專利名稱：A型肉毒毒素b細(xì)胞抗原表位肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物毒素B細(xì)胞抗原表位肽，具體地說涉及肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽，還涉及上述抗原表位肽的用途。
背景技術(shù)：
肉毒神經(jīng)毒素(Clostridium Botulinum Neurotoxins，BoNT，簡稱肉毒毒素)是由肉毒梭狀芽孢桿菌在厭氧條件下產(chǎn)生的外毒素，有7個(gè)血清型(A-G)，是目前已知毒力最強(qiáng)的蛋白質(zhì)，其中A，B，E型肉毒毒素是引起人類中毒的常見型別，臨床觀察表明A型肉毒毒素比其它血清型可引起更嚴(yán)重的病癥和導(dǎo)致更高的死亡率。
A型肉毒毒素的前體是分子量為150kD的無毒單鏈蛋白，經(jīng)菌體蛋白酶或體外蛋白酶切割成為具有雙鏈形式才具有毒性，即輕鏈(L)與重鏈(H)通過一個(gè)二硫鍵連接，H鏈?zhǔn)侨舛径舅氐慕Y(jié)合區(qū)，是進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞所必需的，其與神經(jīng)細(xì)胞毒素受體結(jié)合的部位是C端分子量約50kD的片段(Hc抗原)，研究表明Hc抗原是肉毒毒素的主要保護(hù)性抗原，含有中和性B細(xì)胞表位，其在一定程度上可以替代肉毒毒素標(biāo)準(zhǔn)類毒素，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對天然活毒素的保護(hù)性抗體，產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)性作用。同時(shí)，作為主要的毒素抗原結(jié)構(gòu)，Hc抗原在肉毒毒素的感染診斷和治療性抗體等制劑的研制中，也發(fā)揮著重要作用。
目前，在疫苗研制方面，肉毒毒素重要保護(hù)性抗原的獲得，方法一是Siegel等1988年報(bào)道的通過肉毒梭菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中提取肉毒毒素，滅活制備類毒素抗原。這樣不但需要帶毒操作，而且無法完全去除甲醛和菌體蛋白等成分，存在安全性隱患(Siegel，LS.J Clin Microbiol.1988 November；26(11)2351-2356)；方法二，Michael A等1995年報(bào)道的主要針對Hc抗原及其片段，應(yīng)用基因工程技術(shù)方法，通過原核和酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、重組表達(dá)與純化，制備重組毒素抗原。因?yàn)镠c抗原是一個(gè)大蛋白，其基因結(jié)構(gòu)A+T％含量高達(dá)76％，密碼子偏性很高，重組表達(dá)水平較低，需要通過基因修飾方法提高表達(dá)量，重組表達(dá)與純化的成本較高(Michael A，Clayton J，M.Clayton，et al.J.Infection andImmunity，1995，63(7)2738-2742)?？紤]到抗原在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)中起決定作用的核心結(jié)構(gòu)是抗原表位，因此優(yōu)勢抗原表位或是包含抗原表位的短肽以及它們的組合，可以具有與完整抗原蛋白相似或相同的功能。在通常情況下，表位長度從幾個(gè)到幾十個(gè)氨基酸，可以應(yīng)用實(shí)驗(yàn)方法，避開肉毒毒素復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，直接獲得抗原表位，表位肽是含有一個(gè)或幾個(gè)抗原表位序列的短肽，有其獨(dú)特的特點(diǎn)分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，易于合成制備；重要的是作為抗原核心結(jié)構(gòu)的功能明確，具有抗原性和免疫原性，可以刺激B細(xì)胞產(chǎn)生特異抗體；相比較全毒素抗原，表位肽幾乎沒有任何毒性，使用更為安全。含有表位的短肽的應(yīng)用價(jià)值還體現(xiàn)在針對A型肉毒毒素的表位短肽可以和針對其它血清型肉毒毒素的表位短肽進(jìn)行隨意的組合或串聯(lián)設(shè)計(jì)，能夠很容易地應(yīng)用于不同保護(hù)范圍的肉毒毒素疫苗的制備；同樣的，如果與針對其它病原體的抗原或表位短肽組合，能夠進(jìn)一步拓寬其疫苗用途。
在肉毒毒素感染診斷方面，主要采用雙抗體夾心法檢測肉毒毒素抗原的方法，由于檢測靈敏度要求，主要適用于嚴(yán)重中毒者，而對既往感染和低劑量感染者不適用。而針對其它大多數(shù)病原抗原感染論斷非常實(shí)用的雙抗原夾心抗體檢測法，在肉毒毒素特異抗體檢測中存在一定的問題。主要是因?yàn)槿舛径舅氐难逍蛷?fù)雜，毒素抗原的氨基酸同源性較高，彼此存在明顯的抗原抗體交叉反應(yīng)(Ferreira J，Maslanka S，Johnson E，et al，J AOAC Int.200386314-31.)。
目前采用的抗原表位或表位短肽鑒定方法主要有以下幾種一、采用肽段掃描(peptide scan)或基因分段表達(dá)的方法1996年Markt.T和Dertzbaugh等通過基因重組方法分段表達(dá)A型肉毒毒素Hc的一系列重疊的蛋白片段，研究確定了BoNT/A產(chǎn)生保護(hù)性免疫的序列片段H455-661和H1150-1289(Mark T，Dertzbaugh，and Michael WW.J.Vaccine，1996，14(16)1538-1544.)，對其在肉毒毒素疫苗構(gòu)建中的應(yīng)用進(jìn)行探索研究，并且申請了美國專利20030185850；1996年Atassi通過體外化學(xué)合成一系列相互重疊5個(gè)氨基酸的十九肽，采用抗毒素血清篩選了BoNT/A-Hc可能的表位，結(jié)果顯示不同免疫來源的抗毒素血清識別的肽序列有一定的差別(Atassi MZ，Dolimbek BZ，Hayakari M，et al.J Protein Chem 1996 Oct；15(7)691-700)。二、利用噬菌體展示技術(shù)或蛋白芯片技術(shù)，通過多輪淘篩，最終分離鑒定獲得模擬表位2001年Wu HC應(yīng)用毒素中和單抗從噬菌體隨機(jī)肽庫中篩選到A型肉毒毒素的模擬中和表位CXDC(Wu HC，Yeh CT，Tarn LJ，et al.Appl Environ Microbiol 2001 Jul；67(7)3201-7)，2001年Mullaney BP等運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)對BoNT/A進(jìn)行了中和表位繪圖，推測毒素存在多個(gè)優(yōu)勢抗原表位，其中神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合位點(diǎn)在Glu1202，His1252，Trp1265，受體蛋白結(jié)合區(qū)位于1115-1223序列(Mullaney BP，PallaviciniMG，Marks JD.Infect Immun.2001 Oct；69(10)6511-4)，為毒素治療藥物設(shè)計(jì)提供可能的靶點(diǎn)。三、制備一系列針對抗原分子的單克隆抗體，通過競爭分析確定表位存在的范圍1997年Toru等采用單抗進(jìn)行表位繪圖，確定了BoNT/E的中和表位序列(Toru Kubota，Toshihiro Watanabe，Noriko Yokosawa，et al.Applied andEnvironmental，Microbiology，1997，63(4)1214-1218)。但這些方法費(fèi)事，費(fèi)力且所需周期較長，而且不適于復(fù)雜表位的研究，因而制約了肉毒毒素防治研究的發(fā)展。生物信息學(xué)的發(fā)展，以及包括A型肉毒毒素在內(nèi)的許多蛋白質(zhì)三維晶體結(jié)構(gòu)的確定，為抗原表位的分析提供了新的線索，也為新型的肽疫苗研究等提供了思路和途徑。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有A型肉毒毒素抗原表位的不確定，以及肉毒毒素疫苗研究和檢測診斷技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一組含有A型肉毒毒素保護(hù)性抗原表位的短肽，這些短肽的氨基酸序列如序列表中序列1、2和3所示。
這些短肽與全毒素抗原、重組毒素抗原具有相同或相似的功能，可以有效激發(fā)機(jī)體的免疫保護(hù)效應(yīng)，可以有效識別A型肉毒毒素感染后特異抗體的存在，具有制備簡單、成本低、無毒副作用、與其它血清型肉毒毒素抗原無交叉的特點(diǎn)。
本發(fā)明還提供了包含上述三種A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽中至少兩種的多組分抗原表位肽，還公開了包含上述三種A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽的多組分抗原表位肽，還公開了包含以等比例混合的上述三種A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽的多組分抗原表位肽。
本發(fā)明同時(shí)提供了上述短肽以及具有相同序列和結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)、多肽及其組合物在肉毒毒素新型疫苗研制中的應(yīng)用。通過鑒定獲得有效的A型肉毒毒素保護(hù)性表位或表位肽，提供新的更為精確、有效的核心抗原基序或短肽，將其作為重要抗原組分應(yīng)用于肉毒毒素新型肽疫苗的制備。
本發(fā)明同時(shí)提供了這些短肽以及具有相同特征的蛋白質(zhì)、多肽及其組合物在肉毒毒素感染診斷中的應(yīng)用。通過鑒定獲得有效的A型肉毒毒素抗原表位或表位短肽，提供新的型特異的核心抗原基序或短肽，同時(shí)利用其與型特異抗體捕獲結(jié)合的功能，將其作為重要抗原組分應(yīng)用于A型肉毒毒素感染的特異抗體的檢測，將肉毒毒素感染診斷確定到血清型的標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明通過ELISA實(shí)驗(yàn)對表位短肽與A型肉毒抗毒素馬血清特異結(jié)合進(jìn)行分析。用表位肽包被酶聯(lián)板，BSA作為陰性對照，BSA封閉后，加入抗A型肉毒毒素的馬血清進(jìn)行結(jié)合；洗滌后加入酶標(biāo)兔抗馬IgG，孵育后洗滌，然后進(jìn)行底物顯色，檢測OD450。結(jié)果顯示本發(fā)明的表位肽均能與A型肉毒毒素抗毒素馬血清特異地結(jié)合。
本發(fā)明同時(shí)提供了這些短肽以及具有相同特征的多肽及其組合物在肉毒毒素作為抗肉毒毒素藥物篩選靶標(biāo)的用途。因?yàn)楸景l(fā)明的短肽是肉毒毒素的核心的免疫抗原，也是肉毒毒素的特征性抗原標(biāo)識，因此可以將這些短肽作為靶標(biāo)進(jìn)行抗肉毒毒素藥物的篩選。
本發(fā)明同時(shí)提供了以A型肉毒毒素的晶體結(jié)構(gòu)為模板，應(yīng)用生物信息學(xué)和蛋白結(jié)構(gòu)解析計(jì)算等的綜合分析方法，篩選獲得B細(xì)胞抗原表位或表位短肽的方法。
因此本發(fā)明通過鑒定獲得有效的A型肉毒毒素保護(hù)性表位或表位肽，提供新的更為精確、有效的核心抗原基序或短肽，同時(shí)將其作為重要抗原組分應(yīng)用于肉毒毒素新型肽疫苗的制備，是本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)之一。本發(fā)明通過鑒定獲得有效的A型肉毒毒素抗原表位或表位短肽，提供新的型特異的核心抗原基序或短肽，同時(shí)利用其與型特異抗體捕獲結(jié)合的功能，將其作為重要抗原組分應(yīng)用于A型肉毒毒素感染的特異抗體的檢測，將肉毒毒素感染診斷確定到血清型的標(biāo)準(zhǔn)，是本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)之二。本發(fā)明以A型肉毒毒素的晶體結(jié)構(gòu)為模板，應(yīng)用生物信息學(xué)和蛋白結(jié)構(gòu)解析計(jì)算等的綜合分析方法，篩選獲得B細(xì)胞抗原表位或表位短肽，也是本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)。


圖1為表位短肽與A型肉毒毒素抗毒素馬血清的特異結(jié)合圖2為表位短肽與不同血清型抗毒素馬血清的交叉結(jié)合實(shí)驗(yàn)圖3為單一表位肽疫苗的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)圖4為組合表位肽疫苗的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 A型肉毒毒素表位肽的確定一、材料SEPHADEX G-15；SEPHAROSE親合柱；HPLC購自Pharmacia公司；Insight II軟件，SGI圖形工作站是Neotrident公司產(chǎn)品。
二、方法與結(jié)果1.A型肉毒毒素Hc片段B細(xì)胞抗原表位的篩選1998年RC Stevens&DB Lacy通過高分辨率多維晶體X衍射光譜分析獲得了由1285氨基酸殘基組成的雙鏈A型肉毒毒素的晶體結(jié)構(gòu)(PDBstucture3BTA，2.3)；本發(fā)明利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中A型肉毒毒素的三維晶體結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Insight II軟件及SGI圖形工作站，進(jìn)行A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位的分析，選擇至少連續(xù)三個(gè)氨基酸殘基暴露面積大于30％，而且其所對應(yīng)的空間結(jié)構(gòu)為轉(zhuǎn)角或者無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的序列為可能的B細(xì)胞抗原表位，單個(gè)氨基酸的表位特征分析的部分結(jié)果見表1。
表1 A型肉毒毒素抗原表位分析結(jié)果

2.含有保護(hù)性抗原表位的短肽的設(shè)計(jì)與制備根據(jù)上述表位篩選結(jié)果，進(jìn)行含有保護(hù)性抗原表位的短肽的設(shè)計(jì)，不同表位進(jìn)行有效的串聯(lián)，并且在表位之間引入適當(dāng)?shù)陌被衢g隔序列，延長表位區(qū)域，結(jié)果設(shè)計(jì)了3條表位肽，長度為20個(gè)氨基酸左右，表位肽1#、2#和3#的氨基酸序列分別如序列表中序列1、2和3所示。
表位肽的合成采用固相合成法，為了增加表位肽的生物學(xué)活性，在合成過程中肽序列N端采用乙酰化封閉，可以增強(qiáng)多肽的穩(wěn)定性，防止體內(nèi)蛋白酶解，延長體內(nèi)的半衰期。C端引入了D型氨基酸，其不會影響多肽的空間結(jié)構(gòu)，同樣能提高體內(nèi)的穩(wěn)定性和活性。初步合成的產(chǎn)物經(jīng)過SEPHADEXG-15或SEPHAROSE親合柱純化。純化產(chǎn)物應(yīng)用HPLC(high performanceliquid chromatography)做氨基酸分析。
實(shí)施例2表位肽免疫學(xué)分析及其在肉毒毒素血清型鑒定中的應(yīng)用一、材料抗A、B、E型肉毒毒素馬血清，酶標(biāo)兔抗馬IgG(中國生物制品檢定所)
二、方法與結(jié)果1.表位短肽與A型肉毒抗毒素馬血清特異結(jié)合的ELISA分析表位肽1#、2#和3#(10μg/孔)包被酶聯(lián)板，包被液為NaHCO3 pH8.6，包被BSA作為陰性對照，4℃過夜包被。去除包被液，加入100μl 3％BSA(0.02mol/L PBS，pH7.2配制)37℃封閉1h，加入抗A型肉毒毒素的馬血清(1∶3000稀釋)，100μl/孔，37℃結(jié)合1h；用PBST(0.05％Tween 20)洗滌；加入酶標(biāo)兔抗馬IgG(1∶1000稀釋)100μl/孔，室溫孵育30分鐘；用PBST(0.05％Tween 20)洗滌，排盡殘液，加入A、B液底物顯色，室溫反應(yīng)3-5分鐘，加入2N H2SO4終止反應(yīng)，檢測OD450。
結(jié)果如附圖1顯示，設(shè)計(jì)合成的3條表位肽均能與A型肉毒毒素抗毒素馬血清特異地結(jié)合。
2.表位肽與不同血清型肉毒抗毒素馬血清的交叉結(jié)合實(shí)驗(yàn)選擇與A型肉毒毒素抗毒素馬血清特異結(jié)合的1#表位肽進(jìn)行不同血清型之間的交叉結(jié)合實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證在人感染主要血清型抗體檢測中有無交叉反應(yīng)。表位肽1#(10μg/孔)包被酶聯(lián)板，包被液為NaHCO3 pH8.6，包被BSA作為陰性對照，4℃過夜包被。去除包被液，加入100μl 3％BSA(0.02mol/L PBS，pH7.2配制)37℃封閉1h，分別加入抗A、B、E型肉毒毒素的馬血清(1∶3000稀釋)，以無關(guān)抗血清做對照，100μl/孔，37℃結(jié)合1h；用PBST(0.05％Tween 20)洗滌；加入酶標(biāo)兔抗馬IgG(1∶1000稀釋)100μl/孔，室溫孵育30分鐘；用PBST(0.05％Tween 20)洗滌，排盡殘液，加入A、B液底物顯色，室溫反應(yīng)3-5分鐘，加入2N H2SO4終止反應(yīng)，檢測OD450。
結(jié)果如附圖2顯示，1#表位肽可以與A型肉毒毒素抗毒素血清特異結(jié)合，而與其它血清型抗毒素血清沒有交叉，在采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)雙抗原夾心法對臨床肉毒中毒病人血清樣品的抽樣檢測中也發(fā)現(xiàn)，采用表位肽檢測與肉毒毒素標(biāo)準(zhǔn)類毒素檢測判定結(jié)果一致，1#表位肽可以取代肉毒毒素標(biāo)準(zhǔn)類毒素或重組抗原，作為肉毒毒素不同血清型感染鑒別和診斷的特征性抗原。
實(shí)施例3 表位肽疫苗的配制及其免疫保護(hù)效應(yīng)一、材料表位肽，按上述實(shí)施例制備；BALB/C小鼠，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
二、方法與結(jié)果1.單一或多組分表位肽疫苗的配制單一表位肽抗原純度＞85％的表位肽1#、2#和3#，分別用0.02mol/LPBS pH7.2溶解，配制成濃度為0.8mg/ml的表位肽抗原。
多組分表位肽抗原純度＞85％的表位肽1#、2#和3#，以1∶1∶1的比例混合均勻，用0.02mol/L PBS pH7.2溶解，配制成每種表位肽濃度仍為0.8mg/ml的表位肽抗原。
表位肽疫苗單一或多組分表位肽抗原分別與等體積的Al(OH)3佐劑混合，配制成單一表位肽疫苗或多組分表位肽疫苗。
2.表位肽疫苗的免疫及抗體檢測7-8周齡BALB/C小鼠，雌性，隨機(jī)分為A、B、C、D四組，每組8只。
分組結(jié)果如下A正常組未注射抗原(腹腔注射相同劑量的生理鹽水)B陽性對照組A型肉毒毒素標(biāo)準(zhǔn)類毒素免疫C陰性對照組無關(guān)抗原免疫
D實(shí)驗(yàn)組a單一表位肽免疫(1#或2#或3#)b表位肽組合免疫(1#+2#+3#)采取腹腔注射的免疫方式，每只注射200μl(相當(dāng)于抗原80μg/只)。隔周后加強(qiáng)免疫，劑量同首免。分別于第3、4次免疫后的4天采血，ELISA檢測血清中特異抗體的效價(jià)變化。
結(jié)果顯示，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組在免疫3次后的特異抗體陽性率分別為87.5％(7/8)和100％(8/8)，在免疫4次后的特異抗體陽性率均為100％。
3.表位肽疫苗免疫的攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)加強(qiáng)免疫4次后用A型肉毒毒素活毒素對所有實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行攻毒，腹腔注射103LD55/只，分別觀察各組的保護(hù)情況，各實(shí)驗(yàn)組保護(hù)情況如附圖3，附圖3顯示的是表位肽免疫小鼠的攻毒后存活情況，從圖中可以看出陰性對照組小鼠8只在18h內(nèi)全部死亡，標(biāo)準(zhǔn)類毒素免疫組完全保護(hù)，與陰性對照組相比，單一表位肽免疫小鼠均能不同程度地保護(hù)103LD50A型肉毒毒素的攻毒，不同的免疫保護(hù)程度可能與不同表位短肽所包含表位在免疫識別中所起的作用大小有關(guān)，附圖3顯示表位肽免疫小鼠的存活率較未免疫組有明顯的延長作用。附圖4表位肽的組合免疫結(jié)果顯示，表位肽有明顯的疊加免疫保護(hù)作用，與單一表位肽相比較，組合免疫具有更好的免疫保護(hù)效果，證明肉毒毒素存在多個(gè)優(yōu)勢抗原表位。雖然本試驗(yàn)的多組分表位肽僅以表位肽1#、2#、3#，以1∶1∶1的比例混合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但可以通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷表位肽1#、2#、3#以不同的比例混合的多組分表位肽，或表位肽1#、2#、3#中的任意兩個(gè)以不同比例混合的多組分表位肽也能得到類似結(jié)果。僅以本發(fā)明提供的短肽為基礎(chǔ)，通過適當(dāng)添加其它免疫原組分，或是通過重組連接構(gòu)建多表位串聯(lián)疫苗，可以進(jìn)一步提高免疫保護(hù)效果，制備高效的肉毒毒素新型疫苗。
4.表位肽疫苗的安全性實(shí)驗(yàn)7-8周齡BALB/C小鼠，雌性，用上述組分分別腹腔注射各8只，用量是0.4mg/只(免疫劑量的5倍)，三周內(nèi)觀察實(shí)驗(yàn)小鼠有無異常反應(yīng)，安全性檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)期間沒有出現(xiàn)任何異常反應(yīng)，說明本表位肽疫苗不會產(chǎn)生任何不良反應(yīng)。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所<120>A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽及其用途<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>22<212>PRT<213>
<400>1Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly1 5 10 15Ser Val Met Thr Thr Asn20<210>2<211>17<212>PRT<213>
<400>2Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys1 5 10 15Ser<210>3<211>21<212>PRT<213>
<400>3Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp1 5 10 15Gly Glu Arg Pro Leu20
權(quán)利要求
1.A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽，其特征在于具有序列表中序列1、2或3所示的氨基酸序列。
2.多組分A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽，其特征在于包含權(quán)利要求1所述三種A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽中的至少兩種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述多組分抗原表位肽，其特征在于包含權(quán)利要求1所述三種A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述多組分抗原表位肽，其特征在于權(quán)利要求1所述三種A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽以等比例混合。
5.權(quán)利要求1或2所述的A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽或多組分抗原表位肽在制備A型肉毒毒素感染的特異抗體診斷試劑中的用途。
6.權(quán)利要求1或2所述的A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽或多組分抗原表位肽在制備肉毒毒素新型肽疫苗中的用途。
7.權(quán)利要求1或2所述的A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽或多組分抗原表位肽作為抗肉毒毒素藥物篩選靶標(biāo)的用途。
8.含有權(quán)利要求1所述A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽的多肽或蛋白質(zhì)在制備A型肉毒毒素感染的特異抗體診斷試劑中的用途。
9.含有權(quán)利要求1所述A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽的多肽或蛋白質(zhì)在制備肉毒毒素新型肽疫苗中的用途。
10.含有權(quán)利要求1所述A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽的多肽或蛋白質(zhì)作為抗肉毒毒素藥物篩選靶標(biāo)的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了A型肉毒毒素B細(xì)胞抗原表位肽，作為核心的免疫抗原，可有效激發(fā)機(jī)體免疫保護(hù)效應(yīng)，預(yù)防肉毒毒素感染；同時(shí)作為特征性抗原標(biāo)識，可有效識別A型肉毒毒素特異抗體，將人肉毒毒素感染血清型中A型與其它型甄別。這些短肽與全毒素抗原、重組毒素抗原具有相同或相似的功能，更具有制備工藝簡單、成本低、無毒副作用、與其它血清型肉毒毒素抗原無交叉的特點(diǎn)，而且消除了類毒素抗原易引起的過敏反應(yīng)，克服了全毒素抗原或重組抗原血清型間交叉反應(yīng)的問題，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明同時(shí)提供了這些短肽以及具有相同特征的蛋白質(zhì)、多肽及其組合物在肉毒毒素感染診斷、新型肽疫苗制備中以及作為抗肉毒毒素藥物篩選靶標(biāo)的用途。
文檔編號G01N33/53GK101016336SQ20071006422
公開日2007年8月15日 申請日期2007年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月7日
發(fā)明者王慧, 史晶, 蔭俊, 包士中, 侯曉軍, 蔡昆 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所