專利名稱：磁凝集法梅毒螺旋體抗體檢測試劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及人血清中梅毒螺旋體抗體的檢測。
背景技術：
梅毒是一種臨床表現(xiàn)極為復雜，幾乎可累及全身各器官的性病，并可通過胎盤傳播給下一代，由于梅毒對人類的危害嚴重，所以世界各地均將其作為重要的社會和醫(yī)療問題給以高度重視。另外，及時區(qū)分梅毒陽性患者和實驗引起的假陽性結果的病人，可以阻斷病人的心理壓力和盲目治療。
血清學抗體檢測是目前各國梅毒病例發(fā)現(xiàn)和診斷的主要依據(jù)。常規(guī)的梅毒血清學檢測包括初篩和確證兩個步驟。初篩試驗(如VDRL、RPR、TRUST等)為梅毒螺旋體非特異性抗體檢測方法，雖然該法簡便、快捷，僅需一臺平板振蕩器、8分鐘判讀結果，但敏感性及特異性差，與風濕性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等系統(tǒng)性疾病以及其它類螺旋體等偶可發(fā)生交叉反應，出現(xiàn)假陽性結果，故該法主要用于療效觀察和預后判定。梅毒確證采用梅毒螺旋體特異性抗體檢測方法(如FTA-ABS、TP-ELIASA、免疫印跡法、TPHA、TPPA等)。目前常規(guī)使用的梅毒確證試驗操作較復雜，耗費時間長，需專門的儀器設備，價格比較昂貴。新近有用PCR原理檢測梅毒的方法，其靈敏度、特異性都非常好，在梅毒早期、二期、三期均可檢出梅毒螺旋體，且不與其它螺旋體發(fā)生交叉反應，但微量的污染即可得出假陽性結果，還易受標本中組織、細胞等物質(zhì)抑制導致出現(xiàn)假陰性結果，故未能推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將重組梅毒抗原包被在磁性微粒表面上，采用磁凝集法對梅毒螺旋體抗體進行檢測試劑及檢測方法。
本發(fā)明中制成磁粒的有效成分的原料重量份組成為NaOH2.5～3.5 HCl0.25～0.35FeCl2·4H2O 1.49～2.5FeCl3·6H2O 3.5～4.6本發(fā)明中制成磁粒的有效成分的原料重量份組成為NaOH 2.5～3.5 HCl0.25～0.35FeCl2·4H2O 1.49～2.5FeCl3·6H2O 3.5～4.6乙二胺四乙酸二鈉 1.12 氯化膽堿 30NaH2PO20.94 Na2HPO2·12H2O 2.96牛血清白蛋白3。
本發(fā)明磁凝集法梅毒螺旋體抗體檢測試劑制備方法步驟是(1)、制備鐵液稱取FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O，用HCl溶液溶解于同一容器內(nèi)，過濾后用HCl溶液定容；(2)、制備磁粒室溫條件下，將氮源、通氣管道、反應器和攪拌器裝好，向反應器內(nèi)加入NaOH，并向反應器內(nèi)持續(xù)通入氮氣，啟動攪拌器以每分鐘10000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進行攪拌，將鐵液沿容器壁勻速加到反應器內(nèi)，室溫攪拌50分鐘后關閉攪拌器電源和氮氣閥門，結束反應；將反應器內(nèi)液體移至三角燒瓶內(nèi)，加入與三角煤瓶內(nèi)液體等體積純化水，在磁場中作用至液體澄清、磁粒聚集，吸棄上清；重復五次，最后將反應產(chǎn)物用純化水懸起，定容；(3)、制備成品a、配制稀釋液將EDTA、氯化膽堿、磷酸鹽、BSA裝入刻度瓶內(nèi)混勻備用；b、平衡搖勻微粒立刻用刻度吸管加到瓶內(nèi)，置于磁場中作用直到液體澄清、磁粒聚集，吸棄上清，移離磁場，將磁粒用等體積純化水懸起，共洗滌3次，最后一次用PBS緩沖液懸起；c、取重組梅毒螺旋體聯(lián)合抗原，用PBS補足體積；d、包被將c步的梅毒螺旋體抗原的混合液加于磁性微粒液中，混合均勻后置室溫孵育30分鐘，期間持續(xù)慢搖，之后將磁粒用生理鹽水洗滌除去未結合的抗原，共洗滌6次，每次用10毫升生理鹽水，棄掉最后一次洗液的沉淀物即為包被后磁粒；e、封閉將包被后的磁粒用BSA懸起，置37℃搖床振搖2小時，之后用新配的稀釋液洗滌6次，最后一次用20ml稀釋緩沖液懸起，即為原液。
本發(fā)明中制成試劑盒的有效成分包括濃度大于95％的重組梅毒螺旋體抗原0.45～0.6本發(fā)明磁凝集法梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒的制備方法是取原液檢定，根據(jù)效價結果，將原液用稀釋緩沖液配至工作濃度，即為半成品。
半成品檢定抽取半成品做半成品檢測。
分裝半成品檢定合格后分裝。
成品檢定隨機從分裝產(chǎn)品中抽取樣品做檢定。
包裝成品檢定合格后貼標簽、裝盒后即為成品。
本發(fā)明的有益效果是1.TPMPA質(zhì)量達到達到中檢所梅毒確診試劑標準。特異性試驗中，陰、陽性參比品符合率均為100％，靈敏度檢測中，L1、L2檢出陽性，L3、L4檢出陰性。精密度試驗結果均在±1個稀釋度范圍內(nèi)。
2.TPMPA與作為梅毒確診試劑的梅毒明膠凝集法試劑(TPPA日本富士試劑)做對比，兩者的一致性達到了98.6％。然而TPMPA對比TPPA具有以下優(yōu)勢檢測時間僅需要8分鐘，檢測結果更易判讀。
3.TPMPA產(chǎn)品特點方法簡便磁凝集法，不需要復雜儀器設備操作便捷操作程序、判定方式與RPR相似，結果容易讀取檢測快速從檢測到結果判讀僅需8分鐘特異性98.6％靈敏度97.1％儲存方便產(chǎn)品于2-8℃條件下保存15個月質(zhì)控嚴格產(chǎn)品帶有陰陽性對照質(zhì)控品，對比明顯，消晰易判讀。
具體實施例方式實施例1NaOH 2.5 HCl 0.25FeCl2·4H2O 1.49FeCl3·6H2O 3.5(1)制備鐵液稱取FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O，用HCl溶液溶解于同一容器內(nèi)，過濾后用HCl溶液定容；(2)制備磁粒室溫條件下，將氮源、通氣管道、反應器和攪拌器裝好，向反應器內(nèi)加入NaOH，并向反應器內(nèi)持續(xù)通入氮氣，啟動攪拌器以每分鐘10000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進行攪拌，將鐵液沿容器壁勻速加到反應器內(nèi)，室溫攪拌50分鐘后關閉攪拌器電源和氮氣閥門，結束反應；將反應器內(nèi)液體移至三角燒瓶內(nèi)，加入與三角煤瓶內(nèi)液體等體積純化水，在磁場中作用至液體澄清、磁粒聚集，吸棄上清；重復五次，最后將反應產(chǎn)物用純化水懸起，定容。
實施例2NaOH 3 HCl 0.29FeCl2·4H2O 1.94 FeCl3·6H2O 4.05制備方法同實施例1。
實施例3NaOH 3.5 HCl 0.35FeCl2·4H2O 2.5 FeCl3·6H2O 4.6制備方法同實施例1。
實施例4NaOH 2.5 HCl 0.25FeCl2·4H2O 1.49FeCl3·6H2O 3.5乙二胺四乙酸二鈉 1.12 氯化膽堿 30NaH2PO20.94Na2HPO2·12H2O 2.96牛血清白蛋白3制備方法是(1)、制備鐵液稱取FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O，用HCl溶液溶解于同一容器內(nèi)，過濾后用HCl溶液定容；(2)、制備磁粒室溫條件下，將氮源、通氣管道、反應器和攪拌器裝好，向反應器內(nèi)加入NaOH，并向反應器內(nèi)持續(xù)通入氮氣，啟動攪拌器以每分鐘10000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進行攪拌，將鐵液沿容器壁勻速加到反應器內(nèi)，室溫攪拌50分鐘后關閉攪拌器電源和氮氣閥門，結束反應；將反應器內(nèi)液體移至三角燒瓶內(nèi)，加入與三角煤瓶內(nèi)液體等體積純化水，在磁場中作用至液體澄清、磁粒聚集，吸棄上清；重復五次，最后將反應產(chǎn)物用純化水懸起，定容；(3)、制備成品a、配制稀釋液將EDTA、氯化膽堿、磷酸鹽、BSA裝入刻度瓶內(nèi)混勻備用；b、平衡搖勻微粒立刻用刻度吸管加到瓶內(nèi)，置于磁場中作用直到液體澄清、磁粒聚集，吸棄上清，移離磁場，將磁粒用等體積純化水懸起，共洗滌3次，最后一次用PBS緩沖液懸起；
c、取重組梅毒螺旋體聯(lián)合抗原，用PBS補足體積；d、包被將c步的梅毒螺旋體抗原的混合液加于磁性微粒液中，混合均勻后置室溫孵育30分鐘，期間持續(xù)慢搖，之后將磁粒用生理鹽水洗滌除去未結合的抗原，共洗滌6次，每次用10毫升生理鹽水，棄掉最后一次洗液的沉淀物即為包被后磁粒；e、封閉將包被后的磁粒用BSA懸起，置37℃搖床振搖2小時，之后用新配的稀釋液洗滌6次，最后一次用20ml稀釋緩沖液懸起，即為原液。
實施例5NaOH 3HCl 0.29FeCl2·4H2O 1.94 FeCl3·6H2O 4.05乙二胺四乙酸二鈉 1.12 氯化膽堿 30NaH2PO20.94 Na2HPO2·12H2O 2.96牛血清白蛋白3制備方法同實施例4。
實施例6NaOH 3.5 HCl 0.35FeCl2·4H2O 2.5 FeCl3·6H2O 4.6乙二胺四乙酸二鈉 1.12 氯化膽堿 30NaH2PO20.94 Na2HPO2·12H2O 2.96牛血清白蛋白3制備方法與實施例4相同。
1M NaOH(氫氧化鈉)0.17M HCl(鹽酸)FeCl2·4H2O(四水氯化亞鐵)FeCl3·6H2O(六水氯化鐵)0.25M EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)40％Choline Chloride(氯化膽堿)20mM PB(pH6.9)(磷酸鹽緩沖液)5％BSA(牛血清白蛋白)純化水上述材料應符合現(xiàn)行《中國藥典》或《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)量控制標準》的要求。
電子天平(d＝0.1mg)氮源反應器攪拌器1000ml三角燒瓶500ml燒杯500玻璃瓶刻度吸管漏斗、濾紙 1.準備a.0.25M EDTA配制b.40％氯化膽堿配制c.20mM PBS(pH6.9)配制d.5％BSA2.制備鐵液a.稱量用電子天平精確稱取1.94克FeCl2·4H2O、和4.05克FeCl3·6H2O；b.溶解將所稱取的兩種稱取物用少量新配制的0.17M HCl溶液溶于一個燒杯內(nèi)；c.過濾將溶解的鐵液過濾，并用0.17M HCl溶液將濾過液體積補至45毫升備用。
3.制備磁粒a、組裝室溫條件下，將氮源、通氣管道、反應器和攪拌器安裝、調(diào)試；b.添入反應物質(zhì)I向反應器內(nèi)加入75毫升1M NaOH；c.添入反應物質(zhì)II向反應器內(nèi)通入氮氣；
d.啟動系統(tǒng)接通攪拌器電源，以每分鐘10000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進行攪拌；e.添入反應物質(zhì)III系統(tǒng)運行10分鐘時，將制備的鐵液沿器壁勻速在5分鐘時間內(nèi)加到反應器內(nèi)；f.關閉系統(tǒng)室溫持續(xù)通入氮氣、10000rpm繼續(xù)攪拌50分鐘后關閉攪拌瓶電源和氮氣閥門，結束反應。
g.洗滌將反應產(chǎn)物移至1000ml三角燒瓶內(nèi)，加入與反應產(chǎn)物等體積的純化水，混勻后置磁場中作用至液體澄清、磁粒聚集，棄去上清，沉淀用純化水懸起；再洗滌五次，每次用純化水350毫升，洗PH值至中性。
h.保存將聚集的磁粒用純化水懸起，肉眼觀察不應有顆粒聚集現(xiàn)象。定容至500毫升保存于500ml玻璃瓶內(nèi)，4℃存放備用。
4.制備成品a.配制稀釋緩沖液分別取12毫升0.25M EDTA、75毫升40％氯化膽堿、150毫升20mM PB(pH6.9)和60毫升5％BSA，混勻備用。
b.平衡將步驟3.h洗滌后待用的微粒充分搖勻，立刻用刻度吸管取20毫升，加到20毫升瓶內(nèi)，將其置磁場中作用直至液體澄清、磁粒聚集，吸棄上清，移離磁場，將磁粒用等體積純化水懸起，共洗滌3次，最后一次洗滌后將磁粒用4毫升20mM PB緩沖液懸起；取重組梅毒螺旋體聯(lián)合抗原20ug，用20mM PB(pH9.0)補足體積至1毫升。
c.包被將梅毒抗原液加于磁性微粒液中，混合均勻后置室溫孵育30分鐘，期間持續(xù)慢搖。之后將磁粒用生理鹽水洗滌除去未結合的抗原，共洗滌6次，每次用10毫升生理鹽水。棄掉最后一次洗液的沉淀物即為包被后磁粒。
d.封閉將包被后的磁粒用5％的BSA懸起，置37℃搖床振搖2小時。之后用新配的稀釋液洗滌6次，每次用10毫升稀釋液。最后一次用20ml稀釋緩沖液懸起，即為原液。
e.產(chǎn)品配制取100ul原液做原液(效價)檢定(見步驟5.a)，根據(jù)效價結果，將原液用稀釋緩沖液配至工作濃度(200U/ml)，即為半成品。
f.半成品檢定抽取半成品做半成品(特異性)檢測(見步驟5.b)。
g.分裝半成品檢定合格后分裝，每支分裝1.0ml。
h.成品檢定隨機從分裝產(chǎn)品中抽取10支做(外觀和變異系數(shù))檢定(見步驟5.c、d)。
i.包裝成品檢定合格后貼標簽、裝盒后即為成品。
5.檢定a.效價該試驗在23～29℃環(huán)境下進行。將梅毒陽性參考血清加于紙卡的相應反應區(qū)內(nèi)，再分別加入不同稀釋的檢品，600rpm充分振搖1分鐘后置MPC中作用1分鐘，待有微粒出現(xiàn)后繼續(xù)振搖600rpm 1分鐘，判讀結果。以出現(xiàn)凝集反應的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)作為該檢品的效價。
工作濃度以出現(xiàn)凝集反應的次高稀釋倍數(shù)的作為檢品的工作濃度。
b.特異性試驗在23～29℃環(huán)境下進行。分別滴加梅毒陽性和陰性參考血清于紙卡反應區(qū)內(nèi)，再分別加入檢品，600rpm充分振搖1分鐘混合后置MPC中作用1分鐘，待有微粒出現(xiàn)后繼續(xù)振搖600rpm 1分鐘，判讀結果。陰性參比品檢測結果應為陰性，陽性參比品檢測結果應為陽性。
c.變異系數(shù)(CV)滴加梅毒精密度參考血清滴于紙卡內(nèi)，再分別隨機抽取10支檢品分別加入相應反應區(qū)內(nèi)，600rpm充分振搖1分鐘混合后置MPC中作用1分鐘，待有微粒出現(xiàn)后繼續(xù)振搖600rpm 1分鐘，判讀結果。試驗結果應均在±1個稀釋度范圍內(nèi)。
d.外觀黑褐色懸濁液，無搖不散的凝塊或雜質(zhì)。
※PB緩沖液(150毫升20mM PB緩沖液pH6.9)是NaH2PO20.94克和Na2HPO2·12H2O2.96克的混合液。
實施例7試劑盒中包括濃度大于95％的重組梅毒螺旋體抗原0.45取原液檢定，根據(jù)效價結果，將原液用稀釋緩沖液配至工作濃度，即為半成品。
半成品檢定抽取半成品做半成品檢測。
分裝半成品檢定合格后分裝。
成品檢定隨機從分裝產(chǎn)品中抽取樣品做檢定。
包裝成品檢定合格后貼標簽、裝盒后即為成品。
實施例8試劑盒中包括濃度大于95％的重組梅毒螺旋體抗原0.5制備方法與實施例7相同。
實施例9
試劑盒中包括濃度大于95％的重組梅毒螺旋體抗原0.6制備方法與實施例7相同。
權利要求
1.一種磁凝集法梅毒螺旋體抗體檢測試劑，其特征在于其中制成磁粒的有效成分的原料重量份組成為NaOH 2.5～3.5HCl0.25～0.35FeCl2·4H2O 1.49～2.5FeCl3·6H2O 3.5～4.6。
2.根據(jù)權利要求1所述的磁凝集法梅毒螺旋體抗體檢測試劑，其特征在于其中制成磁粒的有效成分的原料重量份組成為NaOH2.5～3.5 HCl0.25～0.35FeCl2·4H2O1.49～2.5FeCl3·6H2O3.5～4.6乙二胺四乙酸二鈉1.12氯化膽堿30NaH2PO20.94Na2HPO2·12H2O2.96牛血清白蛋白3。
3.一種磁凝集法梅毒螺旋體抗體檢測試劑制備方法，其特征在于其步驟是(1)、制備鐵液稱取FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O，用HCl溶液溶解于同一容器內(nèi)，過濾后用HCl溶液定容；(2)、制備磁粒室溫條件下，將氮源、通氣管道、反應器和攪拌器裝好，向反應器內(nèi)加入NaOH，并向反應器內(nèi)持續(xù)通入氮氣，啟動攪拌器以每分鐘10000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進行攪拌，將鐵液沿容器壁勻速加到反應器內(nèi)，室溫攪拌50分鐘后關閉攪拌器電源和氮氣閥門，結束反應；將反應器內(nèi)液體移至三角燒瓶內(nèi)，加入與三角煤瓶內(nèi)液體等體積純化水，在磁場中作用至液體澄清、磁粒聚集，吸棄上清；重復五次，最后將反應產(chǎn)物用純化水懸起，定容；(3)、制備成品a、配制稀釋液將EDTA、氯化膽堿、磷酸鹽、BSA裝入刻度瓶內(nèi)混勻備用；b、平衡搖勻微粒立刻用刻度吸管加到瓶內(nèi)，置于磁場中作用直到液體澄清、磁粒聚集，吸棄上清，移離磁場，將磁粒用等體積純化水懸起，共洗滌3次，最后一次用PBS緩沖液懸起；c、取重組梅毒螺旋體聯(lián)合抗原，用PBS補足體積；d、包被將c步的梅毒螺旋體抗原的混合液加于磁性微粒液中，混合均勻后置室溫孵育30分鐘，期間持續(xù)慢搖，之后將磁粒用生理鹽水洗滌除去未結合的抗原，共洗滌6次，每次用10毫升生理鹽水，棄掉最后一次洗液的沉淀物即為包被后磁粒；e、封閉將包被后的磁粒用BSA懸起，置37℃搖床振搖2小時，之后用新配的稀釋液洗滌6次，最后一次用20ml稀釋緩沖液懸起，即為原液。
4.根據(jù)權利要求1所述的磁凝集法梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒，其特征在于其中制成試劑盒的有效成分包括濃度大于95％的重組梅毒螺旋體抗原0.45～0.6。
5.根據(jù)權利要求3所述的磁凝集法梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征在于取原液檢定，根據(jù)效價結果，將原液用稀釋緩沖液配至工作濃度，即為半成品。半成品檢定抽取半成品做半成品檢測。分裝半成品檢定合格后分裝。成品檢定隨機從分裝產(chǎn)品中抽取樣品做檢定。包裝成品檢定合格后貼標簽、裝盒后即為成品。
全文摘要
一種磁凝集法梅毒螺旋體抗體檢測試劑，涉及人血清中梅毒螺旋體抗體的檢測。本發(fā)明的目的是將重組梅毒抗原包被在磁性微粒表面上，采用磁凝集法對梅毒螺旋體抗體進行檢測試劑及檢測方法。本發(fā)明中制成磁粒的有效成分的原料重量份組成為NaOH、HCl、FeCl
文檔編號G01N33/571GK101074957SQ20071005575
公開日2007年11月21日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權日2007年6月13日
發(fā)明者李勇, 隋寶珍 申請人:李勇