚合酶酶使用量在0.5-5U；二DNA提取系統(tǒng)標(biāo)本DNA提取方法以酚/氯仿法、小量柱式離心法或其他方法提取。
全文摘要
本發(fā)明屬藥物療效檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤相關(guān)基因突變的實時PCR檢測方法及試劑系統(tǒng)。本發(fā)明針對腫瘤個體化治療相關(guān)的腫瘤修復(fù)基因XRCC3，ERCC1和ERCC2作為檢測的目的基因，使用專門設(shè)計的特異性寡核苷酸引物序列和水解探針，采用Taqman-MGB檢測試劑系統(tǒng)，通過熒光實時定量PCR方法，對腫瘤相關(guān)基因的特點位點突變進(jìn)行檢測，試劑系統(tǒng)是指包含本發(fā)明所涉及的任何特異性寡核苷酸序列和探針的實時熒光定量PCR試劑系統(tǒng)。本發(fā)明可用于臨床個體化用藥方案的效果檢測。
文檔編號G01N21/00GK101266207SQ20071004650
公開日2008年9月17日 申請日期2007年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月27日
發(fā)明者周彩存, 頡 張, 張增利 申請人:上海市肺科醫(yī)院