專利名稱：檢測(cè)痕量辣根過(guò)氧化物酶的分光光度法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)痕量辣根過(guò)氧化物酶的方法，特別是一種用陽(yáng)離子表面活 性劑締合物微粒分光光度法檢測(cè)痕量辣根過(guò)氧化物酶的方法。
背景技術(shù)：
辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase,簡(jiǎn)稱HRP)是一種非常重要的過(guò) 氧化物酶，在分析化學(xué)、環(huán)境科學(xué)、臨床化學(xué)、有機(jī)合成等領(lǐng)域均有重要的應(yīng) 用。測(cè)定游離HRP和各種HRP標(biāo)記中HRP的含量可以間接地測(cè)定體液和其他 組織液中抗體或抗原的量，對(duì)于免疫學(xué)及組織化學(xué)的研究以及臨床疾病的診斷 具有十分重要的意義。
基于HRP催化H202氧化無(wú)色的苯胺類、苯酚類衍生物，生成具有顏色、 熒光或電化學(xué)活性的醌式或偶氮類二聚或多聚產(chǎn)物，可用分光光度法、熒光法 或電化學(xué)方法檢測(cè)HPR活性和H202 ，并廣泛用于酶聯(lián)免疫和酶分析。
現(xiàn)有的測(cè)定HRP活性的方法主要有分光光度法，熒光光度法、化學(xué)發(fā)光法， 以及酶聯(lián)免疫吸附分析法、酶聯(lián)熒光免疫分析法、電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析法等。 其中伏安酶聯(lián)免疫分析法靈敏度較高，但操作比較繁瑣。上述方法主要存在兩 個(gè)缺點(diǎn)第一，所用底物多為苯胺類、苯酚類衍生物，穩(wěn)定性較差，見光或空 氣極易被氧化，更為不足的是苯胺類底物具有致癌作用，使它的應(yīng)用受到限制。 第二， HRP是一種對(duì)氫供體底物(如酚、胺、抗壞血酸等)缺乏特異性氧化的 酶，可以催化氧化多種底物，因而底物類似物對(duì)測(cè)定也有干擾。因此，研究HRP 的新底物和新方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種用陽(yáng)離子表面活性劑締 合物微粒分光光度法檢測(cè)痕量辣根過(guò)氧化物酶的方法。
本發(fā)明目的采用如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明研究了陽(yáng)離子表面活性劑溴代十四烷基吡啶(TPB) -HRP-KI-H202 體系的光度法特征及其分析應(yīng)用。在酸性條件下，HRP可以催化11202與過(guò)量的 r反應(yīng)生成I3、 13—與陽(yáng)離子表面活性劑TPB等形成締合物微粒(TPB-I3) n，該
締合物微粒存在吸收效應(yīng)，HRP濃度在一定范圍內(nèi)與TPB體系304nm處的吸光 度呈線性關(guān)系。據(jù)此建立一種靈敏度高、選擇性好、簡(jiǎn)便快速測(cè)定痕量HRP的 光度法。
本發(fā)明采用陽(yáng)離子表面活性劑締合物微粒分光光度法檢測(cè)痕量辣根過(guò)氧化 物酶。具體檢測(cè)方法包括如下步驟
1. 在5.0mL的具塞試管中，依次加入HAc-NaAc緩沖溶液、KI和HRP;
2. 在步驟l的具塞試管中再加入11202，搖勻；
3. 將步驟2的試管置于溫水浴中，再加入TPB，搖勻，用蒸餾水定容至2.5mL
4. 將上述所得溶液適量倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計(jì)上掃 描得到體系的吸收光譜，以不加HRP測(cè)得的吸收強(qiáng)度為空白；
5. 將上述所得溶液倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定304nm 處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Aabs=0.0801c+0.1252， R2=0.9981，即可求得辣根過(guò)氧化物酶在0.4 3.2ng/mL范圍內(nèi)的濃度。
步驟1所述的具塞試管中，依次加入的HAc-NaAc緩沖溶液，其pH值為 4.6 5.2，體積0.2 0.5mL，加入的KI濃度為4X l(T3 mol/L 6X 10-3 mol/L， 加入的HRP濃度為0.1 pg/ mL，體積為10 80|iL;
步驟2所述的加入的壓02濃度為1.0X 10-5 3.0X l(T5 mol/L;
步驟3所述的水浴溫度為20 30°C ，水浴反應(yīng)時(shí)間為25 50min ,TPB濃度 為2.0X 10國(guó)5 6.0X l(T5mol/L;
步驟5所述的測(cè)定波長(zhǎng)為304nm。
本發(fā)明的原理是在偏酸性的HAc-NaAc緩沖溶液中，當(dāng)有11202存在時(shí)， HRP可催化H202產(chǎn)生'OH， 'OH可氧化過(guò)量的r生成l2，過(guò)量的1—與12可結(jié)合 形成V，而TPB可與V結(jié)合形成(l3——TPB)n締合微粒。用NaNo-ZS90納米粒 度與Zeta電位分析儀對(duì)此微粒進(jìn)行分析表明，該微粒的平均粒徑在700 800nm 范圍內(nèi)。因該微粒有較大的粒徑可產(chǎn)生吸收效應(yīng)，而該粒子大小與HRP的濃度 有關(guān)，據(jù)此，可以建立間接測(cè)定HRP活力的新方法。其主要反應(yīng)如下
<formula>formula see original document page 4</formula>i2 + r -I3— (3)
nTPB十 nl3- - (I3-—TPB)n (4)
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
1: KI作為HRP的氫供體底物，該試劑無(wú)毒易得；
2: HRP催化氫受體底物H202具有特異性，本方法利用HRP催化壓02氧 化KI的反應(yīng)，測(cè)定HRP活性，方法具有選擇性好，靈敏度高(達(dá)pg/mL)的特 占.
3:設(shè)備簡(jiǎn)單，僅需一臺(tái)紫外可見分光光度計(jì)和恒溫水浴槽； 4:操作簡(jiǎn)便，試劑成本低廉。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例KI-HRP-H202-TPB體系的紫外可見吸收光譜圖，其中 a: pH4.6- 4.80X 10-3 mol/L KI-1.51 X l(T5 mol/L H202- 4.00X1(T5 mol/L TPB; b: pH4.6- 4.80X 10-3 mol/L KI-1.51 X l(T5 mol/L H202- 4.00 X l(T5 mol/L TPB- 0.40ng/ mL HRP; c: pH4.6- 4.80 X l(T3 mol/L KI-1.51 X 10-5 mol/L H202- 4.00 X 10-5 mol/L TPB- 2.40 ng/ mL HRP; d: pH4.6- 4.80X l(T3mol/L KI-1.51 X l(T5 mol/L H2Or 4.00 X 10-5 mol/L TPB- 3.20 ng/ mL HRP。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述
采用陽(yáng)離子表面活性劑締合物微粒分光光度法檢測(cè)痕量辣根過(guò)氧化物酶的 方法包括以下步驟
1. 在5.0 mL的具塞試管中，依次加入pH為4.6的HAc-NaAc緩沖溶液 0.2mL， 4.80X l(T3 mol/L的KI， 0.1 jug/ mL 10 80pL的HRP;
2. 在步驟1的溶液中加入1.51 Xl(T5 mol/LH202，搖勻；
3. 在25。C水浴30min后，再加入4.0X l(T5 mol/L TPB，搖勻，用蒸餾水定 容至2.5mL;
4. 將上述所得溶液倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計(jì)上掃描得 到體系的吸收光譜，以不加HRP測(cè)得的吸光強(qiáng)度為空白，在304nm處，根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)曲線Aabs=0.0801c+0.1252, R2=0.9981，即可求得辣根過(guò)氧化物酶在0.4-3.2 ng/
mL范圍內(nèi)的濃度。
圖中KI-HRP-H202-TPB體系的紫外光譜圖表明(TPS-I3) n締合微?？僧a(chǎn) 生吸收效應(yīng)，最大吸收波長(zhǎng)在304nm處，選擇在304nm處進(jìn)行測(cè)量，隨著HRP 濃度的增加，該締合微粒的吸收強(qiáng)度增大。
雖然以上通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng) 該知道，上述僅為舉例，可以對(duì)實(shí)施方式做出多種變更和修改，本發(fā)明的范圍 僅由所附權(quán)利要求書限制。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)痕量辣根過(guò)氧化物酶的方法，其特征是采用陽(yáng)離子表面活性劑締合物微粒分光光度法檢測(cè)痕量辣根過(guò)氧化物酶。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征是檢測(cè)方法包括如下步驟(1) 在具塞試管中，分別加入HAc-NaAc緩沖溶液、KI和HRP;(2) 在步驟l的具塞試管中再加入H202，搖勻；(3) 將步驟2的試管置于溫水浴反應(yīng)，再加入TPB，搖勻，用蒸餾水定容；(4) 將上述所得溶液適量倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計(jì)上 掃描得到體系的吸收光譜，以不加HRP測(cè)得的吸光強(qiáng)度為空白；(5) 將上述所得溶液適量倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計(jì)上 測(cè)定304mn的吸光度，根據(jù)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)該曲線， Aabs=0.0801c+0.1252， R2=0.9981 ，即可求得辣根過(guò)氧化物酶在0.4 3.2 ng/ mL范 圍內(nèi)的濃度。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是步驟l所述的具塞試管為5.0mL， 加入的HAc-NaAc緩沖溶液，pH值為4.6 5.2，體積0.2~0.5mL，加入的KI濃 度為4 X l(T3 mol/L ~6 X l(T3 mol/L，加入的HRP濃度為0.1 pg/ mL，體積為10 80pL。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是步驟2所述的加入的H202濃度為1.0X10-5 3.0X10-5mol/L。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是步驟3所述的水浴溫度為20 30 。C，水浴反應(yīng)時(shí)間為25 50min， TPB濃度為2.0X 10-5 6.0X 10-5mol/L，用蒸 餾水定容至2.5ml。
6. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是步驟5所述的測(cè)定波長(zhǎng)為304nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用陽(yáng)離子表面活性劑締合物微粒分光光度法檢測(cè)痕量辣根過(guò)氧化物酶的方法，它是在具塞試管中，依次加入HAc-NaAc緩沖溶液、KI、HRP和H₂O₂，搖勻后，置于溫水浴中反應(yīng)，再加入TPB搖勻，定容，將所得溶液倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計(jì)上測(cè)定308nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得辣根過(guò)氧化物酶的濃度。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于KI作為HRP的氫供體底物，無(wú)毒易得；HRP催化氫受體底物H₂O₂具有特異性，本方法利用HRP催化H₂O₂氧化KI的反應(yīng)測(cè)定HRP活性，方法靈敏度高，選擇性好；設(shè)備簡(jiǎn)單，僅需紫外可見分光光度計(jì)和恒溫水浴槽；操作簡(jiǎn)便，試劑成本低廉。
文檔編號(hào)G01N21/25GK101201316SQ20071004997
公開日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2007年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月4日
發(fā)明者蔣治良, 紀(jì) 馬 申請(qǐng)人:廣西師范大學(xué)