專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4上膜的探針和方法
用于檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4上膜的探針和方法絲艦本發(fā)明涉及一種融合蛋白探針，更具體地涉及用于檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白4 (Glucose Transporter 4， GLUT4)上膜(即，向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn))的探針， 以及一種檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 (GLUT4)上膜的高通量篩選方法。利用 該探針和方法可以快速、高效地從已有的化學(xué)藥物庫(kù)、中藥庫(kù)等資源庫(kù)中 篩選出具有調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖濃度并治療糖尿病的促GLUT4上膜類(lèi)藥物。
背景技術(shù)：
糖尿病與GLUT4眾所周知，葡萄糖是動(dòng)物體的基本能量來(lái)源，它的代謝、合成以及儲(chǔ) 存都受?chē)?yán)格而又復(fù)雜的調(diào)控。以人類(lèi)而言，血糖濃度被嚴(yán)格的控制在4-7 mM之間。偏離這一區(qū)間都會(huì)導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生，例如低血糖會(huì)導(dǎo)致昏迷、 死亡，高血糖會(huì)導(dǎo)致糖尿病從而引發(fā)腎衰竭、白內(nèi)障、神經(jīng)病及心血管疾 病[l]。在體內(nèi)，葡萄糖主要在肌肉組織和脂肪組織中被吸收利用，在這個(gè) 過(guò)程中，由于極性的碳水化合物分子受到細(xì)胞膜疏水核心的排斥，葡萄糖 及其他的糖類(lèi)分子都需要一系列的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制來(lái)幫助它們通過(guò)脂雙分子層 被細(xì)胞吸收。哺乳動(dòng)物利用Na+ —依賴(lài)的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)和單向轉(zhuǎn)運(yùn)攝取葡萄糖 [l]。在對(duì)葡萄糖的攝取過(guò)程中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族發(fā)揮了重要的作用。胰 島素對(duì)血糖的調(diào)控主要通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 (GLUT4)轉(zhuǎn)運(yùn)上膜， 刺激肌肉組織和脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取以降低血糖濃度。糖尿病治療藥物簡(jiǎn)介糖尿病已成為威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。在糖尿病患者中90% 的都是二型糖尿病，不論在發(fā)展中國(guó)家還是在發(fā)達(dá)國(guó)家病患的人數(shù)都在不 斷增加，預(yù)計(jì)到2025年II型糖尿病患者的人數(shù)將達(dá)到3億[2]。世界衛(wèi)生 組織的資料顯示，糖尿病在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家增加的幅度明顯不同，歐美國(guó)家為45%，而發(fā)展中國(guó)家可達(dá)到200%。這意味著糖尿病將在逐步 走向富裕的屆家肆虐。據(jù)了解，我國(guó)1994年花在糖尿病和心血管病的醫(yī) 療費(fèi)用大約是419億元人民幣，到2000年猛增到1216億元。如何控制糖 尿病的增長(zhǎng)和有效治療糖尿病已屬衛(wèi)生界和醫(yī)藥界的當(dāng)務(wù)之急。(1) 抗胰島素抗性藥物是治療2型糖尿病的主要藥物 糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的一種常見(jiàn)病，臨床以高血糖為主要標(biāo)志，常見(jiàn)癥狀有多飲、多尿、多食以及消瘦等。糖尿病患者 若得不到有效的治療，可引起身體多個(gè)系統(tǒng)的損害。糖尿病分1型糖尿病和2型糖尿病。其中1型糖尿病多發(fā)生于青少年， 其胰島素分泌缺乏，必須依賴(lài)胰島素治療維持生命。2型糖尿病多見(jiàn)于30 歲以后中、老年人，其胰島素的分泌量并不低甚至還偏高，病因主要是機(jī) 體對(duì)胰島素不敏感(即胰島素抗性)。胰島素抗性是指體內(nèi)周?chē)M織對(duì)胰 島素的敏感性降低，組織對(duì)胰島素不敏感，在胰島素的刺激下外周組織如 肌肉、脂肪中的GLUT4的上膜轉(zhuǎn)運(yùn)異常，因而對(duì)葡萄糖的攝取產(chǎn)生了 "抗 性"。胰島素抗性是2型糖尿病的基本發(fā)病機(jī)制，另外，胰島素抗性與心 血管病變的一些傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素如肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化、糖脂代謝異常和高 血壓等有著密切的關(guān)系。目前市售的抗糖尿病藥物主要有磺酰脲類(lèi)藥物、雙胍類(lèi)藥物(如鹽酸 二甲雙胍、鹽酸二甲雙胍緩釋片)、a-葡萄糖苷酶抑制劑等口服抗胰島素 藥物和胰島素制劑。其中抗胰島素抗性藥物成為治療2型糖尿病的主要藥 物，例如，胰島素增敏劑可增加機(jī)體對(duì)自身胰島素的敏感性，使自身的胰 島素得以"復(fù)活"而充分發(fā)揮作用，這樣就可使血糖能夠重新被機(jī)體組織細(xì) 胞所攝取和利用，使血糖下降，達(dá)到長(zhǎng)期穩(wěn)定和全面地控制血糖的目的， 使人體可長(zhǎng)久享用自身分泌的胰島素。90年代以來(lái)，國(guó)際上很重視2型糖 尿病的胰島素抗性及研究胰島素致敏劑。開(kāi)發(fā)新型、高效的抗胰島素抗性 藥物有望成為治愈2型糖尿病治療的最主要途徑。(2) 利用藥物篩選的方法從現(xiàn)有的化學(xué)藥物庫(kù)、植物以及中藥庫(kù)中篩選 出具有抗胰島素抗性的新藥具有良好的開(kāi)發(fā)前景，但是缺乏方便、可靠的高通量檢測(cè)方法。各國(guó)研究人員一直在尋找治療糖尿病的新藥?？茖W(xué)家們?cè)噲D從現(xiàn)有的 合成的化學(xué)藥物庫(kù)中篩選出具有治療糖尿病的新藥，另外，人們也從植物 中篩選能降血糖的藥物。國(guó)家新藥篩選中心胡立宏博士等研究人員一直在 尋找治療糖尿病的新藥。他們從山茱萸這一植物中找到的抑制劑，對(duì)蛋白 酪氨酸磷酸酯酶l B抑制效果十分明顯。實(shí)驗(yàn)證明加入這種抑制劑后， 蛋白酪氨酸磷酸酯酶l B的量可得到明顯控制，或控制在正常的范圍。一 般人們是以糖尿病小鼠等為研究模型，通過(guò)進(jìn)食這些藥物后測(cè)量血糖濃度 以及胰島素的耐受性，來(lái)檢測(cè)這些藥物的降糖活性。糖尿病是一種慢性病，其最大特點(diǎn)是病程長(zhǎng)且復(fù)雜、難根治。從目前 臨床所用或即將應(yīng)用的降糖藥物來(lái)看，各種西藥都有一定的局限性和不良 反應(yīng)，甚至是很?chē)?yán)重的不良反應(yīng)，如導(dǎo)致低血糖、乳酸性酸中毒等。因此， 有專(zhuān)家提出用中藥抗糖尿病治療，并做了相關(guān)的研究。許多單味藥或復(fù)方 制劑都顯示了多種降糖機(jī)制，如同時(shí)具有刺激胰島卩細(xì)胞分泌胰島素、抑 制胰升糖素的分泌、增加胰島素受體的敏感性、抑制葡萄糖的腸吸收、改 善脂肪酸代謝等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)已經(jīng)申報(bào)的抗糖尿病藥物中中藥制劑僅占 了極小的市場(chǎng)份額，隨著世界"回歸天然"熱潮的逐步形成，以及對(duì)糖尿病 藥物需求的不斷增加，從中藥庫(kù)中篩選出具有多種降糖機(jī)制的中藥新藥具 有良好的開(kāi)發(fā)前景。然而目前中藥制劑缺乏療效肯定的、臨床醫(yī)生和患者 都樂(lè)于接受的降糖藥物。除了中藥外，各國(guó)研究人員還試圖從現(xiàn)有的合成的化學(xué)藥物庫(kù)中篩選 出具有治療糖尿病的新藥，另外，人們也從植物中篩選能降血糖的藥物， 例如，國(guó)家新藥篩選中心胡立宏博士等研究人員從山茱萸這一植物中找到 蛋白酪氨酸磷酸酯酶l B的抑制劑，通過(guò)對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酯酶l B的抑 制來(lái)調(diào)控糖尿病病人血糖的濃度。 一般人們是以糖尿病小鼠等為研究模 型，通過(guò)測(cè)量小鼠進(jìn)食這些藥物后血糖濃度以及胰島素的耐受性，來(lái)檢測(cè) 這些藥物的降糖活性。利用這種方法很難實(shí)現(xiàn)高通量，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因 此，雖然有很多資源庫(kù)可供開(kāi)發(fā)具有潛在藥效的糖尿病治療類(lèi)藥物，但是 由于沒(méi)有高效、準(zhǔn)確并可以高通量檢測(cè)的方法，這些潛在藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng) 用受到了極大的限制。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 (GLUT4)由于胰島素對(duì)血糖的調(diào)控主要通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 (GLUT4) 轉(zhuǎn)運(yùn)上膜，刺激肌肉組織和脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取降低血糖濃度。研究 表明，GLUT4蛋白在脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞中大量表達(dá)，用胰島素刺激后 發(fā)現(xiàn)該蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)上膜。最新的研究表明，早期2型糖尿病病人診斷中發(fā)現(xiàn) 胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑正常，但是胰島素刺激GLUT4的上膜轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)異常 [3。因此，發(fā)明一種能檢測(cè)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)上膜的探針對(duì)于2型糖尿病的早 期診斷和治療具有非常重要的意義。目前有關(guān)GLUT4上膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制已經(jīng)成為2型糖尿病研究的熱點(diǎn)， 但是無(wú)論是理論研究還是用于疾病治療的早期診斷，尚沒(méi)有合適的探針用 于檢測(cè)胰島素剌激后GLUT4的上膜轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，也沒(méi)有以GLUT4上膜轉(zhuǎn) 運(yùn)為靶標(biāo)的藥物篩選方法。現(xiàn)有的用于檢測(cè)GLUT4上膜的方法，主要有 兩種， 一種是用生化的方法提取細(xì)胞膜，利用GLUT4的抗體檢測(cè)胰島素 刺激后GLUT4的上膜；另一種方法是用綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記GLUT4 并檢測(cè)其上膜。利用生化抗體檢測(cè)的方法具有很多缺點(diǎn)，例如操作很麻煩； 所需要的樣品量很大，很難得到較純的細(xì)胞膜成分；這些都會(huì)影響測(cè)定的 結(jié)果，而且很難實(shí)現(xiàn)藥物的高通量篩選。用GFP標(biāo)記GLUT4來(lái)檢測(cè) GLUT4的方法也存在一些缺點(diǎn)，GLUT4蛋白是多次跨膜蛋白，氨基端和 羧基端都在胞漿中，因此GFP無(wú)論是標(biāo)記在GLUT4的氨基端還是羧基端， GFP都會(huì)位于GLUT4囊泡的胞漿側(cè)，在488 nm波長(zhǎng)激光激發(fā)下都會(huì)發(fā)光， 因此很難量化胰島素刺激后GLUT4的上膜量。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是要找到一種方法，能夠方便準(zhǔn)確地檢測(cè)哪些化合物 或藥物能刺激脂肪細(xì)胞或者肌肉細(xì)胞中GLUT4的上膜轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而調(diào)控體 內(nèi)的血糖代謝，這些藥物即為具有醫(yī)藥應(yīng)用前景的治療糖尿病的藥物，而 且有可能是那些不依賴(lài)胰島素而使GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)上膜的胰島素抗性藥物。 本發(fā)明的目的之二是設(shè)計(jì)和構(gòu)建一種探針，反映脂肪和肌肉細(xì)胞響應(yīng)胰島 素的刺激后GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)，直接用于檢測(cè)胰島素等藥物的藥效，或藥物對(duì)胰島素抵抗的改善效果。具體而言，本發(fā)明包括以下各個(gè)方面1. 一種用于檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4上膜的探針，該探針是胰島素響應(yīng)氨肽酶(IRAP)或其片段與pH敏感的熒光蛋白的融合蛋白。優(yōu)選pH敏 感的熒光蛋白被融合在IRAP的羧基末端。優(yōu)選所述pH敏感的熒光蛋白 在酸性條件下(pH < 7.0)和在中性條件下(pH = 7.0)的熒光強(qiáng)度顯著不同、 更優(yōu)選在酸性條件下不發(fā)熒光而在中性條件下發(fā)熒光，最優(yōu)選所述pH敏 感的熒光蛋白為pHluorin。優(yōu)選所述胰島素響應(yīng)氨肽酶片段是它的第1-131 個(gè)氨基酸。2. 根據(jù)以上1的探針，其中將所述胰島素響應(yīng)氨肽酶或其片段的兩端 分別用pH敏感的熒光蛋白和pH不敏感的熒光蛋白標(biāo)記，優(yōu)選所述pH敏 感的熒光蛋白是pHluorin并且所述pH不敏感的熒光蛋白是TDimer2，更 優(yōu)選所述探針為T(mén)Dimer2-IRAP-pHluorin (SEQIDNo. 1)。3. 制備根據(jù)以上2的探針的重組表達(dá)質(zhì)粒，其為保藏號(hào)為CGMCC No. 1898的pTDimer2-IRAP-pHluorin。4. 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定表達(dá)根據(jù)以上1或2的探針的細(xì)胞以及所述探針的 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述細(xì)胞包括脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞，例如3T3-L1細(xì)胞系 (ATCC: CL-173)及其分化的脂肪細(xì)胞、L6 (ATCC: CRL-1458)和C2C12 細(xì)胞系(ATCC: CRL-1772)及其分化的肌肉細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如鼠類(lèi)。5. —種鑒定影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4上膜的化合物的方法，所述方法包 括以下步驟a. 獲得瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定表達(dá)根據(jù)以上1或2的探針的細(xì)胞；b. 將化合物與所述細(xì)胞溫育，和c. 比較在與所述化合物溫育前后檢測(cè)到的探針的熒光強(qiáng)度。 在熒光強(qiáng)度是與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4上膜的量成正相關(guān)的情況下，熒光強(qiáng)度增加表明所述化合物能夠增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4上膜。6. 根據(jù)以上5的方法，其中所述探針是TDimer2-IRAP-pHluorin，并 且在步驟c中比較在與所述化合物溫育前后pHluorin與TDimer2的熒光強(qiáng) 度比值的變化，該比值增加表明所述化合物增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4向細(xì)胞 膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。優(yōu)選在將化合物與所述細(xì)胞溫育30分鐘之后檢測(cè)熒光強(qiáng)度的比值。7. 根據(jù)以上6的方法篩選得到的化合物，其中增加所述比值的化合物 可以用于制備治療胰島素抗性的候選藥物。8. —種檢測(cè)細(xì)胞胰島素抗性的方法，所述方法包括以下步驟a. 獲得瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定表達(dá)根據(jù)以上1或2的探針的待測(cè)細(xì)胞；b. 將胰島素與所述細(xì)胞溫育，和c. 比較在與胰島素溫育前后檢測(cè)到的探針的熒光強(qiáng)度。9. 根據(jù)以上8的方法，其中所述探針是TDimer2-IRAP-pHluorin，并 且在步驟c中比較在與胰島素溫育前后pHluorin與TDimer2的熒光強(qiáng)度比值的變化，如果該比值沒(méi)有顯著變化則表明所述細(xì)胞具有胰島素抗性。優(yōu) 選在將胰島素與所述細(xì)胞溫育30分鐘之后檢測(cè)熒光強(qiáng)度的比值。10. 根據(jù)以上9的方法，其中所述細(xì)胞是脂肪細(xì)胞或肌肉細(xì)胞。發(fā)明詳述我們用兩種熒光蛋白pHluorin和TDimer2標(biāo)記與GLUT4完全共定位 的胰島素響應(yīng)氨肽酶(IRAP)蛋白的1-131氨基酸(使用全長(zhǎng)IRAP也獲得 了完全類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，數(shù)據(jù)未顯示)。我們?cè)贗RAP131 (IRAP蛋白的1-131 氨基酸)的前面融合有對(duì)pH值敏感的熒光蛋白pHluorin，在它的后面融合 有對(duì)pH不敏感的紅色熒光蛋白TDimer2 ，獲得融合蛋白 TDimer2-IRAP-pHluorin。 pHluorin在酸性的環(huán)境下不發(fā)光，在中性或者接 近中性的環(huán)境下在488 nm的光激發(fā)下發(fā)綠色熒光。將構(gòu)建好的熒光蛋白 通過(guò)脂質(zhì)體或者電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入脂肪細(xì)胞(系)或者肌肉細(xì)胞(系)中 表達(dá)，并建立穩(wěn)定細(xì)胞系。在胰島素等藥物刺激前，pHluorin處于酸性的 GLUT4囊泡中，因此在488 nm波長(zhǎng)的光激發(fā)下細(xì)胞只觀(guān)測(cè)到紅色熒光蛋 白TDimer2的紅色熒光，在細(xì)胞外液中加入胰島素等藥物后， TDimer2-IRAP-pHluorin轉(zhuǎn)運(yùn)上膜，此時(shí)pHluorin熒光蛋白暴露在細(xì)胞外， 在488 nm激光激發(fā)下發(fā)綠色熒光，同時(shí)TDimer2發(fā)紅色熒光，因此通過(guò) 測(cè)定胰島素等藥物刺激前后綠色熒光與紅色熒光的比值可以表征 TDimer2-IRAP-pHluorin的上膜量，也即表征了 GLUT4響應(yīng)胰島素藥物的 上膜量。通過(guò)篩選出刺激TDimer2-IRAP-pHluorin上膜量提高的藥物即篩選出了高效的治療糖尿病的藥物。pHluorinpHluorin是一個(gè)pH敏感的熒光蛋白，在pH 5.5的環(huán)境下不發(fā)熒光， 在中性pH 7.0環(huán)境下發(fā)綠色熒光。如果能將pHluorin定位于GLUT4囊泡 內(nèi)，這樣在胰島素刺激以前，pHluorin由于定位在酸性的囊泡內(nèi)而不發(fā)光， 胰島素刺激后GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)上膜，pHluorin就會(huì)定位在細(xì)胞外中性的環(huán)境 中而發(fā)熒光，這樣通過(guò)pHluorin熒光強(qiáng)度的升高就能檢測(cè)GLUT4的上膜 量。由于GLUT4蛋白是多次跨膜蛋白，其N(xiāo)端和C端都在胞漿，要使 pHluorin能定位于GLUT4囊泡內(nèi)，pHluorin必須插入GLUT4的loop環(huán)上， 勢(shì)必會(huì)影響GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)和功能。胰島素響應(yīng)氨肽酶(IRAP)胰島素響應(yīng)氨肽酶(Insulin responsive aminopeptidase, IRAP)是GLUT4 存貯囊泡(GSV)的標(biāo)記物，是唯一一種響應(yīng)胰島素刺激后同GLUT4 — 起轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白。IRAP是單次跨膜蛋白，C端在GLUT4囊泡內(nèi)，因此可以 用pHluorin標(biāo)記IRAP的羧基末端，在胰島素刺激前，IRAP-pHluorin不 發(fā)熒光，胰島素刺激后IRAP-pHluorin跟GLUT4 —起轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上， 此時(shí)pHluorin暴露在細(xì)胞外，在488 nm激發(fā)下發(fā)綠色熒光，因此可以用 來(lái)檢測(cè)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)上膜量。為了達(dá)到更好的信噪比，本發(fā)明中我們用熒光蛋白pHluorin和 TDimer2雙標(biāo)記與GLUT4共定位的IRAP蛋白的1-131氨基酸 (TDimer2-IRAP-pHluorin)，記錄胰島素刺激前后pHluorin與TDimer2熒 光的比值，也即記錄GLUT4響應(yīng)胰島素刺激的上膜量。因此探針 TDimer2-IRAP131-pH的上膜檢測(cè)能反應(yīng)脂肪和肌肉細(xì)胞對(duì)胰島素的響 應(yīng)，可用于胰島素替代藥物的篩選和檢測(cè)。另夕卜，除了有更好的信噪比外，雙熒光標(biāo)記的TDimer2-IRAP-pHluorin 探針可用于動(dòng)物體內(nèi)的GLUT4響應(yīng)胰島素刺激的上膜檢測(cè)。在動(dòng)物的活 體(/wwVo)檢測(cè)中，熒光蛋白的熒光強(qiáng)度會(huì)隨著位置的改變而發(fā)生變化， 因此僅用pHluorin標(biāo)記IRAP并記錄熒光強(qiáng)度的變化不能正確反應(yīng)GLUT4的上膜。而同時(shí)用Tdimer2紅色熒光蛋白標(biāo)記IRAP，通過(guò)記錄兩熒光蛋 白的強(qiáng)度比值的變化就可以真實(shí)地檢測(cè)胰島素等藥物刺激后活體動(dòng)物體 內(nèi)GLUT4的上膜情況。胰島素刺激引起的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 (GLUT4)的上膜對(duì)于維持體內(nèi) 血糖濃度具有重要的生理意義。最新的研究表明，早期2型糖尿病病人診 斷中發(fā)現(xiàn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑正常，但是GLUT4的上膜轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)了異常。 因此，發(fā)明一種能檢測(cè)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)上膜的探針對(duì)于2型糖尿病的早期診斷和治療具有非常重要的意義。本發(fā)明涉及一種可用于檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白4 (GLUT4)上膜的探針和方法，可實(shí)現(xiàn)高通量篩選。本發(fā)明構(gòu)造了一 個(gè)新的探針，通過(guò)簡(jiǎn)單的熒光比值測(cè)定即可判斷胰島素作用與靶細(xì)胞的效 應(yīng)。該探針用紅色熒光蛋白TDimer2和pH敏感的熒光蛋白pHluorin標(biāo)記 胰島素敏感的IRAP蛋白(TDimer2-IRAP-pHluorin)，建立穩(wěn)定表達(dá) TDimer2-IRAP-pHluorin蛋白的脂肪細(xì)胞系和骨骼肌細(xì)胞系。在胰島素等 藥物的刺激下，TDimer2-IRAP-pHluorin蛋白能從胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上， 由于熒光蛋白所處的環(huán)境pH值發(fā)生改變，pHluorin與TDimer2的熒光比 值呈現(xiàn)大幅度地升高。因此該發(fā)明通過(guò)檢測(cè)藥物刺激后pHluorin與 TDimer2熒光強(qiáng)度的比值變化來(lái)實(shí)現(xiàn)刺激GLUT4上膜的藥物的高通量篩 選。該方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，易于高通量篩選和工業(yè)化生產(chǎn)。序列表說(shuō)明SEQIDNo. 1: TDimer2-IRAP131-pHluorin融合蛋白的氨基酸全序歹iJ;SEQ ID No. 2: Tdimer2的編碼核苷酸序列；SEQIDNo.3: IRAP的編碼核苷酸序列；SEQ ID No. 4: pHluorin的編碼核苷酸序列。


圖1.融合蛋白GLUT4-EGFP與TDimer2-IRAP-pHluorin (在本文中有 時(shí)也稱(chēng)為T(mén)D2-IRAP-pH或TDimer2-IRAP131-pHluorin)共定位于脂肪細(xì)胞 (左GLUT4-EGFP的定位圖像；中TDimer2-IRAP-pHluorin的定位圖 像；右GLUT4-EGFP圖像和TDimer2-IRAP-pHluorin定位圖像的重合)；圖2.響應(yīng)胰島素刺激后TDimer2-IRAP-pHluorin在脂肪細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)上膜；圖3.胰島素刺激后TDimer2-IRAP-pHluorin在488 nm光激發(fā)下 pHluorin與TDimer2熒光強(qiáng)度比值隨著時(shí)間的變化曲線(xiàn)(注說(shuō)明書(shū)和圖 中pHluorin代表熒光蛋白pHluorin);圖4. pTDimer2-IRAP-pHluorin的質(zhì)f立i普?qǐng)D；圖5.質(zhì)粒pTDimer2-IRAP-pHluorin的構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施方式
下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說(shuō)明本 發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具 體限定。1.質(zhì)粒構(gòu)建先用RNA小提試劑盒RNeasy Mini Kit (Qiagen， GmbH， Germany)從 3T3-L1細(xì)胞(美國(guó)ATCC CL-173)中提總RNA，通過(guò)RT-PCR試劑盒 (Qiagen， GmbH, Germany)擴(kuò)出GLUT4的cDNA編碼基因(GenBank Accession Number: NM—009204),GLUT4上游引物序列5,-TACCGCTCGAGACAAGATGCCGTCGGGTTTCCAGCAGATCG-3，；GLUT4下游引物序列5-GCTAGGATCCCCGTCATTCTCATCTGGCCCTAAGTATTCAAG-所用PCR條件1、 50°C 30分；2、 95°C 3分；3、 95°C 30秒；4、 55°C 30秒5、 72°C 1分30秒6、 33次to 3 7、 72°C 10分。把擴(kuò)增出 來(lái)的PCR產(chǎn)物經(jīng)五coRI和SamM酶切后連入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pEGFP-Nl (Clontech Laboratories, Palo Alto,CA)的五coi I禾卩SamM酶切位點(diǎn)中，獲 得pGLUT4-EGFP。質(zhì)粒pTDimer2-IRAP-pHluorin的構(gòu)建參見(jiàn)圖5，主要分為三步首先，構(gòu)建pHluorin-Nl載體，以對(duì)pH值敏感的綠色熒光蛋白pHluorin (受贈(zèng)于 Dr. James Rothman[4])替換pEGFP-N 1載體中的EGFP。 pHluorin的引物 是上游5，- GATCGGATCCCACCATGAGTAAAGGAGAAGAAC -3，禾口 下游5，- GATCGCGGCCGCTTATTTGTATAGTTCATCCATG -3，.把擴(kuò)增出 來(lái)的PCR產(chǎn)物與哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pEGFP-Nl —起做BamHl與Notl雙 酶切后，做連接，將擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物連入載體，獲得重組載體 pHluorin-Nl 。然后，使用RNA小提試劑盒RNeasy Mini Kit (Qiagen， GmbH, Germany) 從3T3-L1細(xì)胞(美國(guó)ATCC CL-173)中提總RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)出IRAP 的cDNA (GenBank Accession Number: NM—172827)，所用上下游引物 分別為5,- GATCCTCGAGCATGGAGTCCTTTACCAATGATCGGCTTCAG -3, (上游)和5，-GCAAGGATCCTTCAGCCACTGGGAGAGCGTTTTCAG ATTC - 3， (下游)。再以此為模板做PCR擴(kuò)出IRAP蛋白N端393 bp的堿基，上下游引 物為上游5,-GATCCTCGAGCCACCACCATGGAGTCCTTTA CCAATGATCGG -3'和下游5，畫(huà)GCAAGGATCCGGCAGTAGATAAATCA CCATGATTACAGAG ACC -3，。通過(guò)Xholl和BamHI酶切接入pHluorin-Nl載體中，從而構(gòu)建出重組 載體pIRAP-pHluorin。 IRAP131片段的DNA序列如下5,-atggagtcctttaccaatgatcggcttcagcttccaaggaatatgatcgaaaacagcatgtttgaagaa gagccagatgtggtagatttagccaaagaaccttgtttacatcctctggaacccgatgaagtggaatatgagcccc gaggttcgaggcttctggtgcgaggtcttggtgagcatgagatggacgaggatgaagaggattatgagtcctctg cgaagctgctgggcatgtccttcatgaacagaagctcaggcctgcggaacagtgcagcaggctacaggcaga gtccagat路gacttgttcattaccctctgccaggaccttagtgatctgtgtttttgtcattgtggttgcggtctctgta atcatggtgatttatctactg-3'最后，以pcDNA3.1-TDimer2[5]為模板通過(guò)PCR將Tdimer2 (受贈(zèng)于 Dr. James Rothman[5])擴(kuò)增出來(lái)，其上下游引物為上游5，-GAAGCTAGCGACCATGGTGGCCTCCTCCGAGGACG -3，和下游5，-GCTGGATATCTGCAAGATCTCAGGAACAGGTGGTGG -3，。將PCR產(chǎn)物 經(jīng)Nhel禾Q BglII酶切連入重組載體pIRAP-pHluorin中，置于IRAP131 片段前面，從而構(gòu)建出pTDimer2-IRAP-pHluorin。實(shí)驗(yàn)中PCR用的是高 保真的pfii DNA聚合斷Stratagen, La Jolla, CA)。構(gòu)建的片段最終送于英駿 公司(北京，中國(guó))測(cè)序證實(shí)無(wú)誤。攜帶有重組表達(dá)質(zhì)粒 pTDimer2-IRAP-pHluorin的大腸桿菌(￡sc/2eWc/zZa co/O己經(jīng)于2006年12 月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No. 1898。2. 脂肪細(xì)胞系細(xì)胞3T3-L1的培養(yǎng)與分化3T3-L1 (購(gòu)自美國(guó)ATCC CL-173)的培養(yǎng)基為含有10%新生牛血清 (Gibco， Carlsbad, CA,U.S.A)的高糖DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) (Gibco)，培養(yǎng)條件為37。C， 5% C02。細(xì)胞呈梭型或樹(shù)枝狀，是 單層培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%時(shí)即可用于傳代。用預(yù)先溫浴(37°C) 的PBS洗兩次，在用0.05X的胰酶(Gibco)消化至細(xì)胞脫壁立刻用含有血 清的上述培養(yǎng)基終止消化，按10: 1 (體積比)的比例傳代，每隔2-3天 換液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)匯合后，即可用于分化，分化時(shí)將培養(yǎng)基換成含有1 pM 胰島素(SigmaNo. 10516)、 0.5 mM 3-isobutyl-l-methylxanthine (3-異丁基 -l-甲基黃嘌呤)和0.25 地塞米松、10%胎牛血清(Gibco)的高糖 DMEM(Gibco)。兩天后換成含有10X胎牛血清(Gibco)， lpM胰島素的培 養(yǎng)基，再過(guò)兩天換成僅含有10X胎牛血清(Gibco)的培養(yǎng)基。分化后的細(xì) 胞一直用10X胎牛血清(Gibco)的高糖DMEM(Gibco)培養(yǎng)。通常開(kāi)始分化 7天后，細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)明顯脂肪細(xì)胞的性狀，細(xì)胞變圓有明顯脂滴。3. 轉(zhuǎn)染分化的脂肪細(xì)胞3T3-L1取分化7天后的脂肪細(xì)胞，用0.05。％的胰酶(Gibco)消化至細(xì)胞脫壁， 立刻用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，在室溫1500轉(zhuǎn)/分 鐘離心收獲細(xì)胞，然后用OPTI-MEM液體培養(yǎng)基(Gibco No. 31985-070) 洗一次除去殘留的培養(yǎng)基成分，最后重懸細(xì)胞加入30 ug質(zhì)粒使終體積800 Pi 。將細(xì)胞懸液加入4 mm電擊池，冰浴，用BTX 830電轉(zhuǎn)儀 (Biocompare， South San Francisco, CA,U.S.A)電擊，電壓定為310 V ， 時(shí)間10ms。電擊后將細(xì)胞滴在涂有多聚賴(lài)氨酸(SigmaNo. 25988-63-0) 的玻片上，待15-20分鐘后細(xì)胞貼壁即可加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。 細(xì)胞貼壁兩天即可用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞必須經(jīng)過(guò)2小時(shí)以上無(wú)血清培 養(yǎng)基的饑餓。實(shí)驗(yàn)中的外液(單位mM): 129NaCl、 4.7KC1、 1.2KH2P04、 5NaHC03、 10HEPES、 3 Glucose、 2.5 CaCl2、 1.2 MgS04和0.1 %牛血清 白蛋白)(pH7.4)。實(shí)驗(yàn)中用到的外液中的胰島素濃度均為100 nm。除了特 殊注明的外，所有試劑均購(gòu)于Sigma公司。4. 圖像釆集所用共聚焦顯微鏡為Olympus 1X81 ，控制軟件FV500.全內(nèi)反射熒光成像系統(tǒng)(TIRFM)以O(shè)lympus公司的IX-81型倒置顯 微鏡為基^lj，在顯微鏡的背面接上全內(nèi)反射的光路系統(tǒng)并結(jié)合了多個(gè)激光 光源通過(guò)AOTF對(duì)激發(fā)光的波長(zhǎng)進(jìn)行選擇。物鏡為德國(guó)ZEISS objective "fluar"100X/(OA)1,45油鏡(n= 1.518)。由于EGFP和Tdimer2分別可以 被488 nm和561nm波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)，我們選擇了 z488/561rpc的二次 分光鏡(chromaNo.l09793a)和LP505 nm的發(fā)射光濾光片以便在視野中 可以同時(shí)看見(jiàn)綠色和紅色的熒光。為了能將紅色和綠色的信號(hào)分開(kāi)同時(shí)記 錄到兩種不同的信號(hào)，我們?cè)陲@微鏡右側(cè)出光口放置了一個(gè)Dual-View Micro-Imager (Optical-Insights, Tucson, AZ， USA)，通過(guò)里面的二次分光 鏡和不同的濾光片將紅綠兩種信號(hào)分開(kāi)，分別投影到CCD的兩個(gè)部分。 PCO風(fēng)冷電子增益CCD，分辨率可達(dá)67nm，采樣頻率為5 HZ，曝光時(shí) 間100ms，由TillVison控制。實(shí)驗(yàn)中消散場(chǎng)的穿透深度為113 nm 。光路 部分和控制軟件、硬件均為德國(guó)Till公司的產(chǎn)品，該系統(tǒng)能更好的實(shí)現(xiàn)多 光源的同時(shí)激發(fā)。5. 實(shí)驗(yàn)緒果1) GLUT4-EGFP與TDimer2-IRAP-pHluorin共定位于脂肪細(xì)胞電轉(zhuǎn)兩天后，將共轉(zhuǎn)了質(zhì)粒 pGLUT4-EGFP 與pTDimer2-IRAP-pHluorin的脂肪細(xì)胞進(jìn)行通透，固定先將細(xì)胞用PBS洗 兩次，每次三分鐘，室溫加入現(xiàn)配的4%多聚甲醛(PBS中)固定20分 鐘，PBS洗兩次；加入新鮮現(xiàn)配含0.1% Triton X-100的PBS室溫5分鐘， PBS洗一次，重復(fù)通透三次，最后PBS洗兩次。將處理后的細(xì)胞置于全內(nèi) 反射熒光顯微鏡下，細(xì)胞外液換成pH5.5的外液129 mmol NaC1、4.7 mmol KC1、 1.2mmolKH2P04、 5mmolNaHC03、 10 mmol MES hydrate 、 3 mmol 葡萄糖、2.5 mmol CaCl2、 1.2 mmol MgS04和0.1 % BSA(pH5.5)，將蛋白 TDimer2-IRAP-pHluorin中綠色熒光蛋白pHluorin淬滅，激光激發(fā)后該蛋 白只發(fā)射紅色熒光，而GLUT4-EGFP在激光激發(fā)后發(fā)射綠色熒光。同時(shí) 用488nm與561nm激光激發(fā)，對(duì)紅綠發(fā)射光同時(shí)采集，可以觀(guān)測(cè)到 GLUT4-EGFP與TDimer2-IRAP-pHluorin完全共定位。該結(jié)果表明探針 TDimer2-IRAP-pHluorin可以完全替代GLUT4的上膜而用于檢測(cè)胰島素等 藥物刺激后GLUT4的上膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率(圖1)2)響應(yīng)胰島素刺激后TDimer2-IRAP-pHluorin在脂肪細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)上膜 取分化好的脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pTD2-IRAP131-pH兩天后做共聚焦熒 光顯微成像實(shí)驗(yàn)(共聚焦顯微鏡為Olympus 1X81，控制軟件為FV500), 用488nm波長(zhǎng)的激光激發(fā)，收集510士20nm發(fā)射波譜，即為pHluorin的發(fā) 射光譜。將細(xì)胞首先置于正常外液中(pH 7.4),此時(shí)只有已經(jīng)上膜的 pHluorin處于pH 7.4的環(huán)境中，因此膜上可見(jiàn)有少量的熒光。然后將外液 換成pH5.5的外液，由于pHluorin在酸性環(huán)境中不發(fā)光，因此膜上的熒光 迅速被淬滅掉，而胞內(nèi)由于氫離子不能滲透，處于胞內(nèi)酸性囊泡中的 pHluorin發(fā)出很微弱的熒光。緊接著將細(xì)胞外液換成可滲透的pH 7.4的氯 化銨外液，此時(shí)由于整個(gè)細(xì)胞都處在pH 7.4的環(huán)境中，因此，所有的 pHluorin都發(fā)出很強(qiáng)的熒光。細(xì)胞從中性環(huán)境轉(zhuǎn)換到pH 5.5外液時(shí)膜上被 淬滅掉的熒光可以反映蛋白TDimer2-IRAP-pHluorin的上膜量，也即反應(yīng) 了 GLUT4的上膜量。圖中a表示胰島素刺激后不同的時(shí)間內(nèi)改變細(xì)胞外 液pH值后細(xì)胞的熒光成像圖。b表示隨著pH值的改變熒光強(qiáng)度的變化曲 線(xiàn)。c表示胰島素刺激后TDimer2-IRAP-pHluorin的上膜量的柱狀統(tǒng)計(jì)圖。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胰島素刺激30分鐘后，TDimer2-IRAP-pHluorin的上膜量由刺激前的20 ^的上膜量升高為刺激后的60。Z的上膜量。3 ) TDimer2-IRAP-pHluorin在胰島素刺激下pHluorin與TDimer2熒光強(qiáng)度隨著時(shí)伺的變化取分化好的脂肪細(xì)胞電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒TD2-IRAP131-pH兩天后做寬場(chǎng)熒光實(shí)驗(yàn)與全內(nèi)反射熒光成像系統(tǒng)共用一套顯微鏡，光源為氙燈 (till-photonics polychrome V)，測(cè)該蛋白上膜導(dǎo)致紅綠兩蛋白熒光值比值 變化。加胰島素前五分鐘至加胰島素后三十分鐘每隔一分鐘采單張圖片。 由于pHluorin與Tdimer2均可在488 nm的光激發(fā)下發(fā)光，pHluorin在細(xì) 胞內(nèi)酸性環(huán)境下發(fā)光很弱，上膜后由于接觸到胞外中性環(huán)境熒光突然變 亮，Tdimer2是pH不敏感的紅色熒光蛋白，當(dāng)外部環(huán)境由酸性變?yōu)橹行?后，熒光亮度幾乎不變。所以蛋白TD2-IRAP131-pH在胰島素刺激下上膜 后，細(xì)胞pHluorin蛋白在氙燈488nrn的光激發(fā)下，熒光顯著增加，而 Tdimer2熒光幾乎不變，僅有微弱的淬滅。二者熒光比值可以很好得描述 蛋白TD2-IRAP131-pH在胰島素刺激下的上膜情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。 其中a、 b圖為同一個(gè)細(xì)胞同次實(shí)驗(yàn)，a圖給出加胰島素后每十分鐘細(xì)胞熒 光圖，上排表示pHluorin隨胰島素刺激熒光變化圖，下排表示Tdimer2隨 胰島素刺激熒光變化圖。b圖是給出加胰島素后每三分鐘細(xì)胞紅綠熒光值， 及二者比值。c圖是對(duì)多個(gè)細(xì)胞紅綠熒光值比值擬合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在胰島素藥物刺激下TDimer2-IRAP-pHluorin轉(zhuǎn)運(yùn)上膜， pHluorin與TDimer2熒光強(qiáng)度的比值升高，30分鐘左右趨于穩(wěn)定。因此， 篩選糖尿病治療藥物時(shí)可在往細(xì)胞中加入藥物30分鐘后檢測(cè)綠色和紅色 熒光強(qiáng)度的比值。工業(yè)適用性本發(fā)明的探針和方法可以檢測(cè)哪些藥物能刺激脂肪細(xì)胞或者肌肉細(xì)胞 中GLUT4的上膜轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而調(diào)控體內(nèi)的血糖代謝，這些藥物即為具有醫(yī)藥應(yīng)用前景的糖尿病治療候選藥物。 錄雄[1] V^atson， R. T., Kanzaki， M.禾卩Pessin, J. E. Regulated membrane trafficking of the insulin-responsive glucose transporter 4 in adipocytes. Endocr Rev, 2004, 25(2): 177-204[2] Dugani, C. B.禾卩Klip, A. Glucose transporter 4: cycling, compartments and controversies. EMBO Rep， 2005， 6(12): 1137-1142[3] Karl'sson, H.K" Ahlsen， M., Zierath, J.R., Wallberg-Henriksson, H., & Koistinen, H.A. Insulin signaling and glucose transport in skeletal muscle from first-degree relatives of type 2 diabetic patients. Diabetes 55, 1283-1288 (2006).[4] Gero Miesenbo"ck， Dino A. De Angelis & James E. Rothman Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins Nature, Vol 394, 9 July 1998.[5] Yang, X.， Xu， R， and Xu, T. (2005) Biochem. Biophys, Res.Commun. 330,914 - 920序列表<110>中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所〈120〉用于檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4上膜的探針和方法 〈130〉 IB070363 <160> 4<170〉 Patentln version 3.1〈210〉 1〈211> 839<212> PRT〈213>人工序列<400> 1Met Val Ala Ser Ser Glu Asp Val lie Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys15 10 15Val Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu lie Glu Gly20 25 30Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gin Thr Ala Lys Leu Lys35 40 45Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp lie Leu Ser Pro50 55 60Gin Phe Gin Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp lie 65 70 75 80Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg85 90 95Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gin Asp Ser100 105 110Ser Leu Gin Asp Gly Thr Leu lie Tyr Lys Val Lys Phe Arg Gly Thr115 120 125Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gin Lys Lys Thr Met Gly Trp 130 135 140Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg 145Glu lie His GinArg 150Leu Lys Leu LysAla 165Glu Phe Lys Thr lie Tyr Met Ala 180Val Asp Thr LysAsp 155GlyGly Val Leu Gly His TyrAsp 170Lys Pro Val GinTyr Tyr Tyr 195Tyr Thr lie Val Glu Gin 210Phe Leu Gly His Gly 225Ala Ser Ser GluLys 185Asp lie Thr SerLeu 200Tyr Glu Arg Ser Glu 215Gly Ser Thr GlyLys Gly 160 Leu Val 175 Leu Pro Gly 190Asn Glu AspHis 205Arg His His LeuThr 230Val lie Lys GluGly 220Gly Ser SerAsp 245Val Asn Gly HisSer 235Met Arg Phe LysMet Glu Gly Ser 260Pro Tyr Glu GlyGlu Gly Arg 275Gly Pro Leu ProPhe 250Glu Phe Glu lie Glu 265Gin Thr Ala Lysl>ys Gly 290Gin Tyr Gly Ser Lys 305Tyr Lys Lys LeuPhe 295 TyrThr 280Ala Trp Asp lieAla 310Phe Pro GluVal Lys HisSer 325Gly Gly Val ValLys GlyPro 315 LysAsn Phe Glu Asp 340Gin Asp Gly Thr Leu lie Tyr 355Asp Gly Pro ValPhe 330Val Thr Gin AspThr 345Val Lys Phe ArgGly Thr 240 Val Arg 255 Gly Glu Gly 270Leu Lys Val Thr 285Leu Ser Pro Gin Phe 300Ala Asp lie Pro Asp 320Trp Glu Arg Val Met 335Ser LeuPro Pro 370Met 375Lys 360Gin Lys Lys ThrSer 350Thr Asn PheMet 380Gly 365Gly Trp Glu AlaSer Thr 385His Gin Ala LeuGlu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly395His Tyr Leu ValTyr 390Leu Lys Asp GlyLys 405Met Ala Lys LysLys Thr lie Tyr 420Tyr Val Asp Thr Lys Leu Asp 435lie Val Glu Gin Tyr Glu 450Ser Asp Leu Glu Met 465Arg Asn Met lieGly 410Pro Val Gin Leu Pro 425Thr Ser His AsnGlu lie 400 Glu Phe 415Tyr Tyrlie 440Ser Glu Gly ArgGly 430Asp Tyr ThrArg 455Glu Thr Phe Thr Asn 470Asn Ser Met PheGlu 445His Leu Phe LeuHis 460Arg Leu GinAsp Leu Ala Lys 500 ProGlu 485Glu Pro Cys LeuAsp 475Glu Glu Pro AspGlu Tyr Glu 515His Glu Met Asp Glu 530Leu Gly Met Ser Phe 545Thr Gly Tyr ArgArg Gly SerGly AspGlu 490His Pro Leu Glu Pro 505ILeu Leu Val ArgArg 520Glu Asp Tyr GluGlu 535Asn Arg Ser SerGly 525 SerAsp 510 LeuAlaMet 550Ser Pro Asp GlyGin 565lie Cys Val PheArg Thr Leu Val 580lie Met Val lie Tyr Leu Arg 595Gly Val Val ProGly 555Thr Cys Ser Vsl Pro 570Val lie Val Val Ala 585Pro Met Ser LysPhe Thr 610lie 615Asp 600Leu Val Glu LeuAsp 620Leu Pro 480 Val Val 495Glu ValGly GluLys LeuSer Ala 560 Ser Ala 575 Val Ser Val 590Gly Glu Glu Leu 605Gly Asp Val AsnSer 540Leu Arg AsnGly His 625Gly LysLys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly 630Leu ThrPro Trp ProSer ArgMet Pro 690 Gly Asn 705Val AsnTyr 675 GluThr 660 ProLeu 645 LeuLysPhe lie CysVal Thr ThrThr 650 SerGlu Gly 635Thr Gly Tyr Gly ValAsp Ala Thr Lys LeuAsp Gly Tyr ValHis MetTyr Lys Thr Arg lielie Leu Glylie MetArg His 770 Gin Asn 785Tyr Leu Asp His Gly MetAla 755 AsnHis 740 AspGlu 725 LysArg 710 LeuGin 695 AlaLys 680 GluPhe 665Arg His Asp Phe Arg Thr liePhe 685 PheGin 670 LysPro 655 CysLys Gly lieLeu Glu TyrLys Gin Lys lie Glu AspThr Pro liePhe ThrMetAsp 835<210> 2 〈211〉 1395Val 820 GluThr 805 LeuGly 790 SerGly 775 AspAsn 760 GlyAsn 745 GlyAsp 730 Tyr715 PheLys Glu AspAsn Asp His lie Lys AlaVal Gin LeuGly Pro ValThr Leu Serteu 795 AspAla 780 LeuAsn 765 AspGin 750 PheGly 735 ValPro Asn GluLys 810Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly825lie 830815 ThrTyr 640 ValPheSer AlaLys Asp AspPhe 700Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp ThrLeu 720 AsnTyrlieLys His Tyr GinPro Asp AsnHis 800HisLeu Tyr Lys<212> 隨 〈213〉 質(zhì)粒 <400> 2stggtggcctcctccgaggacgtcaitc犯agagttcatgcgcttca鄉(xiāng)tgcgcatggag60ggctccgtgaacggccacgagttcgagatcg鄉(xiāng)gcgagggcgagggccgcccctacgag120ggcacccagaccgccaagctg鄉(xiāng)gtgacc鄉(xiāng)ggcggccccctgcccttcgcctgggac180atcctgtccccccagttccagtacggctcc鄉(xiāng)gcgtacgtgaagcaccccgccgacatc240cccgactacaagaaigctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttc300gcgtggtgaccgtgacccaggaictcctccctgcaggacggcacgctgatc360tacaaggtgaagttccgcggcaccaacttcccccccgacggccccgtaatgcaga卿ag420accatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctga鄉(xiāng)gc480gagatccaccaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagacc540atctacatggccaagaagcccgtgcagctgcccggctactactacgtggacaccaagctg600gacatcacctccc3caacg3ggactacaccatcgtggaacagtacgagcgctccgagggc660cgccacceicctgttcctggggcatggcaccggcagcaccggcagcggcagctccggcacc720gcctcctccgcaaagagttcatgcgcttcaaggtgcgcatgg鄉(xiāng)gctcc780gtg認(rèn)ggccaCg8LgttCg￡lgatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacc840cagaccgcca8gCtg鄉(xiāng)gtg織鄉(xiāng)ggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctg900tccccccagttccagtacggctccaaggcgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgac960tgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggac1020ggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcacgctgatCt3C3ELg1080gtgaagttccgcggcaccaacttcccccccgacggccccgtaatgcagaagaagaxxatg1140ggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacCCCCgCg￡LCggcgtgctgaagggcg卿tc1200caccaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagaccatctac1260atggccaagaagcccgtgcagctgcccggctactactacgtggacaccaagctggacatc1320acctccceLcaacgaggactgLcaccatcgtggaatcagtacgagcgctccgagggccgccac1380cacctgttcctgtag1395<210> 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1. 一種用于檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4上膜的探針，該探針是胰島素響應(yīng)氨肽酶(IRAP)或其片段與pH敏感的熒光蛋白的融合蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的探針，其中將所述胰島素響應(yīng)氨肽酶或其片段的 兩端分別用pH敏感的熒光蛋白和pH不敏感的熒光蛋白標(biāo)記，優(yōu)選所述 pH敏感的熒光蛋白是pHluorin并且所述pH不敏感的熒光蛋白是 TDimer2，更優(yōu)選所述探針為T(mén)Dimer2-IRAP-pHluorin (SEQIDNo. 1)。
3. 制備根據(jù)權(quán)利要求2的探針的重組表達(dá)質(zhì)粒，其為保藏號(hào)為 CGMCCNo. 1898的大腸桿菌菌株中的質(zhì)粒pTDimer2-IRAP-pHluorin。
4. 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1或2的探針的細(xì)胞以及所述探 針的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述細(xì)胞包括脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞，例如3T3-L1細(xì)胞 系(ATCC: CL-173)及其分化的脂肪細(xì)胞、L6 (ATCC: CRL-1458)和C2C12 細(xì)胞系(ATCC: CRL-1772)及其分化的肌肉細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如鼠類(lèi)。
5. —種鑒定增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4上膜的化合物的方法，所述方法包 括以下步驟a. 獲得瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1或2的探針的細(xì)胞；b. 將化合物與所述細(xì)胞溫育，和c. 比較在與所述化合物溫育前后檢測(cè)到的探針的熒光強(qiáng)度。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述探針是TDimer2-IRAP-pHluorin， 并且在步驟c中比較在與所述化合物溫育前后pHluorin與TDimer2的熒光 強(qiáng)度比值的變化，該比值增加表明所述化合物增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4向細(xì) 胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法篩選得到的化合物，其中增加所述比值的化 合物可以用于制備治療胰島素抗性的候選藥物。
8. —種檢測(cè)細(xì)胞胰島素抗性的方法，所述方法包括以下步驟a. 獲得瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1或2的探針的待測(cè)細(xì)胞；b. 將胰島素與所述細(xì)胞溫育，和c. 比較在與胰島素溫育前后檢測(cè)到的探針的熒光強(qiáng)度。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述探針是TDimer2-IRAP-pHluorin，并且在步驟c中比較在與胰島素溫育前后pHluorin與TDimer2的熒光強(qiáng)度 比值的變化，如果該比值沒(méi)有顯著變化則表明所述細(xì)胞具有胰島素抗性。 10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞是脂肪細(xì)胞或肌肉細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用于檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)上膜的探針和方法，可實(shí)現(xiàn)高通量篩選。該探針用紅色熒光蛋白TDimer2和pH敏感的熒光蛋白pHluorin標(biāo)記胰島素敏感的IRAP蛋白(TDimer2-IRAP-pHluorin)，建立穩(wěn)定表達(dá)TDimer2-IRAP-pHluorin蛋白的脂肪細(xì)胞系和骨骼肌細(xì)胞系，通過(guò)簡(jiǎn)單的熒光比值測(cè)定即可判斷胰島素作用與靶細(xì)胞的效應(yīng)。因此，本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)藥物刺激后pHluorin與TDimer2熒光強(qiáng)度的比值變化來(lái)實(shí)現(xiàn)刺激GLUT4上膜的藥物的高通量篩選。該方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，易于高通量篩選和工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/52GK101266242SQ20071006438
公開(kāi)日2008年9月17日 申請(qǐng)日期2007年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月14日
發(fā)明者麗 姜, 濤 徐, 徐平勇, 范俊梅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所