專利名稱：一種不同海區(qū)泥蚶的指紋鑒別方法
技術領域：
本發(fā)明涉及物種內的鑒別技術，尤其是涉及一種不同海區(qū)泥蚶的指紋鑒別方法。
背景技術：
泥蚶(:Tegi'"srcs ^"a/7oss Linnaeus)俗稱血蚶、寧蚶、花蚶、粒蚶，屬于 軟體動物門(Mollusca),瓣鰓綱(Laraellibranchia)，列齒目(Taxodonta)，蚶科 (Aixidae)動物，主要分布于西太平洋、印度洋和大西洋海域的中國、韓國、泰 國、菲律賓以及馬來西亞等國家。在我國分布在山東半島以南沿海。泥蚶作為水 產(chǎn)業(yè)主導經(jīng)濟養(yǎng)殖貝類之一，味道鮮美、營養(yǎng)價值高、深受人們的喜愛，市場需 求量較大，但是不同產(chǎn)地的泥蚶的味道和價格不同，如奉化和樂清的泥蚶血色鮮 紅、較淡，而榮成的泥蚶血色紅，而廣西北海、廣東陽江和湛江泥蚶血色暗紅， 較深；并且樂清的泥蚶的味道比較鮮美，價格相應較高。
泥蚶雌雄異體，2齡性成熟，成熟后的泥蚶在殼長與殼高的比值上，訕頭泥蚶、 湛江泥蚶、韓國泥蚶和榮成泥蚶都相似，在殼表縱肋條數(shù)方面它們之間也未見顯著性 差異，奉化泥蚶、樂清泥蚶和福鼎泥蚶之間也在殼長、殼高和殼表縱肋條數(shù)無顯著性差 異，因此單從形態(tài)學是很難區(qū)分汕頭泥蚶、湛江泥蚶、韓國泥船和榮成泥蛇，也難以 區(qū)別奉化泥蚶、樂清泥蚶和福鼎泥蚶。另外當受精卵發(fā)育為稚貝時，各地的泥蚶的稚 貝基本相似，很難從形態(tài)學加以區(qū)分，因此給泥蚶的養(yǎng)殖種類的鑒別帶來不便。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種不同海區(qū)泥蚶的指紋鑒別方法，該方法能充 分區(qū)別不同海區(qū)的泥蚶的種類。
本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為 一種不同海區(qū)泥船的指紋鑒別方 法，特點是通過由所述泥蚶的消化腺組織的特異性蛋白(酶)和由所述的泥蚶的特異性 的DNA序列來鑒別。
對所述的特異性蛋白用下述步驟進行標定
a、選取組織隨機選取所述的泥蚶的消化腺組織并稱重；
b、 提取酶液把所述的泥蚶的消化腺組織放入玻璃勻漿器中，然后加入重量是所 述的泥蚶的消化腺組織的3倍的0.05%巰基乙醇水溶液，在冰浴條件下制成勻漿液；把 所述的勻漿液放入溫度為4。C的冷凍離心機中，用12000 r pm離心30 min，取得上清液， 即為酶液。
c、 電泳在上述酶液加入適量的溴酚蘭指示劑，然后用濃度為7 7.5%的聚丙烯 酰胺凝膠電泳，電泳時間為3h 5h。
d、 顯色將所述的聚丙烯酰胺凝膠置于染色液中，放在37X:恒溫箱中，在所述的 聚丙烯酰胺凝膠上形成顯色的條帶，隨時觀察所述的條帶的顯色結果，至所述的條帶顯 色清晰為止，然后用7.5%的乙酸固定所述的條帶，即為酶帶。
所述的特異性蛋白為蘋果酸脫氫酶(MDH)，所述的蘋果酸脫氫酶的染色液組成為 NAD+ (輔酶I) 16mg、 NBT (四氮硝基唑藍)16mg、 PMS (酚嗪甲硫酸鹽)1,5 mg、 pH 7.0的1M的蘋果酸鈉5ml、 pH 7.1的0.5M的Tris-HCl溶液(三羥甲基安基甲烷-鹽 酸)8ml，用蒸餾水定容至50ml。
所述的特異性蛋白為超氧化物岐化酶(SOD酶)，所述的超氧化物岐化酶的染色液 組成為NBT22mg、 VB20.005g、 Na2-EDTA (乙二胺四乙酸)12 mg和pH8.0的0.05 M的Tris-HCl溶液8ml，用蒸餾水定容至50ml。
對所述的特異性的DNA序列用下述步驟進行標定
e、 取樣取所述的泥蚶足部的肌肉組織，剪碎所述的肌肉組織；
f、 提取DNA:用常規(guī)方法從剪碎的所述的肌肉組織中提取DNA;
g、 PCR反應擴增用特異性引物對提取的所述的DNA進行PCR反應擴增，得到 所述的PCR反應擴增的產(chǎn)物；
h、 電泳用P/。 1.5。/。的瓊酯糖凝膠對所述的PCR反應擴增的產(chǎn)物進行電泳10 20min，在所述的瓊酯糖凝膠中加入溴化乙錠，從所述的瓊酯糖凝膠中得到特異性譜帶；
i、 測序在所述的特異性譜帶上測得所述的泥蚶的特異性的DNA序列。 所述的特異性引物為
F: 5' -GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3';
R: 3， -GGGTCGATGAAGAACGCAG-5';從上海生工生物工程技術服務有限 公司購得。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于由于通過泥蚶的消化腺組織的特異性蛋白和泥 蚶的特異性的DNA序列來鑒別泥蚶的產(chǎn)地，由于不同海區(qū)的泥蚶的消化腺組織內的特異
性蛋白即SOD酶或MDH酶的酶帶各有異同，另外不同海區(qū)的泥蚶的特異性的DNA序列 也各有其特異性，因此從泥蚶的消化腺組織的特異性蛋白和泥蚶的特異性的DNA序列就 能鑒別泥蚶的產(chǎn)地，便于識別和養(yǎng)殖味美價高的泥蚶。


圖1為不同海區(qū)的泥蚶的MDH酶帶譜表； 圖2為不同海區(qū)的泥蚶的SOD酶帶譜表。
具體實施例方式
以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。 實施例1
一種不同海區(qū)泥蚶的指紋鑒別方法，隨機分別取各海區(qū)的泥蚶，然后對每個海區(qū)的
泥蚶分別作下述步驟的處理
a、 選取組織隨機選取10個浙江樂清泥蚶，分取每個泥蚶的消化腺組織并稱重， 得到lg組織；
b、 提取酶液把每個泥蚶的消化腺組織分別放入玻璃勻漿器中，然后加入0.05% 巰基乙醇水溶液3ml，在冰浴條件下制成勻漿液；把勻漿液放入溫度為4'C的冷凍離心 機中，用12000 rpm離心30 min，離心結束后提取上清液，上清液即為酶液；
c、 電泳將酶液分成兩份，在每份酶液中分別加入適量的溴酚蘭指示劑，然后各 自用濃度為7 7.5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳時間為4h,在聚丙烯酰胺凝膠上形成 條帶；
d、 將其中一份的聚丙烯酰胺凝膠置于由NBT22mg、 VB20.005g、 Na4-EDTA12mg 和pH8.0的0.05 M的Tris-HCl溶液8ml混合配制，用蒸餾水定容至50ml的染色液中， 放在37'C恒溫箱中顯色，隨時觀察條帶的顯色結果，至條帶顯色清晰，用7.5%的乙酸 固定條帶，IO個浙江樂清泥蚶得到基本相同的SOD酶帶；同樣方法分別可以得到浙江 奉化泥蚶、福建福鼎泥蚶、山東榮成泥蚶、韓國釜山泥蚶、廣東仙頭泥蚶和廣東湛江泥 蚶等的SOD酶帶，綜合比較各海區(qū)泥蚶SOD酶帶，得到圖1的各海區(qū)泥蚶SOD酶帶 的譜表，從圖1的各海區(qū)泥蚶SOD酶帶的譜表中可以看出浙江奉化泥蚶8、浙江樂清泥 蚶5、福建福鼎泥蚶2、山東榮成泥蚶14、韓國釜山泥蚶ll、廣東汕頭泥蚶3和廣東湛 江泥蚶9的SOD酶帶各有異同，泥蚶的SOD酶帶一般由4-7條，其中湛江和汕頭的泥 蚶的SOD酶譜表型較一致，由7條酶帶組成，而其他的泥蚶的SOD酶譜表型一致，均 由4條酶帶組成，從中就可區(qū)分開湛江和油頭的泥蚶與榮成和韓國泥蚶的區(qū)別；圖l中 還有雜交泥蚶的SOD酶帶1、 4、 7、 10、 13，廣西泥蚶的SOD酶帶12、 15和廣東陽江 泥蚶的SOD酶帶6。
將另一份的聚丙烯酰胺凝膠置于由NAD+16mg、 NBT16mg、 PMS 1.5mg、 pH 7.0 濃度為1M的蘋果酸鈉5ml和pH 7.1濃度為0.5M的Tris-HCl 8ml混合配制，用蒸餾水 定容至50ml的染色液中，在37i:恒溫箱中過夜，使條帶顯色，隨時觀察條帶的顯色結 果，至條帶顯色清晰為止，次日先用50%的乙酸脫色，然后用7.5%的乙酸固定顯色的 條帶，從10個浙江樂清泥蚶中得到基本相同的MDH酶帶；同樣方法分別可以得到浙 江奉化泥蚶、福建福鼎泥蚶、山東榮成泥蚶、韓國釜山泥蚶、廣東汕頭泥蚶和廣東湛江 泥蚶的得到SOD酶帶，綜合比較各海區(qū)泥蚶MDH酶帶，得到圖2的各海區(qū)泥蚶的MDH 酶帶的譜表，從圖2中各海區(qū)泥蚶MDH酶帶的譜表中可以看出浙江奉化泥蚶3、浙江 樂清泥蚶4、福建福鼎泥蚶5、山東榮成泥蚶2、韓國釜山泥蚶l、廣東汕頭泥蚶6和廣 東湛江泥蚶7的MDH酶帶各有異同，其中各地的泥蚶一般有酶帶4條，即酶帶a、 c、 d和e，油頭和湛江群體的酶帶d、 e活性明顯高于其它群體，訕頭泥蚶多出酶帶f，而 湛江泥蚶多出酶帶f和b，從中可以區(qū)分開汕頭泥蚶與湛江泥蚶。
另外用下述步驟對浙江樂清泥蚶、福建福鼎泥蚶、山東榮成泥蚶、韓國釜山泥蚶和 廣東湛江泥蚶的特異性的DNA序列進行標定
e、 取樣隨機選取浙江樂清泥蚶5個，分別取每個泥蚶的足肌肉組織100mg，剪碎；
f、 提取DNA:用常規(guī)方法從剪碎的肌肉組織中提取DNA;
g、 PCR反應擴增用從上海生工生物工程技術服務有限公司所購的特異性引物F: 5， -GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3'禾卩R: 3' -GGGTCGATGAAGAACGCAG-5'， 對每個泥蚶的提取的DNA進行PCR反應擴增；
h、 電泳用1。/。的瓊酯糖凝膠對各自的PCR反應擴增的產(chǎn)物進行電泳1.5h，在瓊 酯糖凝膠中加入溴化乙錠，在瓊酯糖凝膠中得到特異性譜帶；
i、 測序對約500bp的特異性譜帶上進行測序，5個浙江樂清泥蚶的特異性的DNA 序列一致；同樣方法可以得到福建福鼎泥蚶、山東榮成泥蚶、韓國釜山泥蚶和廣東湛江 泥蚶的特異性的DNA序列，綜合得到下述的特異性的DNA序列表中結果，從DNA序 列表中可以看出不同海區(qū)的泥蚶的DNA序列中堿基對有其特異性，從中就可以區(qū)分開 浙江樂清泥蚶、福建福鼎泥蚶、山東榮成泥蚶、韓國釜山泥蚶和廣東湛江泥蚶。
這樣通過泥蚶的MDH酶帶特征、泥蚶的SOD酶帶特征和泥蚶的特異性的DNA序 列特征就可以鑒別泥蚶的產(chǎn)地。
序列表
1、 DNA序列的測定由寶生物工程(大連)公司(TaKaRa)測序號為8G，測序樣品位 PCR產(chǎn)物。
2、 測序反應試劑及測序儀
領ij序反應AB1 PRISM TM Terminator Cycle Sequencing Ready Rection Kit with AmpliTaq DNA Polymerase, FS (AppliedBiosystems) 測序儀AB1 PRISM TM 377XL DNA Sequencer
3、 測序使用引物
F Primer CM13-47) CGCCA GGGTT TTCCC AGTCA CGAC R Primer (RV-M) GAGCG GATAA CAATT TCACA CAGG T7 Promoter Primer TAATA CGACT CACTA TAGGG T3 Promoter Primer ATTAA CCCTC ACTAA AGGGA A SP6 Promoter Primer CATAC GATTT AGGTG ACACT ATAG
4、 結果
共測序5個樣品，進行11次反應
5、 樣品
ZG4448:山東榮成泥蚶；ZG4449:韓國釜山泥蚶；ZG4450:浙江樂清泥蚶； ZG4451:廣東湛江泥蚶；
ZG4452:福建福鼎泥蚶。
樣品ZG4449和ZG4452克隆后測序。
6、 DNA
山東榮成泥蚶
CGAGGTGGGTGAATTAATGTGAATTGGAGGACAGATTGAAGATCGATATCTTGAAGGCAC 60 ATTGCAGCTTCGGGTGACTCCCGGAGCAACGCCTGTCTGAGGGTGGGTTAAACAACCATG 120 GCAAAACGAATTGGTTTGCGCATAGAGGGTGTGGTGGTGTGGGG—GGGGTT---GTTTN 175 CGTCCGTAAAAAGGTCGGCCTAAGTATTTCGTGGAT—TCGGTGTGTGTTTTGTAGCAGT 233 GGGGATGTGCC—GGAGAGAGGTAGGTCG-GTGTATGTGGAGTCTTACGGTCTTTCGTGC 290 ATGCTCGCTTGGATGCTTGCGAAGAAATAGAGGATCAACAGCGATTACATCGGGAAANTA 350 AAAA-GTGGAAGAGGGGCTGGTCGTTTGT-GGAAAGGGGGGCACCGA--GACTTTATTTT 406 —TCTTGATCCGACGTGAGATCAGAGGAGATTAGGCGCTGAATTTAAGGATATGAGTAAG 464 CGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTGTCGTAGTAAGGG-------- 503
韓國釜山泥蚶
CCAGCTGGGTGAATTAATGTGAATTGCAGGACAGATTGAACATCGATATCTTGAAGGCAG 60
ATTGGAGGTTCGGGTCACTGGCGGAGCAAGGCCTGTCTGAGGGTCGGTTAAATAACCATC 120 GCAAAACGAATTGGTTTGCGCATAGAGGCTGTCGTGGTCTGGGG—CGGGA——CTTTG 174 GGCGCGTAAAAACGTCGCCCTAAGTATTTCGTCGAT—TCGGTGTGTGTTTTCTAGCAGT 232 GCCCATCTGGC--GGAGAGAGGTAGGTCG-GTGTATGTGGAGTCTTAGGCTGTTTCGTGC 289 ATGCTCGCTTGGATGCTTGCGAAGAAATAGGGGATCAACACCGATTACATCGGGCAAAAA 349 AAAA-GTGCGAGAGGGGCTCGTGGTTTGT-CGAGAGGGCGGCCCCGA-ACTTGTGATTTT 406 --TCTTGATCGGACGTGAGATCAGACGAGATTACGCGCTGAATTTAAGGATATCACTAAG 464 CGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCTCGTAGTAACGG------- 503
浙江樂清泥蚶
GGAGCTGCGTGAATTAATGTGAATTGCAGGACACATTGAACATCGATATCTTGAACGCAC 60 ATTGCAGGTTGGGGTCACTCCCGGAGGAAGGCCTGTCTGAGGGTGGGTTAAATAAGCATG 120 GGAAAAGGAATTGGTTTGGGCATAGAGGCTGTGGTGGTCTGGGG—GGGGA——GTTTC 174 CCGCCCTAAAAACGTCGCCCTAAGTATTTCGTGGAT--TCGGTGTCTGTTTTCTAGCAGT 232 GCCCATCTGGC--GGAGAGACGTAGGTCG-GTGTATGTCGAGTCTTACGCTCTTTCGTGG 289 ATGCTCGCTTGGATGGTTGCGAAGAAATAGGGGATCAAGACGGATTACATCGGGCAAAAA 349 AAAAAGTTGGAGAGGGGGTCGTCGTTTGT-CGAGACGGGGGGCCCGA-ACTTGTCATTTT 407 --TCTTCATGCGAGCTCAGATGAGAGGAGA丌ACGGGCTGAATTTAAGGATATCAGTAAG 465 CGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCTCGTAGTAACGG---------------------504
福建福鼎泥蚶
GGAGGTGGGTGAATTAATGTGAATTGCAGGAGACATTGAACATGGATATCTTGAACGCAC 60
ATTGGAGCTTGGGGTGAGTGCCGGAGCAAGGCGTGTGTGAGGGTCGGTTAAATAACCATG 120
GGAAAACGAATTGGTTTGCGCATAGAGGGTGTGGTGGTCTGGGGGGCGGGAGTTATTCCT 180
CCGGGTTAATTAGGTGGGCCTAAGTATTTGGTCGAT—TGGGTGTGTCTTTTCTAGCAGT 238
GGGGATCTGGG--GGAGAGACGTAGCTGG-GTGTATGTCGAGTCTTAGGGTGTTCGGTGC 295
ATGCTGGCTTGGATGGTTGCGAAGAAATAGGGGATCAACACGGATTAGATGGGGAAAAAA 355
--------CAAGAGGAGGTCGCCGTTTGT-GGAAAGGGCGGCCCCGAGAGTTGTGATTTT 406
CTTGGTCATCGGAGCTCAGATCAGACGAGATTACCGGCTGAATTTAAGCATATGACTAAG 466
CGGAGGAAAAGAAAGTAACCAGGATTGTCGTAGTAAGGG--------------------- 505
廣東湛江泥蚶
CCAGCTGCGTGAATTAATGTGAATTGCAGGAGACATTGAAGATCGATATCTTGAACGCAG 60
ATTGGAGCTTCGGGTCAGTCGGGGAGCAACGCCTGTCTGAGGGTCGGTTAAATAACGATG 120
GCAAAACGAATTCGTTTGCGCATAGAGGCTGTCGTGGTCTGGGNGGCGGGAGTTATTCCT 180
GCCCCTTAATTACGTCGCCCTAAGTATTTCGTCGAT—TCGGTGTCTCTTTTCTAGGAGT 238
GCGCATCTGCG—GGAGAGACGTAGGTCG-GTGTATGTCGAGTCTTACGGTGTTCCGTGC 295
ATGCTCGCTTGGATGCTTGCGAAGAAATAGGGGATCAAGACGGATTACATCGGGAAAAAA 355
A-------CAAGAGGAGCTCGGGGTTTGT-GGAAACGGGGGCNGCGACAGTTGTCATTTT 407
CTTCTTCATCCGACCTGAGATCAGAGGAGATTACGCGGTGAATTTAAGCATATCACTAAG 467
CGGAGGAAAAGAAAGTAAGCAGGATTCTGGTAGTAACGG--------------------- 50權利要求
1、一種不同海區(qū)泥蚶的指紋鑒別方法，其特征在于由所述的泥蚶的消化腺組織的特異性蛋白和由所述的泥蚶的特異性的DNA序列來鑒別。
2、 如權利要求l所述的一種不同海區(qū)泥蚶的指紋鑒別方法，其特征在于對所述的 特異性蛋白用下述步驟進行標定a、 取樣隨機取所述的泥蚶的消化腺組織并稱重；b、 提取酶液把所述的泥蚶的消化腺組織放入玻璃勻漿器中，然后加入重量是所述的泥蚶的消化腺組織的3倍的0.05%巰基乙醇水溶液，在冰浴條件下制成勻漿液；把 所述的勻漿液放入溫度為4'C的冷凍離心機中，用12000 rpm離心30 min，取得上清液， 即為酶液；c、 電泳在所述的酶液中加入適量的溴酚蘭指示劑，然后用濃度7 7.5%的聚丙 烯酰胺凝膠電泳，電泳時間為3h 5h;d、 顯色將所述的聚丙烯酰胺凝膠置于染色液中，放在37'C恒溫箱中，在所述的 聚丙烯酰胺凝膠上形成顯色的條帶，隨時觀察所述的條帶的顯色結果，至所述的條帶顯 色清晰為止，然后用7.5%的乙酸固定所述的條帶，即為酶帶。
3、 如權利要求2所述的一種不同海區(qū)泥蚶的指紋鑒別方法，其特征在于所述的特 異性蛋白為蘋果酸脫氫酶，所述的染色液由NAD+16mg、 NBT16mg、 PMS 1.5 mg、 pH 7.0 濃度為1M的蘋果酸鈉5ml、和pH 7.1濃度為0.5M的Tris-HCl溶液8ml混合配制，用 蒸餾水定容至50ml。
4、 如權利要求2所述的一種不同海區(qū)泥蚶的指紋鑒別方法，其特征在于所述的酶 特異性蛋白為超氧化物岐化酶，所述的染色液由NBT22mg、 VB20.005g、 Na4-EDTAi2 mg和pH8.0的0.05 M的Tris-HCl溶液8ml混合配制，用蒸餾水定容至50ml。
5、 如權利要求l所述的一種不同海區(qū)泥蚶的指紋鑒別方法，其特征在于對所述的 特異性的DNA序列用下述步驟進行標定e、 取樣從所述的泥蚶中摘取肌肉組織，剪碎所述的肌肉組織；f、 提取DNA:用常規(guī)方法從剪碎的所述的肌肉組織中提取DNA;g、 PCR反應擴增用特異性引物對提取的所述的DNA進行PCR反應擴增，得到 所述的PCR反應擴增的產(chǎn)物；h、 電泳用1。/。 1.5。/。的瓊酯糖凝膠對所述的PCR反應擴增的產(chǎn)物進行電泳10 20min，在所述的瓊酯糖凝膠中加入溴化乙錠，從所述的瓊酯糖凝膠中得到特異性譜帶;i、 測序在所述的特異性譜帶上測定所述的泥蚶的特異性的DNA序列。
6、如權利要求5所述的一種不同海區(qū)泥蚶的指紋鑒別方法，其特征在于所述的特異性引物為F: 5' -GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3'; R: 3' -GGGTCGATGAAGAACGCAG-5'。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種不同海區(qū)泥蚶的指紋鑒別方法，由泥蚶的消化腺組織的特異性蛋白和由泥蚶的特異性的DNA序列來鑒別，由于不同海區(qū)的泥蚶的消化腺組織內的特異性蛋白，SOD酶和MDH酶的酶帶各有異同，另外不同海區(qū)的泥蚶的特異性的DNA序列也各有其特異性，因此從泥蚶的消化腺組織的特異性蛋白和泥蚶的特異性的DNA序列就能鑒別泥蚶的產(chǎn)地，便于識別和養(yǎng)殖味美價高的泥蚶。
文檔編號G01N21/25GK101173892SQ20071006770
公開日2008年5月7日 申請日期2007年3月19日 優(yōu)先權日2007年3月19日
發(fā)明者李太武, 蘇秀榕 申請人:寧波大學