專利名稱：血型a抗原表位模擬多肽及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是血型A抗原表位模擬多肽及其篩選方法。

背景技術(shù)：
A血型抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于糖蛋白，它們的結(jié)構(gòu)主要涉及到兩個(gè)分離座位的基因；H座位基因和A座位的基因，這些基因不直接產(chǎn)生抗原，而是產(chǎn)生糖基轉(zhuǎn)移酶，糖基轉(zhuǎn)移酶決定了A血型抗原的特異性。因此糖基轉(zhuǎn)移酶是基因的直接產(chǎn)物，而血型抗原決定簇的單糖或寡糖是基因的間接產(chǎn)物。A血型的抗原決定簇是連接在血型物質(zhì)的多聚糖前體或稱為載體鏈上。血型物質(zhì)的前體是多糖結(jié)構(gòu)。目前認(rèn)為A血型的抗原決定簇是低聚糖鏈結(jié)構(gòu)，但其確切結(jié)構(gòu)還不是很清楚。人體中ABO抗原廣泛存在于多種細(xì)胞的細(xì)胞膜上以及體液和分泌液中。正常情況下，每個(gè)個(gè)體可針對自已缺乏的A、B和H抗原，自然產(chǎn)生相對的特異性抗體。A型的抗-B和B型的抗-A主要是IgM類抗體，O型的抗-A、抗-B和抗-A、B通常是IgG類抗體。ABO抗體是移植排斥反應(yīng)的重要參與者。
噬菌體展示技術(shù)是后基因組時(shí)代蛋白質(zhì)研究的重要工具。噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)越性在于外源多肽被展示于噬菌體表面的衣殼蛋白上；所展示外源蛋白或多肽的基因型和表型在單個(gè)噬菌體中得到統(tǒng)一；篩選的高效性；操作過程簡單；耗費(fèi)低廉。這項(xiàng)技術(shù)自確立以來已廣泛用于對蛋白質(zhì)和(或)非蛋白質(zhì)之間配體-受體相互作用位點(diǎn)的研究。在抗原表位、細(xì)胞內(nèi)信號分子相互作用殘基的發(fā)現(xiàn)以及藥物篩選等方面應(yīng)用十分廣泛。有學(xué)者甚至認(rèn)為噬菌體展示文庫中的隨機(jī)多肽庫的應(yīng)用范圍僅僅受到人的想象力的限制。本技術(shù)利用噬菌體展示的多肽模擬天然存在的抗原表位，其中具有相同抗原表位特性而又與天然抗原表位在成分或結(jié)構(gòu)序列上不同的多肽被成為模擬表位(mimotope)。具有模擬抗原表位特性的噬菌體展示技術(shù)被廣泛用于模擬存在于糖蛋白、多糖等成分中抗原表位。
目前在臨床移植治療中由于缺乏合適的供體，因此發(fā)展組織ABO不相容器官移植成為必要。為了降低抗體介導(dǎo)的超急性、急性排斥反應(yīng)，就需要首先用血漿置換的方法去除ABO抗體。同時(shí)對受著血漿抗-A/B抗體水平的檢測也顯得尤為重要?；谘涂乖目贵w特異性親和濾除是減少血漿中抗體的最有效辦法。另外，目前所采用的血型抗體鑒定方法多是試管法，用目測來判斷結(jié)果，主觀因素影響程度高，檢測結(jié)果難以統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化。另外凝集反應(yīng)主要是檢測IgM，而IgG的檢測仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。采用包被血型抗原檢測抗體的ELISA方法則可以解決這些問題(Rieben，1997；Galili，2002)，并且ELISA方法敏感度高，可以充分利用ELISA自動(dòng)檢測系統(tǒng)從而節(jié)省資源。由于目前在親和濾除血型抗體和抗體檢測試驗(yàn)中所用的ABO抗原都是天然來源，或人工合成的寡糖成分，這些抗原存在來源不足，純度不高，不易于保存等缺點(diǎn)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的就是利用血型A單克隆抗體篩選噬菌體隨機(jī)十二肽庫以獲得血型A抗原表位的模擬多肽，從而提供血型A抗原的表位模擬多肽以及提供一種血型抗原表位模擬多肽的篩選方法。
本發(fā)明所述的兩種血型A抗原表位模擬多肽分別有如下氨基酸序列 Glu-Tyr-Trp-Tyr-Cys-Gly-Met-Asn-Arg-Thr-Gly-Cys 或Gln-Ile-Trp-Tyr-Glu-Arg-Thr-Leu-Pro-Phe-Thr-Phe 本發(fā)明的篩選方法為 (1)、用NaHCO3緩沖液稀釋血型A抗原特異性的單克隆抗體NAM87-1F6并包被ELISA板，置于濕盒中4℃孵育16小時(shí)； (2)、用封閉緩沖液室溫封閉，用含吐溫20的TBS洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌； (3)、向包被有單克隆抗體的微孔中加入篩選用噬菌體，緩慢震搖使噬菌體與包被抗體充分接觸，用含吐溫20的TBS洗滌去除未結(jié)合的噬菌體； (4)、用甘氨酸-鹽酸緩沖液室溫洗脫結(jié)合的噬菌體，中和后在宿主菌ER2738中擴(kuò)增噬菌體，作為下一輪篩選的投入物，同時(shí)測定洗脫物和投入物的滴度； (5)、重復(fù)上述步驟共進(jìn)行三輪篩選，從第三輪篩選后的洗脫物滴定平板中隨機(jī)挑選32個(gè)噬菌體克隆，進(jìn)行噬菌體ELISA、噬菌體微篩選，得到本發(fā)明物，并采用DNA測序和噬菌體凝集抑制實(shí)驗(yàn)等方法分析。
本發(fā)明所述的血型A抗原表位模擬肽的篩選方法，通過改變每輪篩選中包被抗體量、封閉物、噬菌體與抗體的孵育時(shí)間以及TBST溶液(TBS+Tween20)中Tween20的濃度使噬菌體隨機(jī)肽庫中與抗體結(jié)合的陽性噬菌體遞增。具體為第一、二、三輪篩選時(shí)抗體包被量分別為10μg、7.5μg、5μg；封閉物分別為牛血清白蛋白(BSA)、明膠、牛血清白蛋白；噬菌體與抗體孵育時(shí)間分別為60min、30min、30min；Tween20濃度為0.1％、0.5％、0.5％。
本發(fā)明的血型A抗原表位模擬多肽可以用于血型A抗體的檢測和血型A抗體的親合濾除。
本發(fā)明所述的篩選方法另一個(gè)特點(diǎn)是選用了噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫，這樣篩選到的噬菌體多肽為十二個(gè)氨基酸的序列。之所以選用噬菌體隨機(jī)十二肽庫是因?yàn)槭淖阋阅M構(gòu)像性和線性抗原表位。
本發(fā)明所述的噬菌體ELISA方法是用噬菌體包被微孔板鑒定噬菌體與血型A抗原特異性抗體的結(jié)合，這與肽庫的篩選過程相反，反方向證明噬菌體展示多肽與血型A抗原特異性抗體的特異性結(jié)合能力。
本發(fā)明所述的噬菌體微篩選方法分別采用單個(gè)噬菌體克隆與包被的血型A抗原特異性抗體結(jié)合，TBST反復(fù)洗滌后，用甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.2)洗脫結(jié)合的噬菌體并測定滴度。用噬菌體原肽庫作為陰性對照。陽性噬菌體克隆的洗脫物滴度明顯高于陰性對照中洗脫物滴度。表明單克隆噬菌體能與血型A抗原特異性抗體結(jié)合。
本發(fā)明所述的噬菌體凝集抑制實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的單克隆噬菌體與血型A抗原特異性抗體預(yù)先孵育，用此孵育過的抗體與A型洗滌紅細(xì)胞進(jìn)行凝集實(shí)驗(yàn)。噬菌體原肽庫作為陰性對照。直接證明噬菌體展示多肽與天然血型A抗原的交叉反應(yīng)現(xiàn)象。



圖1.ELISA檢測各個(gè)噬菌體克隆與血型A抗原特異性單克隆抗體結(jié)合的結(jié)果 圖2.噬菌體微篩選檢測各個(gè)噬菌體克隆與血型A抗原特異性單克隆抗體結(jié)合的結(jié)果 圖3.凝集抑制試驗(yàn)檢測噬菌體克隆對血型單克隆抗體凝集A型紅細(xì)胞的抑制作用的結(jié)果TU噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)單位
具體實(shí)施例方式 1.主要材料及其來源 1)血型A抗原單克隆抗體(cloneNaM87-1F6)購自美國BD公司。
2)噬菌體展示隨機(jī)12肽庫源自美國NEB公司。
3)ELISA微孔板購自德國Greiner公司。
4)生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素購自北京中杉。
5)其它試劑均為國產(chǎn)分析純。
2.方法與結(jié)果 1)噬菌體肽庫的篩選 0.1M NaHCO3(pH8.6)稀釋抗體NAM87-1F6，50μl包被一ELISA微孔。溶于0.1M NaHCO3(pH8.6)緩沖液的5mg/mlBSA同時(shí)包被一孔作對照。包被微孔置于濕盒中4℃孵育16小時(shí)。含5mg/ml BSA的0.1M NaHCO3(pH8.6)緩沖液室溫封閉1h后用TBS和Tween20的混合液(TBST)洗滌微孔。
預(yù)先將含1mg/ml BSA的TBST與一定量的文庫(或者第一，二輪篩選的洗脫擴(kuò)增物)噬菌體室溫孵育1h，然后投入到包被的ELISA微孔中，室溫振蕩孵育一定時(shí)間。TBST洗滌10次。加入0.2mol/L的甘氨酸-鹽酸(含1mg/ml BSA，pH2.2)洗脫液振蕩孵育10min，取出洗脫液并加入1mol/L Tris-HCl(pH9.1)中和液中和。取1μl中和液測定噬菌體滴度，其余加入準(zhǔn)備好的宿主菌ER.2738中擴(kuò)增并用PEG/NaCl純化?？偣策M(jìn)行三輪篩選第一輪篩選包被10μg抗體，TBST中Tween20濃度為0.1％(v/v)，噬菌體與包被抗體的孵育時(shí)間為1h；第二輪篩選中用明膠代替BSA封閉ELISA微孔和稀釋噬菌體，另外在第二，三輪篩選中分別包被7.5μg、5μg抗體，TBST中Tween20濃度為0.5％(v/v)，噬菌體與包被抗體的孵育時(shí)間為30min。第三輪篩選后的洗脫物中和液只測定滴度。從滴度平板中隨機(jī)挑取32個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增、純化并測定滴度。在第二輪篩選的靶分子較第一輪篩選的靶分子少，變換封閉物且孵育時(shí)間減半和洗滌液Tween20濃度提高了5倍的情況下富集率(產(chǎn)出/投入值)較第一輪降低近5.7倍。在接下來的第三輪篩選中靶分子量再次降低，富集率較第二輪提高近53倍(表1)。
表1.三輪篩選投入、產(chǎn)出及富集率情況 2)噬菌體ELISA 5×1010TU/ml噬菌體(溶于TBS)包被ELISA微孔，濕盒中4℃過夜。第二天TBST(含0.5％Tween 20)洗滌5次，每孔加入0.5μg抗體NaM87-1F6，37℃孵育1h后，TBST洗滌10次。每孔加入1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記親和素，37℃孵育30min后，TBST洗滌10次。以TMB(3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺)為底物顯色，測定A450nm。每個(gè)克隆包被兩孔。噬菌體原肽庫作為陰性對照。隨機(jī)挑取的32個(gè)噬菌體克隆與抗體結(jié)合后檢測A值加圖1。
3)噬菌體微篩選(micropanning) 抗體NAM87-1F60.25μg/孔包被ELISA平板，4℃濕盒中過夜。TBST洗滌5次。5mg/ml BSA封閉微孔。5×104TU/孔加入噬菌體，37℃震搖4h，濕盒中室溫反應(yīng)約2h。TBST洗滌10次。加入洗脫液室溫震搖8min。取出洗脫物加入中和液中和，并測定滴度。原肽庫擴(kuò)增的噬菌體和不包被抗體的BSA封閉孔作為對照。噬菌體ELISA信號較強(qiáng)的11個(gè)克隆中有7個(gè)克隆在本實(shí)驗(yàn)后得到較高的噬菌體滴度。(圖2) 4)噬菌體DNA序列的測定，以及展示多肽的推導(dǎo)提取單克隆噬菌體的基因組DNA。10μl送Ivitrogen公司測序，測序引物為CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG。用DNAStar軟件分析測序獲得的噬菌體外源基因，7個(gè)噬菌體克隆的序列中有6個(gè)完全相同，最后推導(dǎo)出的兩個(gè)多肽序列如下 1.GAG TAT TGG TAT TGT GGT ATG AAT AGG ACT GGT TGT Glu-Tyr-Trp-Tyr-Cys-Gly-Met-Asn-Arg-Thr-Gly-Cys 2.CAG ATT TGG TAT GAG AGG ACG CTT CCG TTT ACG TTT Gln-Ile-Trp-Tyr-Glu-Arg-Thr-Leu-Pro-Phe-Thr-Phe 5)噬菌體競爭凝集抑制試驗(yàn) 在BD公司抗體凝集試驗(yàn)說明書的基礎(chǔ)上略有改動(dòng)。1∶100稀釋的抗體NAM87-1F6與不同量的單克隆噬菌體(0TU、108TU、1010TU)于37℃孵育30min后加入1％懸浮洗滌紅細(xì)胞，37℃孵育4h。原肽庫的擴(kuò)增物作為陰性對照。取10μl涂片，顯微鏡下觀察凝集現(xiàn)象。結(jié)果顯示兩種克隆的噬菌體都可以對抗體的凝集反應(yīng)產(chǎn)生明顯的抑制作用(圖3)。
氨基酸序列表
<110>胡麗華，湯兆明
<120>血型A抗原模擬多肽及其篩選方法
<130>patentl
<140>2007-04-24
<141>2007-04-24
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人工(Artificial)
<400>1
Glu Tyr Trp Tyr Cys Gly Met Asn Arg Thr Gly Cys
1 5 10
<210>2
<211>12
<212>PRT
<213>人工(Artificial)
<400>2
Gln Ile Trp Tyr Glu Arg Thr Leu Pro Phe Thr Phe
1 5 10
權(quán)利要求
1、一種血型A抗原表位模擬多肽，其氨基酸序列為
Glu-Tyr-Trp-Tyr-Cys-Gly-Met-Asn-Arg-Thr-Gly-Cys
或Gln-Ile-Trp-Tyr-Glu-Arg-Thr-Leu-Pro-Phe-Thr-Phe。
2、血型A抗原表位模擬多肽的篩選方法，它包括以下步驟
(1)、用NaHCO3緩沖液稀釋血型A抗原特異性的單克隆抗體NAM87-1F6，并包被ELISA板；
(2)、用封閉緩沖液室溫封閉，用TBS和Tween20的混合液進(jìn)行洗滌；
(3)、向包被有單克隆抗體的微孔中加入篩選用噬菌體，緩慢振搖，使噬菌體與包被抗體充分接觸，用TBS和Tween20的混合液洗滌去除未結(jié)合的噬菌體；
(4)、用甘氨酸-鹽酸緩沖液室溫洗脫結(jié)合的噬菌體，中和液中和后在宿主菌ER2738中擴(kuò)增噬菌體，作為下一輪篩選的投入物，同時(shí)測定洗脫物和投入物的滴度；
(5)、重復(fù)上述步驟共進(jìn)行三輪篩選，從第三輪篩選后的洗脫物滴定平板中隨機(jī)挑選32個(gè)噬菌體克隆，進(jìn)行噬菌體ELISA、噬菌體微篩選，得到本發(fā)明物。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的血型A抗原表位模擬多肽的篩選方法，其特征在于第一、二、三輪篩選中包被用抗體的量依次為10μg、7.5μg、5μg，Tween20的濃度依次為0.1％、0.5％、0.5％，ELISA微孔中的封閉依次為牛血清白蛋白、明膠、牛血清白蛋白。
4、血型A抗原表位模擬多肽用于制備多肽制劑的用途，其特征是將血型A抗原模擬多肽用于血型A抗體的檢測和血型A抗體的親合濾除。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血型A抗原表位模擬多肽及其篩選方法。其氨基酸序列為Glu-Tyr-Trp-Tyr-Cys-Gly-Met-Asn-Arg-Thr-Gly-Cys或Gln-Ile-Trp-Tyr-Glu-Arg-Thr-Leu-Pro-Phe-Thr-Phe。其篩選方法是用NaHCO3緩沖液稀釋血型A抗原特異性的單克隆抗體并包被ELISA板；向包被有單克隆抗體的微孔中加入篩選用噬菌體，用甘氨酸-鹽酸緩沖液室溫洗脫結(jié)合的噬菌體，中和后在宿主菌ER2738中擴(kuò)增噬菌體，作為下一輪篩選的投入物，共進(jìn)行三輪篩選，對第三輪篩選后挑取的32個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行進(jìn)一步鑒定后得到本發(fā)明物。它可以用于血型A抗體的檢測和血型A抗體的親合濾除。
文檔編號G01N33/80GK101096381SQ200710052419
公開日2008年1月2日 申請日期2007年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月4日
發(fā)明者胡麗華, 湯兆明, 李一榮, 崔天盆 申請人:胡麗華, 湯兆明