專(zhuān)利名稱(chēng)：Hcmvpp65抗原血癥間接免疫熒光法檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于特別涉及一種HCMVPP65抗原血癥間接免疫熒光法檢測(cè)試劑盒。
技術(shù)背景國(guó)外巨細(xì)胞感染檢溯相關(guān)技術(shù)的研究與開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀盡管病毒殼脫落離心培養(yǎng)技術(shù)得到了 極其廣泛的應(yīng)用，但其耗時(shí)較長(zhǎng)，結(jié)果受標(biāo)本保存時(shí)間影響大，所以其臨床應(yīng)用價(jià)值尚不明 朗。血清學(xué)試驗(yàn)由于只能在感染2 4W后才能檢出陽(yáng)性結(jié)果，而且受器官移植后免疫抑制劑 的影響，不能分辯潛伏性感染和活動(dòng)性感染，其臨床應(yīng)用價(jià)值受到一定的限制。近來(lái)，國(guó)外 報(bào)道了標(biāo)準(zhǔn)化的HCMV分析法有助于預(yù)測(cè)HCMV病?？乖Y檢測(cè)技術(shù)是一種更快速、更敏感、 早期檢測(cè)CMV活動(dòng)性感染的技術(shù)，pp65抗原分析能敏感地在早期預(yù)測(cè)HCMV病.在出現(xiàn)臨床 癥狀以前，抗原血癥檢測(cè)技術(shù)和PCR技術(shù)均可檢測(cè)和鑒定出CMV的感染。目前HCMVpp65抗 原血癥檢測(cè)試劑盒在國(guó)外已有兩家公司商品化，并在美國(guó)FDA注冊(cè)。在我國(guó)己有此方面的診 斷技術(shù)引入，但均為進(jìn)口試劑。國(guó)內(nèi)巨細(xì)胞感染檢測(cè)相關(guān)技術(shù)的研究與開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀目前，國(guó)內(nèi)對(duì)器官移植患者的感染合 并癥,雖然臨床上經(jīng)常遇到,但實(shí)際認(rèn)識(shí)水平大都不高，研究也不多，診斷手段還不全,廣泛使 用的還是血清學(xué)診斷方法，不能夠達(dá)到早期診斷地目的。在國(guó)內(nèi)采用的同類(lèi)產(chǎn)品全部是進(jìn)口 試劑，而至今在我國(guó)尚未有開(kāi)發(fā)上市的國(guó)產(chǎn)試劑，雖有應(yīng)用方面的相關(guān)研究，但國(guó)內(nèi)未見(jiàn)研 制和生產(chǎn)方面的研究。我們目前的研究表明， 一旦出現(xiàn)CMV感染的臨床癥狀，抗病毒藥物不能控制該病的病理 進(jìn)程，這意味著抗病毒藥物必須在CMV感染的臨床癥狀出現(xiàn)前就使用，這就有賴(lài)于實(shí)驗(yàn)室的 分析來(lái)預(yù)測(cè)CMV病。本研究前瞻性地研究了白細(xì)胞中CMV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與CMV臨床癥狀之 間的關(guān)系，證實(shí)CMV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量可以預(yù)測(cè)CMV臨床癥狀，其峰值要比CMV感染臨床癥狀 出現(xiàn)早廣2個(gè)月。因此我們認(rèn)為使用HCMVpp65抗原血癥間接免疫熒光法檢測(cè)白細(xì)胞中CMV陽(yáng) 性細(xì)胞數(shù)量是一個(gè)簡(jiǎn)單、快速而敏感的預(yù)測(cè)CMV感染的方法。原有的HCMVP65抗原血癥間接 免疫熒光法檢測(cè)試，制作方法落后，過(guò)程復(fù)雜，中間過(guò)程控制較難，結(jié)果不理想。特異性與 敏感性低。從巨細(xì)胞pp65單克隆抗體制備的角度，研究了白細(xì)胞中CMV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與CMV臨床 癥狀之間的關(guān)系。通過(guò)新型抗體組的開(kāi)發(fā)，提高試劑的敏感度，增加陽(yáng)性樣本細(xì)胞的著色數(shù)量。此理論基礎(chǔ)已從臨床應(yīng)用中獲得驗(yàn)證，陽(yáng)性樣本的染色細(xì)胞數(shù)量明顯高于國(guó)外試劑。彌補(bǔ)無(wú)同類(lèi)國(guó)產(chǎn)試劑空白，臨床評(píng)估證明產(chǎn)品性能已達(dá)國(guó)際水平。應(yīng)用pp65抗原血癥檢 指導(dǎo)抗病毒藥物的使用進(jìn)行早期性預(yù)排空治療，對(duì)提高器官移植存活率意義重大。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種HCMVP65抗原血癥間接免疫熒光法檢瀵試劑。 方法先進(jìn)，步驟簡(jiǎn)化，結(jié)果理想。 本發(fā)明的技術(shù)方案-采用的關(guān)鍵技術(shù)為U)人巨細(xì)胞病毒1A6與4A8單克隆抗體制備與鑒定。(2) 直接裂解紅細(xì)胞技術(shù)。(1)巨細(xì)胞病毒(CMV) pp65蛋白的單克隆抗體制備基本過(guò)程與鑒定pp65蛋白的單克隆抗體其制作方法為以巨細(xì)胞病毒-AD169病毒株pp65蛋白為免疫原， 免疫Balb / c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞和同系小鼠的骨髄瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)融合，通過(guò)間接 ELISA的篩選和有限稀釋克隆化,獲得鼠抗巨細(xì)胞病毒卯65蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株， 通過(guò)ELISA和免疫熒光實(shí)驗(yàn)等方法鑒定其特性；成功地建立了2株穩(wěn)定分泌pp65蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1A6，和 4A8;通過(guò)ELISA,免疫熒光實(shí)驗(yàn)等方法的鑒定,抗卯65蛋白的單克隆抗體性能與卯65蛋白發(fā) 生特異性反應(yīng)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，pp65蛋白的單克隆抗體性能與以巨細(xì)胞病毒 -AD169病毒株pp65蛋白發(fā)生特異性結(jié)合；結(jié)果顯示，C10/C11單克隆抗體一陽(yáng)性對(duì)照抗體，與待篩選單克隆抗體作用的巨細(xì)胞病毒感染的人胚成纖維細(xì)胞株細(xì)胞的胞核均出現(xiàn)明顯的 pp65蛋白熒光反應(yīng)，與小鼠IgG作用不發(fā)生反應(yīng)；由此獲得了特異性識(shí)別抗巨細(xì)胞病毒pp65 蛋白單克隆抗體,為人巨細(xì)胞病毒病毒pp65蛋白抗原血癥檢測(cè)試劑的研制奠定了基礎(chǔ)；所需材料與方法A動(dòng)物6 8周的Balb /C小鼠,雌性,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供[SCXK(京)2004 - 002 ]。 1. 2試劑100 XHAT及IOO XHT添加劑、82氮雜鳥(niǎo)嘌呤、福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑、RPM 1640 培養(yǎng)基均為6ibco腿L產(chǎn)品。相對(duì)分子質(zhì)量為l 50Q的聚乙二醇為Sig腿產(chǎn)品。胎牛扭清為 Hycione產(chǎn)品。FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為Sigma產(chǎn)品。巨細(xì)胞病毒-AD169病毒株與人胚成纖維 細(xì)胞株(HELF)購(gòu)于美國(guó)autogen公司。pp65蛋白C10/Cll單克隆抗體(購(gòu)于荷蘭DAKO公司)，IgG亞類(lèi)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自SIGMA公司。B小鼠骨髓癯細(xì)胞的培養(yǎng) 小鼠骨髓瘤細(xì)胞s12為本室常規(guī)傳代細(xì)胞株,融合前經(jīng)82Azaguanine篩選2周。 動(dòng)物免疫將純化的pp65蛋白與等體積的福氏佐劑混合制成油包水乳劑，每只小鼠腹腔注射O. 5 mL上 述混合液(含pp65蛋白180yg),共注射10只小鼠。兩周后同劑量抗原加福氏不完全佐劑加 強(qiáng)免疫，7 d后以間接ELISA (波長(zhǎng)為490 nm)檢測(cè)小鼠血清pp65蛋白多抗的效價(jià),效價(jià)高者尾 靜脈再?zèng)_擊免疫l次，每只500ixg, 3 d后進(jìn)行細(xì)胞融合。C雜交瘤細(xì)胞株的建立 將免疫小鼠的脾細(xì)胞懸液和上述體內(nèi)培養(yǎng)的sl2細(xì)胞以5 : l的比例在聚乙二醇作用下按常規(guī) 法融合'],用HAT完全1640培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)。以重組卯65蛋白(1.5 mg/L)作為抗原包被酶 標(biāo)96孔板，間接ELISA法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清,所測(cè)的貝卯比陰性對(duì)照高10倍的克隆， 進(jìn)行亞克隆化，并進(jìn)行擴(kuò)增凍存。經(jīng)過(guò)3次有限稀釋克隆化,將分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞 系大量擴(kuò)增并凍存，長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)后，以相同的方法再次克隆化鑒定之。D單克隆抗體腹水的制備 Balb/C小鼠腹腔內(nèi)分別注射0. 5mL不完全福氏佐劑，5 7 d后每只小鼠腹腔內(nèi)注射O. 5 mL 含2X106的雜交瘤細(xì)胞，7 10 d后視小鼠腹部膨脹程度收集腹水。E單克隆抗體的純化將pp65蛋白單克隆抗體腹水先后用5俏(質(zhì)量分?jǐn)?shù))飽和硫酸銨鹽析和Proteiri G親和層析的 方法進(jìn)行純化，得到的純化單克隆抗體用SDS2PAGE電泳法鑒定純度。 F單克隆抗體的特性分析滴度測(cè)定間接ELISA法測(cè)定抗體滴度。以pp65蛋白為包被抗原(2.5lig/ral)，取小鼠腹 水做倍比稀釋?zhuān)O(shè)陽(yáng)性(clO/cl1)和陰性(無(wú)抗體腹水)對(duì)照，分別加入不同孔中，37 'C與包被抗原反應(yīng)2 h充分結(jié)合，洗去未結(jié)合抗原，加HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體l h后顯色測(cè) OD值。間接免疫熒光技術(shù)巨細(xì)胞痛毒-AW69病毒株感染的人胚成纖維細(xì)胞株(HELF)陽(yáng)性細(xì)胞收集，洗絲，記數(shù) (2X106)，可進(jìn)一步純化，貼片25iiL/孔。以未感染巨細(xì)胞病毒-AD169病毒株人胚成纖維細(xì)胞株(HELF)為陰性對(duì)照；(2)將25uL的C10/Cll單克隆抗體(陽(yáng)性對(duì)照)與待篩選單克 隆抗體小心加到不同的玻片上,小鼠IgG為陰性對(duì)照，室溫孵育30 rnin,反應(yīng)完畢后用含O. 2% (體積分?jǐn)?shù))Tween 20的PBS洗滌5 min。 (3)加20lxL F ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG( SIGMA公司產(chǎn) 品)于玻片上,室溫反應(yīng)30 min,反應(yīng)完畢后用PBS洗滌5 min。 (3)最后加甘油IO w L,封片，熒 光，顯微鏡(OLYMPUS， IX71)下觀察結(jié)果。IgG亞類(lèi)鑒定取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液,用SIGMA公司提供的Mouse Monoclonal Antihodylsotyp ing Reagents進(jìn)行IgG亞類(lèi)鑒定。具體操作過(guò)程按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行G結(jié)果分泌抗pp65蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立經(jīng)2次細(xì)胞融合、間接ELISA克隆篩選和3 次亞克隆化,獲得了2株穩(wěn)定分泌抗pp65蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1A6， 4A8。這些雜交瘤細(xì)胞系具有雙親代的生物學(xué)性質(zhì),腹腔接種到Balb /C小鼠后可以形成腫瘤， 并穩(wěn)定地產(chǎn)生特異性抗體。穩(wěn)定傳代后凍存于液氮罐中，6個(gè)月后復(fù)蘇,細(xì)胞生長(zhǎng)良好,抗體 分泌水平未見(jiàn)改變。1A6， 4A8抗PP65蛋白單克隆抗體的基本特性以PP65蛋白為抗原，間接ELISA檢測(cè)腹水的抗 體滴度分別為l : 104與1 : 105。這些單克隆抗體均為IgG2a亞類(lèi)免疫球蛋白。1A6， 4A8間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)巨細(xì)胞病毒感染人胚成纖維細(xì)胞株(HELF)細(xì)胞中pp65 蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，C10/C11單克隆抗體(陽(yáng)性對(duì)照)與待篩選單克隆抗體作用的巨細(xì) 胞病毒感染的人胚成纖維細(xì)胞株(HELF)細(xì)胞的胞核均出現(xiàn)明顯的卯65蛋白熒光反應(yīng)，小鼠 IgG作用不與病毒感染細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。(2)直接裂解紅細(xì)胞技術(shù)采用的快速抗原血癥檢溯采用直接在2ml全血中裂解紅細(xì)胞的程序，然后是對(duì)細(xì)胞密度 進(jìn)行調(diào)整/離心分離，大大縮短了處理時(shí)間； 操作程序-使用前完全混合均勻，按l: 19 (20倍)的比例加入到去離子水中； 輕輕地倒置容器混合樣本；不要使用混勻器；將2ml全血+ 6ml配制后的紅細(xì)胞裂解液加入一個(gè)15ml錐形離心管中；用移液器輕輕混合均勻；在室溫放置5分鐘；在+2 +8°C、 160g下離心10分鐘;輕輕翻轉(zhuǎn)試管，將上清液倒入消毒液中(例如0.5%或1%的次氯酸鈉)；保留沉淀物，小心操作，不要將細(xì)胞沉淀去除；加入3ral配制后的紅細(xì)胞裂解液使血細(xì)胞重新懸浮；不要在室溫放置，立即執(zhí)行下一步 操作；在+2 +8°C、 160g下離心10分鐘;按照前面的方法再一次將試管翻轉(zhuǎn)去除上清液，注意不要將細(xì)胞沉淀去除； 加入lml配制后的試劑A (PBS)使血細(xì)胞重新懸浮，用移液器將其輕輕混合均勻； 調(diào)整細(xì)胞密度技術(shù)指標(biāo)鏡下檢測(cè)熒光場(chǎng)景易于辨別，細(xì)胞形態(tài)好，紅細(xì)胞碎片少. 試劑盒中試劑組份SUPE隨-APBS5瓶干粉稀釋至5 LSUPE鵬2-B紅細(xì)胞裂解液l瓶45 ml(20x濃縮)稀釋至900 mlSUPER002-C固定液l瓶110 ml(5x濃縮)稀釋至550 mlSUPER002-D胎牛血清l瓶30 ml用于洗液SUPER002-E通透液l瓶110ml(5x濃縮)稀釋至550 mlSUPE,2-F抗HOJVpp65單克隆混合抗體l瓶3 ml備用SUPER002-HFITC標(biāo)記的二抗(抗鼠IgG+IgM)l維b)23 ml備用SUPER002-J封片劑l瓶4 ml備用SUPF扁2-K白細(xì)胞分離液(右旋糖苷)l瓶60 ml備用SUPER002-M顯微鏡載玻片100張備用各組份配方A PBS:磷醵鹽緩沖液(PBS,pH 7.3) 0.15mol/L NaCl , 0. Olmol/L NaH2P04, NaOH調(diào)pH至7. 3B紅細(xì)胞裂解液C固定液中性多聚甲醛溶液多聚甲醛(上海試劑一廠)，雙蒸水配成4免溶液,Na(Si調(diào)pH至7. 3D胎牛血清外購(gòu) E通透液外購(gòu)F抗HCMVpp65單克癱混合抗體由本公司開(kāi)發(fā)研制(見(jiàn)人巨細(xì)胞病毒1A6與4A8單克隆p:缽鑭備與鑒定)H FITC標(biāo)il酌二執(zhí)(鷯覼！gCMgM) F(ab)a:購(gòu)自SIGMA公司 J封片劑外購(gòu)K白細(xì)胞分離液(右旃糖苷)稱(chēng)取5g葡聚糖于燒杯中，加入100ml PBS，0.02g疊氮鈉，混勻。M顯微鏡載玻片購(gòu)自天津市天玻玻璃儀器制品有限公司，多具賴(lài)氨酸處理。 本發(fā)明效果是提高了本實(shí)驗(yàn)方法的特異性及敏感度，在臨床評(píng)估試驗(yàn)中，于國(guó)外試劑比較，無(wú)確認(rèn)假 陰性報(bào)告，整體性能高于國(guó)外同類(lèi)試劑。成功開(kāi)發(fā)出以巨細(xì)胞病毒-AD169病毒株pp65蛋白 為免疫原的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，命名為1A6和4A8。此組抗體的獲得是我們攻克的科 技難關(guān)。提高了本實(shí)驗(yàn)方法的特異性及敏感度，在臨床評(píng)估試驗(yàn)中，于國(guó)外試劑比較，無(wú)確 認(rèn)假陰性報(bào)告，整體性能高于國(guó)外同類(lèi)試劑。整個(gè)試劑盒方法先進(jìn)，步驟簡(jiǎn)化，結(jié)果理想。


圖1是雜交癯細(xì)胞原始細(xì)胞庫(kù)生產(chǎn)流程圖 圖2是生產(chǎn)細(xì)胞庫(kù)建立流程圖 圖3是成品試劑生產(chǎn)流程圖具體實(shí)施方式
血液樣本翁收集抽取靜脈血3ml，使用肝素抗凝劑，也可以使用EDTA抗凝劑。輕輕倒置混合樣本。 實(shí)驗(yàn)程序*將2ml全血+6!111配制后的紅細(xì)胞裂解液加入一個(gè)151111錐形離心管中。用移液器輕輕 混合均勻。在室溫放置5分鐘。在+2 ~ +8°C、 160g下離心10分鐘。輕輕翻轉(zhuǎn)試管， 將上清液倒入消毒液中(例如0.5%或1%的次氯酸鈉)。保留沉淀物，小心操作，不要 將細(xì)胞沉淀去除。加入3ml配制后的紅細(xì)胞裂解液使血細(xì)胞重新懸浮。不要在室溫放 置，立即執(zhí)行下一步操作。在+2 +8°C、 160g下離心10分鐘。按照前面的方法再一 次將試管翻轉(zhuǎn)去除上清液，注意不要將細(xì)胞沉淀去除。加入lml配制后的試劑A (PBS) 使血細(xì)胞重新懸浮，用移液器將其輕輕混合均勻。*制備樣本玻片以900rpm低速率離心100ul濃度為2xl()5的細(xì)胞懸液載玻片3分鐘。 載玻片離心時(shí)，制備用于固定和通透步驟的洗液(見(jiàn)"試劑的配制"章節(jié))。稍待玻片干 燥，不要等待時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。*固定和通透僅使用試劑盒內(nèi)提供的固定液，不要使用丙酮，許多專(zhuān)家認(rèn)為使用甲醛作為固定劑的效果優(yōu)于丙翻。在室溫，將玻片浸入配制后的固定液(試劑C) 10分鐘 后取出。不要等玻片干燥，在室溫立即浸入制備好的洗液中，5分鐘后取出，不要等玻 片干燥，在室溫立即將其浸入配制后的通透液(試劑E)中，5分鐘后取出。不要等玻 片干燥，在室溫立即將其浸入制備好的洗液中，5分鐘-l小時(shí)。染色滴入一滴抗HCMVpp65 (IA6+4A8)混合單克隆抗體，在37°C的濕盒內(nèi)溫育30 分鐘。用PBS (試劑A)清洗3次，每次清洗1分鐘，每次清洗使用新鮮的洗液。小心的 擦去樣本區(qū)周?chē)亩嘤嘁后w，小心不要污染到樣本，也不要讓玻片干燥。滴入一滴FITC 標(biāo)記的二抗(試劑H)。注意抗體必須一直保存在2-8"C直到使用。在37"C的濕盒內(nèi)溫育 30分鐘。溫育結(jié)束后觀察玻片樣本區(qū)不能干燥。如果出現(xiàn)干燥的樣本區(qū)，則在相應(yīng)的樣 本玻片上作標(biāo)記并記住此玻片，在讀取結(jié)果時(shí)如果出現(xiàn)問(wèn)題，則可能是由此導(dǎo)致的。用PBS (試劑A)淸洗3次，每次清洗l分鐘，每次清洗使用新鮮的溶液?？焖俳胱詠?lái)水中去除結(jié)晶。使玻片完全干燥。使用試劑J (封 片劑)封片。結(jié)果解釋當(dāng)白細(xì)胞的分頁(yè)核細(xì)胞或單核細(xì)胞的核周或核被染色，表現(xiàn)為帶熒光的蘋(píng)果綠 色，則可判定為陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)樣本玻片中的白細(xì)胞未表現(xiàn)出著色時(shí)，則可判定為陰性結(jié)果。如果沒(méi)有核著色或核 周著色，任何的細(xì)胞質(zhì)著色均可被認(rèn)為是陰性結(jié)果。
權(quán)利要求
1. 一種名稱(chēng)為HCMVPP65抗原血癥間接免疫熒光法檢測(cè)試劑盒其特征在于制備了與以往報(bào)道不同的針對(duì)巨細(xì)胞病毒CMV pp65蛋白的單克隆抗體，同時(shí)建立制備紅細(xì)胞快速裂解的方法，其試劑盒與其它同類(lèi)試劑盒相比，更為快速，簡(jiǎn)單，方便，特異性與敏感性更高。具體制作方法為采用的關(guān)鍵技術(shù)為(1)人巨細(xì)胞病毒1A6與4A8單克隆抗體制備與鑒定。(2)直接裂解紅細(xì)胞技術(shù)。(1)巨細(xì)胞病毒CMV pp65蛋白的單克隆抗體制備基本過(guò)程基本過(guò)程以巨細(xì)胞病毒-AD169病毒株pp65蛋白為免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞和同系小鼠的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)融合，通過(guò)間接ELISA的篩選和有限稀釋克隆化，獲得鼠抗巨細(xì)胞病毒pp65蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，通過(guò)ELISA和免疫熒光實(shí)驗(yàn)等方法鑒定其特性；成功地建立了2株穩(wěn)定分泌pp65蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1A6，和4A8；通過(guò)ELISA，免疫熒光實(shí)驗(yàn)等方法的鑒定，抗pp65蛋白的單克隆抗體性能與pp65蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，pp65蛋白的單克隆抗體性能與以巨細(xì)胞病毒-AD169病毒株pp65蛋白發(fā)生特異性結(jié)合；結(jié)果顯示，以C10/C11單克隆抗體--陽(yáng)性對(duì)照抗體，與待篩選單克隆抗體作用的巨細(xì)胞病毒感染的人胚成纖維細(xì)胞株細(xì)胞的胞核均出現(xiàn)明顯的pp65蛋白熒光反應(yīng)，與小鼠IgG作用不發(fā)生反應(yīng)；由此獲得了特異性識(shí)別抗巨細(xì)胞病毒pp65蛋白單克隆抗體，為人巨細(xì)胞病毒病毒pp65蛋白抗原血癥檢測(cè)試劑的研制奠定了基礎(chǔ)；所需材料動(dòng)物6～8周的Balb/C小鼠，雌性，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供--SCXK(京)2004-002；試劑100×HAT及100×HT添加劑、82氮雜鳥(niǎo)嘌呤、福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑、RPM 1640培養(yǎng)基均為Gibco BRL產(chǎn)品；相對(duì)分子質(zhì)量為1500的聚乙二醇為Sigma產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為Sigma產(chǎn)品；巨細(xì)胞病毒-AD169病毒株與人胚成纖維細(xì)胞株HELF；pp65蛋白C10/C11單克隆抗體，IgG亞類(lèi)檢測(cè)試劑盒1A6，4A8抗PP65蛋白單克隆抗體的基本特性以PP65蛋白為抗原，間接ELISA檢測(cè)腹水的抗體滴度分別為1∶104與1∶105；這些單克隆抗體均為IgG2a亞類(lèi)免疫球蛋白；1A6，4A8間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)巨細(xì)胞病毒感染人胚成纖維細(xì)胞株HELF細(xì)胞中pp65蛋白的表達(dá)；結(jié)果顯示，C10/C11單克隆抗體--陽(yáng)性對(duì)照與待篩選單克隆抗體作用的巨細(xì)胞病毒感染的人胚成纖維細(xì)胞株HELF細(xì)胞的胞核均出現(xiàn)明顯的pp65蛋白熒光反應(yīng)，小鼠IgG作用不與病毒感染細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)；(2)直接裂解紅細(xì)胞技術(shù)基本過(guò)程采用的快速抗原血癥檢測(cè)采用直接在2ml全血中裂解紅細(xì)胞的程序，然后是對(duì)細(xì)胞密度進(jìn)行調(diào)整/離心分離，大大縮短了處理時(shí)間；操作程序使用前完全混合均勻，按1∶19-20倍的比例加入到去離子水中；輕輕地倒置容器混合樣本；不要使用混勻器；將2ml全血+6ml配制后的紅細(xì)胞裂解液加入一個(gè)15ml錐形離心管中用移液器輕輕混合均勻在室溫放置5分鐘；在+2~+8℃、160g下離心10分鐘；輕輕翻轉(zhuǎn)試管，將上清液倒入消毒液中--0.5％或1％的次氯酸鈉；保留沉淀物，小心操作，不要將細(xì)胞沉淀去除；加入3ml配制后的紅細(xì)胞裂解液使血細(xì)胞重新懸??；不要在室溫放置，立即執(zhí)行下一步操作；在+2~+8℃、160g下離心10分鐘；按照前面的方法再一次將試管翻轉(zhuǎn)去除上清液，注意不要將細(xì)胞沉淀去除；加入1ml配制后的試劑A--PBS使血細(xì)胞重新懸浮，用移液器將其輕輕混合均勻；調(diào)整細(xì)胞密度技術(shù)指標(biāo)鏡下檢測(cè)顯微鏡下細(xì)胞易于辨別，細(xì)胞形態(tài)好，紅細(xì)胞碎片少；試劑盒中試劑組份SUPER002-A PBS 5瓶干粉稀釋至5LSUPER002-B 紅細(xì)胞裂解液 1瓶45ml(20x濃縮) 稀釋至900mlSUPER002-C 固定液1瓶110ml(5x濃縮) 稀釋至550mlSUPER002-D 胎牛血清 1瓶30ml用于洗液SUPER002-E 通透液1瓶110ml(5x濃縮) 稀釋至550mlSUPER002-F 抗HCMVpp65單克隆混合抗體 1瓶3ml 備用SUPER002-H FITC標(biāo)記的二抗(抗鼠IgG+IgM)F(ab)2 1瓶3ml 備用SUPER002-J 封片劑1瓶4ml 備用SUPER002-K 白細(xì)胞分離液(右旋糖苷)1瓶60ml備用SUPER002-M 顯微鏡載玻片 100張 備用各組份配方A PBS磷酸鹽緩沖液-PBS，pH 7.3 0.15mol/L NaCl，0.01mol/L NaH2PO4，NaOH調(diào)pH至7.3B 紅細(xì)胞裂解液C 固定液中性多聚甲醛溶液多聚甲醛，雙蒸水配成4％溶液，NaOH調(diào)pH至7.3D 胎牛血清外購(gòu)E 通透液F 抗HCMVpp65單克隆混合抗體H FITC標(biāo)記的二抗--抗鼠IgG+IgM-F(ab)2購(gòu)自SIGMA公司J 封片劑K 白細(xì)胞分離液--右旋糖苷稱(chēng)取5g葡聚糖于燒杯中，加入100ml PBS，0.02g疊氮鈉，混勻。M 顯微鏡載玻片多具賴(lài)氨酸處理。
全文摘要
一種名稱(chēng)為HCMVPP65抗原血癥間接免疫熒光法檢測(cè)試劑盒，以巨細(xì)胞病毒-AD169病毒株pp65蛋白為免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞和同系小鼠的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)融合，通過(guò)間接ELISA的篩選和有限稀釋克隆化，獲得鼠抗巨細(xì)胞病毒pp65蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，通過(guò)ELISA和免疫熒光實(shí)驗(yàn)等方法鑒定其特性；成功地建立了2株穩(wěn)定分泌pp65蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1A6，和4A8。制備了與以往報(bào)道不同的針對(duì)巨細(xì)胞病毒(CMV)pp65蛋白的單克隆抗體，同時(shí)建立制備紅細(xì)胞快速裂解的方法，其試劑盒與其它同類(lèi)試劑盒相比，更為快速，簡(jiǎn)單，方便，特異性與敏感性更高。
文檔編號(hào)G01N33/531GK101261272SQ20071005689
公開(kāi)日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2007年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日
發(fā)明者趙衛(wèi)軍 申請(qǐng)人:天津市秀鵬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司