專利名稱：豬附紅細(xì)胞體的小鼠感染模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的動物模型的構(gòu)建方法，具體涉及 一種豬附紅細(xì)胞體的小鼠感染模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
附紅細(xì)胞體病(Eperythrozoonosis)是由附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon)寄 生于紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓內(nèi)引起的一種以紅細(xì)胞壓積降低、血紅蛋白濃度 下降、白細(xì)胞增多、貧血、黃疸、發(fā)熱為主要臨床特征的人獸共患病。該病分 布范圍廣、感染宿主多，給人的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展造成巨大的危害。近年來國 內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者對附紅細(xì)胞體病進(jìn)行了深入的研究，特別是上世紀(jì)八十年代以 來，報(bào)道人及畜禽等附紅細(xì)胞體病的爆發(fā)流行，越來越引起了國內(nèi)外學(xué)者對該 病的高度重視。但是目前，附紅細(xì)胞體尚不能體外大量培養(yǎng)和增殖，為后續(xù)研 究工作帶來了困難。而且該病的隱性感染率較高，且常與弓形體病，大腸桿菌 病，鏈球菌病，溫和性豬瘟等其他疾病并發(fā)感染。因此，建立一個(gè)穩(wěn)定的，能 反映豬附紅細(xì)胞體病感染特點(diǎn)的動物模型對于研究該病的致病機(jī)理，免疫學(xué)， 流行病學(xué)都尤為重要。
經(jīng)過對現(xiàn)有方法的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，附紅細(xì)胞體動物模型的研究主要是通過 以豬附紅細(xì)胞體的全血感染切脾或注射地塞米松的實(shí)驗(yàn)動物來獲得。如劉冰 等在2007年《中國獸醫(yī)科學(xué)》37期12 — 15頁中，描述了一種豬附紅細(xì)胞體小鼠 感染模型的建立方法。利用摘除脾或注射地塞米松的昆明小白鼠，以腹腔注射 方式人工感染豬附紅細(xì)胞體全血建立了豬附紅細(xì)胞體感染模型，并通過PCR的 方法進(jìn)行驗(yàn)證。這種方法雖然也可以建立豬附紅細(xì)胞體的動物模型，但是，此 模型存在兩個(gè)缺陷(1)采用全血攻毒不可避免地會帶入白細(xì)胞等雜質(zhì)，感染 源不是單一的，會影響試驗(yàn)結(jié)果。(2)采用免疫抑制狀態(tài)下的小鼠建模，無法 真實(shí)反映自然發(fā)病的狀態(tài)，比較片面。因此，如果一個(gè)動物模型可以穩(wěn)定地復(fù) 制出附紅細(xì)胞體感染，并且能克服這兩個(gè)缺陷，對附紅細(xì)胞體的深入研究將具有獨(dú)特的價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種豬附紅細(xì)胞體的小鼠感染模型 的構(gòu)建方法。本發(fā)明采用分離純化的豬附紅細(xì)胞體作為感染源通過靜脈注射SPF 小鼠得到。本發(fā)明采用鮮血壓片檢測，PCR檢測和透射電鏡檢測三種方法相結(jié) 合進(jìn)行驗(yàn)證。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的-
本發(fā)明包括以下步驟
① 從感染豬附紅細(xì)胞體病的豬血中分離純化出豬附紅細(xì)胞體； 所述的分離純化的豬附紅細(xì)胞體是指從豬附紅細(xì)胞體病豬血中分離出來
的豬附紅細(xì)胞體重懸于無菌的生理鹽水中，此懸液為分離純化的豬附紅細(xì)胞體 懸液。
② 小鼠的飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于熏蒸消毒的隔離室內(nèi)；
③ 對小鼠靜脈接種；
所述的對小鼠靜脈接種，是指對小鼠接種純化的豬附紅細(xì)胞體懸液，具體 為對7周齡SPF小鼠尾靜脈注射100ul純化的豬附紅細(xì)胞體懸液，其中豬附 紅細(xì)胞體數(shù)目大于等于107個(gè)。
④ 動物模型的檢測，驗(yàn)證豬附紅細(xì)胞體小鼠感染模型顯示出附紅細(xì)胞體感 染紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。
所述的檢測，是包括鮮血壓片鏡檢，PCR檢測和透射電鏡鏡檢三步法的綜 合檢測。
其中PCR檢測引物是根據(jù)豬附紅細(xì)胞體1. 8kb開放閱讀框序列設(shè)計(jì)，上游 為5'- CTGCC GATGT GTTAA GTCCT -3'，下游為5'- CTGGG TGTAT GAAGA GTGGT GT -3'，可擴(kuò)增出長度為233bp的片段。
根據(jù)上述步驟，通過三種檢測方法驗(yàn)證，證實(shí)本發(fā)明中豬附紅細(xì)胞體SPF 小鼠感染模型構(gòu)建成功，同時(shí)也能清楚地顯示出附紅細(xì)胞體感染紅細(xì)胞的超微 結(jié)構(gòu)。
所述的感染，以分離純化的豬附紅細(xì)胞體作為感染源。由于感染源單一， 使模型的建立更為標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定。所述的接種，是指靜脈注射，對實(shí)驗(yàn)動物無需進(jìn)行切脾手術(shù)或者注射地賽米松等也能獲得較高的感染率。
本發(fā)明完全彌補(bǔ)了目前附紅細(xì)胞體動物模型構(gòu)建的缺陷，是一種理想的動 物模型。本發(fā)明的意義在于該模型可以用于附紅細(xì)胞體病的致病機(jī)理，免疫學(xué)，
流行病學(xué)等方面的提供研究依據(jù)和實(shí)驗(yàn)手段。


圖1為實(shí)施例1附紅細(xì)胞體感染紅細(xì)胞的透射電鏡圖片。 圖2為實(shí)施例2附紅細(xì)胞體感染紅細(xì)胞的透射電鏡圖片。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方 案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不 限于下述的實(shí)施例。
SPF小鼠，即無特定病原(Specific pathogen free animal, SPF)小鼠 的簡稱。為實(shí)驗(yàn)用小鼠的一個(gè)國際通用標(biāo)準(zhǔn)級別，適用于大部分實(shí)驗(yàn)研究。是 相對于無菌級小鼠和普通級小鼠而言的。SPF小鼠包括不同品種，如最常用的 兩種即昆明小鼠和BALB/c小鼠，本實(shí)施例適用于SPF級不同品種小鼠，不 限于實(shí)施例提到的兩種。
實(shí)施例1豬附紅細(xì)胞體SPF昆明小鼠感染模型的構(gòu)建
(1) 分離純化豬附紅細(xì)胞體 首先無菌采集患有豬附紅細(xì)胞體病的豬血200ml， 2000r/min離心lOmin，
去上清。將沉淀紅細(xì)胞泥加入等體積生理鹽水重懸為紅細(xì)胞懸液。在新的離心 管中加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液和紅細(xì)胞懸液，2500r/min離心20min，去最 上層和中間的白細(xì)胞層，取下層紅細(xì)胞層。用等體積的生理鹽水重懸紅細(xì)胞層， 5(TC水浴15min后，油鏡下可觀察到附紅細(xì)胞體與紅細(xì)胞分離，此時(shí)用 2000r/min離心K)min，取上清于一離心管。將沉淀重懸于生理鹽水中再 2000r/min離心10min，取上清。將兩次所得的上清一起收集，12000r/min離 心，去上清。將沉淀重懸于適量生理鹽水中，即為純化的豬附紅細(xì)與體懸液。
(2) SPF昆明小鼠的飼養(yǎng) 試驗(yàn)前隔離室和飼養(yǎng)小鼠的鼠籠需徹底消毒。先用1%來蘇爾溶液擦拭隔
離室地面、門、窗和鼠籠，用紫外光照射12小時(shí)，然后對詞養(yǎng)小鼠的房間進(jìn)行熏蒸。首先測量房間的體積大小，按福爾馬林30毫升/立方米、高錳酸鉀15克 /立方米和水15毫升/立方米計(jì)算用量。在房間熏蒸消毒之前，檢査房間的密閉 性。熏蒸時(shí)，先將水倒入陶瓷容器內(nèi)，后加入高錳酸鉀，攪拌均勻，再加入福 爾馬林，人即離開，密閉房間。熏蒸消毒24小時(shí)以上，然后換氣通風(fēng)。
實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，工作人員進(jìn)入隔離室前，都必須進(jìn)行手臂部消毒(1: 1000 稀釋的新潔爾滅)，然后換上無菌工作服和口罩。7周齡SPF昆明小鼠購自中國 科學(xué)院上海試驗(yàn)動物中心，飼喂滅菌鼠糧和滅菌水。SPF昆明小鼠分為對照組 和感染組各30只，分別詞養(yǎng)在不同的隔離室。
(3) '接種
采取尾靜脈注射接種法，感染組每只小鼠均接種100 ul純化的豬附紅細(xì) 胞體懸液(100ul懸液中豬附紅細(xì)胞體數(shù)目不少于107個(gè))。對照組每只小鼠接 種100ul無菌生理鹽水。
(4) 鮮血壓片檢測
感染3天后，分別將感染組和對照組小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，將采集的血液 壓片，在1000倍油鏡下觀察，可看到感染組小鼠紅細(xì)胞均出現(xiàn)明顯變形。 而對照組的小鼠紅細(xì)胞為正常的雙凹狀。
(5) PCR檢測
根據(jù)豬附紅細(xì)胞體1. 8kb開放閱讀框序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游為5'-CTGCC GATGT GTTAA GTCCT -3'，下游為5'- CTGGG TGTAT GAAGA GTGGT GT _3'。實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠分別心臟采血lml，按基因組DNA提取試劑盒 (TIANGEN)說明提取模板DNA。 PCR反應(yīng)體系為1 X PCR buffer, 1. 5mMMgC12, 250 uM dNTPs， 12. 5pmole引物，1. 25U Taq DNA聚合酶和lul模板DNA。 反應(yīng)條件為94°C 5rain后，94°C 30s， 56。C30s， 72。C30s,進(jìn)行36個(gè)循環(huán)后72 t;延伸10min，實(shí)驗(yàn)組的樣本均可擴(kuò)增出長度為233bp的片段，經(jīng)上海生工生 物公司測序后證明此片段為豬附紅細(xì)胞體。而對照組樣本不能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。
(6) 透射電鏡檢測
將實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈血用2. 5%的戊二醛固定2h，用0. lmol/L磷酸漂洗液 漂洗三次，1%鋨酸固定液固定2-3h，再用O. lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次。分 別用50%乙醇，70%乙醇，90%乙醇，90%乙醇90%丙酮(1: 1)， 90%丙酮和100%丙酮進(jìn)行梯度脫水。丙酮加包埋液逐級浸透，包埋。用Leica (徠卡)-ULTRACUT超薄切片機(jī)切片機(jī)切片厚度為60 nm ， 3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后，用Hitachi (日立)-7650透射電子顯微鏡觀察，拍片(X 10000)。從圖片中可以觀察到附紅細(xì)胞體可以疏松地結(jié)合在紅細(xì)胞表面， 而不貫穿紅細(xì)胞膜。附紅細(xì)胞體附著在紅細(xì)胞表面導(dǎo)致紅細(xì)胞膜內(nèi)陷，附紅細(xì) 胞體則嵌在內(nèi)陷的紅細(xì)胞膜中，附紅細(xì)胞體與紅細(xì)胞膜之間有一定間隙(如圖 1)。本實(shí)施例成功構(gòu)建了豬附紅細(xì)胞體病SPF昆明小鼠感染模型，該模型可用 于該病的致病機(jī)理，免疫學(xué)，流行病學(xué)等方面的研究。實(shí)施例2豬附紅細(xì)胞體SPF BALB/c小鼠感染模型的構(gòu)建(1) 分離純化豬附紅細(xì)胞體 首先無菌采集患有豬附紅細(xì)胞體病的豬血200ml, 2000r/min離心10min，去上清。將沉淀紅細(xì)胞泥加入等體積生理鹽水重懸為紅細(xì)胞懸液。在新的離心 管中加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液和紅細(xì)胞懸液，2500r/min離心20min，去最 上層和中間的白細(xì)胞層，取下層紅細(xì)胞層。用等體積的生理鹽水重懸紅細(xì)胞層， 5(TC水浴15min后，油鏡下可觀察到附紅細(xì)胞體與紅細(xì)胞分離，此時(shí)用 2000r/min離心10min，取上清于一離心管。將沉淀重懸于生理鹽水中再 2000r/min離心10min，取上清。將兩次所得的上清一起收集，12000r/min離 心，去上清。將沉淀重懸于適量生理鹽水中，即為純化的豬附紅細(xì)胞體懸液。(2) SPF BALB/c小鼠的飼養(yǎng) 試驗(yàn)前隔離室和飼養(yǎng)小鼠的鼠籠需徹底消毒。先用1%來蘇爾溶液擦拭隔離室地面、門、窗和鼠籠，用紫外光照射12小時(shí)，然后對飼養(yǎng)小鼠的房間進(jìn)行 熏蒸。首先測量房間的體積大小，按福爾馬林30毫升/立方米、高錳酸鉀15克 /立方米和水15毫升/立方米計(jì)算用量。在房間熏蒸消毒之前，檢查房間的密閉 性。熏蒸時(shí)，先將水倒入陶瓷容器內(nèi)，后加入高錳酸鉀，攪拌均勻，再加入福 爾馬林，人即離開，密閉房間。熏蒸消毒24小時(shí)以上，然后換氣通風(fēng)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，工作人員進(jìn)入隔離室前，都必須進(jìn)行手臂部消毒(1: 1000 稀釋的新潔爾滅)，然后換上無菌工作服和口罩。7周齡SPF BALB/c小鼠購自中國科學(xué)院上海試驗(yàn)動物中心，飼喂滅菌鼠糧和滅菌水。SPF小鼠分為對照組 和感染組各30只，分別飼養(yǎng)在不同的隔離室。(3) 接種采取尾靜脈注射接種法，感染組每只小鼠均接種100 ul純化的豬附紅細(xì) 胞體懸液(100ul懸液中豬附紅細(xì)胞體數(shù)目不少于107個(gè))。對照組每只小鼠接 種100ul無菌生理鹽水。(4) 鮮血壓片檢測感染3天后，分別將感染組和對照組小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，將采集的血液 壓片，在1000倍油鏡下觀察，可看到感染組小鼠紅細(xì)胞均出現(xiàn)明顯變形。而對 照組的小鼠紅細(xì)胞為正常的雙凹狀。(5) PCR檢測根據(jù)豬附紅細(xì)胞體1. 8kb開放閱讀框序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游為5'-CTGCC GATGT GTTAA GTCCT -3'，下游為5'- CTGGG TGTAT GAAGA GTGGT GT -3'。 實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠分別心臟采血lml，按基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN) 說明提取模板DNA。 PCR反應(yīng)體系為IX PCR buffer, 1.5mM MgC12, 250uM dNTPs， 12. 5pmole引物，1.25UTaqDNA聚合酶和lul模板DNA。反應(yīng)條件 為94°C 5min后，94°C 30s, 56。C30s， 72。C30s，進(jìn)行36個(gè)循環(huán)后72。C延伸 10min，實(shí)驗(yàn)組的樣本均可擴(kuò)增出長度為233bp的片段，經(jīng)上海生工生物公司測 序后證明此片段為豬附紅細(xì)胞體。而對照組樣本不能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。(6) 透射電鏡檢測將實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈血用2. 5%的戊二醛固定2h，用0. lmol/L磷酸漂洗液 漂洗三次，1%鋨酸固定液固定2-3h，再用0. lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次。分 別用50%乙醇，，70%乙醇，90%乙醇，90%乙醇90%丙酮(1: 1)， 90%丙酮和 100%丙酮進(jìn)行梯度脫水。丙酮加包埋液逐級浸透，包埋。'用Leica (徠卡)-ULTRACUT超薄切片機(jī)切片機(jī)切片厚度為60 nm ， 3% 醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后，用Hitachi (日立)-7650透射電子顯微鏡觀察， 拍片(X 10000)。從圖片中可以觀察到附紅細(xì)胞體可以疏松地結(jié)合在紅細(xì)胞表 面，而不貫穿紅細(xì)胞膜。附紅細(xì)胞體附著在紅細(xì)胞表面導(dǎo)致紅細(xì)胞膜內(nèi)陷，附 紅細(xì)胞體則嵌在內(nèi)陷的紅細(xì)胞膜中，附紅細(xì)胞體與紅細(xì)胞膜之間有一定間隙(如圖2)。本實(shí)施例成功構(gòu)建了豬附紅細(xì)胞體病SPF BALB/c小鼠感染模型，該模型 可用于該病的致病機(jī)理，免疫學(xué)，流行病學(xué)等方面的研究。
權(quán)利要求
1、一種豬附紅細(xì)胞體的小鼠感染模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟①從感染豬附紅細(xì)胞體病的豬血中分離純化出豬附紅細(xì)胞體，從豬附紅細(xì)胞體病豬血中分離出來的豬附紅細(xì)胞體重懸于無菌的生理鹽水中，此懸液為分離純化的豬附紅細(xì)胞體懸液；②小鼠的飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于熏蒸消毒的隔離室內(nèi)；③對小鼠靜脈接種，對小鼠接種純化的豬附紅細(xì)胞體懸液，具體為對7周齡SPF小鼠尾靜脈注射100ul純化的豬附紅細(xì)胞體懸液；④動物模型的檢測，驗(yàn)證豬附紅細(xì)胞體小鼠感染模型顯示出附紅細(xì)胞體感染紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的豬附紅細(xì)胞體的SPF小鼠感染模型的構(gòu)建方法。包括步驟(1)豬附紅細(xì)胞體的分離純化；(2)SPF小鼠飼養(yǎng)于熏蒸消毒的隔離室中；(3)接種；(4)動物模型檢測評估。本發(fā)明成功構(gòu)建了豬附紅細(xì)胞體的SPF小鼠感染模型，并通過鮮血壓片檢測，PCR檢測和透射電鏡檢測三種方法驗(yàn)證。本模型可用于附紅細(xì)胞體病的病原學(xué)，致病力，病理學(xué)和免疫學(xué)等方面的深入研究。
文檔編號G01N33/50GK101288774SQ20071004795
公開日2008年10月22日 申請日期2007年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月8日
發(fā)明者飛 余, 華修國, 立 崔, 楊志彪, 袁聰利 申請人:上海交通大學(xué)