專利名稱：一種檢測禽流感病毒抗體的裝置及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽流感病毒抗體快速檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是基于抗原抗體反應(yīng) 檢測禽流感病毒抗體的電化學(xué)傳感器及檢測方法。
背景技術(shù)：
禽流感病毒(Avian Influenza virus, AIV)是源于禽類，能在極短的時間 內(nèi)造成大量禽畜死亡，并可致人類死亡的烈性傳染病毒。近幾年來，很多國家 和地區(qū)相繼爆發(fā)了高致病性禽流感，不但給相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也 嚴(yán)重威脅到人類健康與安全。在禽流感疫情檢測、患病診斷、宰前檢疫、免疫效果檢測中，禽流感病毒 抗體快速檢測是較為常用的方法之一 。目前，禽流感病毒抗體的檢測主要有以下方法血凝和血凝抑制試驗 (HA/HI)、瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(AGP)，免疫熒光技術(shù)(IFTr)，酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)，酶免疫測定(EIA)技術(shù)等。血凝和血凝抑制試驗操作過程繁瑣，易出現(xiàn)假陽性；瓊脂免疫擴(kuò)散試驗方法 取材方便，操作簡單，但檢測時間長，敏感度低；免疫熒光技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸 附試驗都需要特殊的儀器設(shè)備，檢測過程復(fù)雜、費用高、檢測時間長，并且易 出現(xiàn)假陽性。因此，建立一種準(zhǔn)確、靈敏、快速、特異性高且經(jīng)濟(jì)的檢測禽流感病毒抗 體的方法顯得尤為重要。在病毒抗體檢測領(lǐng)域中，免疫傳感器因其快速、簡便、靈敏受到越來越廣 泛的應(yīng)用。免疫傳感器是在傳感界面固定抗原或抗體，通過測量由抗原、抗體
特異性結(jié)合引起的物理、化學(xué)信號的變化，對樣品中抗原或抗體進(jìn)行定性或定 量判定。抗原-抗體結(jié)合前后可導(dǎo)致多種信號的改變，如重量、光學(xué)、熱學(xué)、電化學(xué) 等。電化學(xué)分析具有能現(xiàn)場檢測，不受樣品顏色、濁度的影響，樣品可以不經(jīng) 處理，無需分離，所用儀器設(shè)備相對簡單等優(yōu)點，使得電化學(xué)免疫傳感檢測成 為一種使用較為廣泛的檢測方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種準(zhǔn)確、快速、靈敏、特異性高且經(jīng)濟(jì)的檢測禽 流感病毒抗體的裝置及檢測方法。本發(fā)明的裝置是基于抗原抗體反應(yīng)檢測禽流感病毒抗體的電化學(xué)檢測裝 置，具有準(zhǔn)確、快速、靈敏、特異性高等優(yōu)點，并且價格低，適用于基層或現(xiàn)本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種檢測禽流感病毒抗體的裝置，包括免疫傳感器、酶標(biāo)二抗反應(yīng)體系、 電解池和數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)；免疫傳感器包括印刷在絕緣基板上的工作電極、 參比電極和輔助電極所構(gòu)成的電極系統(tǒng)；電解池包括檢測底液、攪拌器和溫控 器；數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)包括電化學(xué)工作站、計算機(jī)和軟件系統(tǒng)；免疫傳感器 通過導(dǎo)線與電化學(xué)工作站相連，其特征在于免疫傳感器的工作電極為碳電極， 其上涂布有包埋禽流感病毒抗原的金膠感應(yīng)膜。本發(fā)明裝置的免疫傳感器中，電極系統(tǒng)通過絲網(wǎng)印刷方法印在絕緣基板上， 輔助電極為石墨電極，參比電極為Ag/AgCl電極，工作電極以碳電極為支持電 極，其上涂布有包埋禽流感病毒抗原的金膠感應(yīng)膜。工作電極可以是多個，能 工作電極上包埋的禽流感病毒抗原可以是H5N1型禽流感病毒抗原或其它 禽流感病毒抗原。包埋禽流感病毒抗原的金膠感應(yīng)膜的膜材料可以是殼聚糖、醋酸纖維素、PVB、 Nafion、明膠或瓊脂糖中的一種或者它們的混合物。酶標(biāo)二抗可以是標(biāo)記辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氧酶、葡萄糖 氧化酶、青霉素?；富蚰蛩厮饷傅耐每闺uIgG抗體。本發(fā)明還包括一種使用上述裝置檢測禽流感病毒抗體的方法，包括以下步驟O 將待測樣本滴于本發(fā)明裝置的免疫傳感器工作電極表面，2(TC孵育10 分鐘；2) 將免疫傳感器置于酶標(biāo)二抗溶液中，3(TC孵育30分鐘；3) 將免疫傳感器置于電解池中，電解池的檢測底液為含有0.4 mmol/LH202的1 mmol/L硫堇(Thionine，俗稱勞氏紫)醋酸鹽緩沖液， PH值為7.0;4) 設(shè)定適宜的掃描參數(shù)，對工作電極施加電壓，檢測輔助電極與工作電 極間的電流值；5) 將上述測定獲得的電流信息輸入數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)；6) 處理信息結(jié)果輸出。檢測樣本為禽類血清。采集得到的血清樣本在2 'c 8 x:條件下保存不應(yīng)超過24小時；若需長期保存，應(yīng)在-70 'C條件下。并應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融(最多 凍融3次)。
本發(fā)明中檢測方法原理在電化學(xué)反應(yīng)體系中，酶催化底物H202生成相應(yīng) 的酶促反應(yīng)物H20，酶由還原態(tài)變?yōu)檠趸瘧B(tài)；此時氧化態(tài)的酶催化電子媒介體 硫堇由還原態(tài)變?yōu)檠趸瘧B(tài)，而酶自身則由氧化態(tài)變?yōu)檫€原態(tài)；氧化態(tài)的電子媒 介體在電極表面得到電子后又變?yōu)檫€原態(tài)，同時產(chǎn)生響應(yīng)電流。采用常用的循環(huán)伏安法(Cyclic voltammetry， CV)和差分脈沖法(differential pulse potentiometry, DPV)作為免疫傳感器表征和定性判定的方法。當(dāng)被檢測血清中含有禽流感病毒抗體時，抗體與固定在工作電極上、附著 于膠體金顆粒表面的禽流感病毒抗原發(fā)生反應(yīng)，生成抗原抗體復(fù)合物。酶標(biāo)二 抗隨后與病毒抗體結(jié)合；將免疫傳感器放置在電解池中時，酶標(biāo)二抗的酶能夠 催化硫堇和H202反應(yīng)，使還原電流較免疫反應(yīng)前增大。根據(jù)響應(yīng)電流曲線峰值 的變化即可判斷待測物是否含有禽流感病毒抗體。本發(fā)明中檢測禽流感病毒抗體的免疫傳感器，將免疫技術(shù)與電化學(xué)檢測相 結(jié)合，是一種電流型的酶免疫傳感器。它將酶的化學(xué)放大功能與免疫傳感器的 特異性相結(jié)合，融合二者的優(yōu)點，使其同時具備免疫反應(yīng)的特異性和電化學(xué)分 析的靈敏性，能準(zhǔn)確地進(jìn)行低含量物質(zhì)的檢測。本發(fā)明的檢測方法是一種新的快速檢測禽流感病毒抗體的方法，具有靈敏、 快速、特異性高等優(yōu)點，并且價格低，適用于基層和活體及現(xiàn)場檢測。為進(jìn)一步說明本發(fā)明特點和效果，以下結(jié)合附圖對發(fā)明作進(jìn)一步描述。


圖1是本發(fā)明裝置的免疫傳感器一種實施方式的正面示意圖；圖2是傳感器在不同階段于電解池檢測底液中的電流響應(yīng)曲線；其中，1——橡膠樹脂板；2——工作電極；3——輔助電極；4—一參比電 極。
具體實施方式
實施例l:本發(fā)明檢測禽流感病毒抗體的裝置，由免疫傳感器、酶標(biāo)二抗反 應(yīng)體系、電解池和數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)組成。免疫傳感器包括工作電極2、參比電極4和輔助電極3，各電極采用絲網(wǎng)印 刷方法印在橡膠樹脂板1上，輔助電極3為石墨電極，參比電極4為Ag/AgCl 電極，工作電極2以碳電極為支持電極，其上涂布有包埋H5N1型禽流感病毒 抗原的殼聚糖金膠膜；酶標(biāo)二抗反應(yīng)體系為標(biāo)記辣根過氧化物酶的兔抗雞IgG抗體稀釋液；電解池包括檢測底液、攪拌器和溫控器。檢測底液為含有0.4 mmol/LH202 的1 mmol/L硫堇醋酸鹽緩沖液，PH值為7.0;數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)包括電化學(xué)工作站、計算機(jī)和軟件系統(tǒng)。 免疫傳感器通過導(dǎo)線與電化學(xué)工作站相連，電化學(xué)工作站將電流信號傳送 至計算機(jī)。免疫傳感器的制備1) 采用絲網(wǎng)印刷在橡膠樹脂板1上印刷出如圖1所示的參比電極4、輔助電極3和工作電極2的支持電極。輔助電極為石墨電極，參比電極為Ag/AgCl 電極，工作電極的支持電極為碳電極。工作電極為4個，兩邊對稱排列；2) 制備殼聚糖金膠溶液在10 mL燒杯中加入3 mL 1%的殼聚糖溶液， 磁力攪拌下加入1 mL P/。四氯金酸(HAuC14)，加熱至70 °C，并保持恒溫2小 時。溶液顏色逐漸變?yōu)榫萍t色，制得殼聚糖金膠溶液。將殼聚糖金膠溶液在4 °C 下保存?zhèn)溆谩?) 將殼聚糖金膠溶液與H5N1型禽流感病毒抗原溶液充分混合；混合液4T放置12小時；取3pL混合液滴涂于工作電極2表面，并于室溫下放置3 4小時，使之干燥成膜；4) 將干燥后的免疫電極置于含0.2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中攪拌洗漆1小時，以封閉電極表面的非特異性吸附位點。制得的免疫電極于 4 。C， pH 7.4 PBS溶液中保存?zhèn)溆?。實施?:檢測禽流感病毒抗體的方法1) 樣本采集和處理取禽類血液，離心分離得血清，稀釋備用。2) 將待測樣本滴于本發(fā)明免疫傳感器的工作電極2表面，2(TC下孵育10分鐘，使樣本中的禽流感病毒抗體與免疫傳感器工作電極2上附著于膠體金顆 粒表面的病毒抗原產(chǎn)生抗原抗體特異性反應(yīng)。用PBS-T洗滌免疫傳感器三次， 再用二次蒸餾水清洗；3) 將免疫傳感器放入電解池，電解池的檢測底液為含有0.4 mmol/L H202 的1 mmol/L硫堇醋酸鹽緩沖液，PH值為7.0。4) 設(shè)定掃描速率為O.l V/s，對工作電極施加電壓，測得輔助電極與工作電 極間的電流值Ipl;測定完畢，取出免疫傳感器。5) 再將免疫傳感器置于標(biāo)記辣根過氧化物酶的兔抗雞IgG抗體溶液中，30 。C孵育30分鐘后，用PBS-T洗液洗滌免疫傳感器三次，再用二次蒸餾水清洗；6) 將免疫傳感器放入電解池，電解池的檢測底液為含有0.4 mmol/L H202 的1 mmol/L硫堇醋酸鹽緩沖液，PH值為7.0。7) 設(shè)定掃描速率為0.1 V/s，對工作電極施加電壓，測得輔助電極與工作電
極間的電流值Ip2;8) 將上述測定獲得的電流信息輸入數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)；采用常用的循環(huán) 伏安法和差分脈沖法作為免疫電極表征和定性判定的方法。9) 處理信息結(jié)果輸出。為了更好的說明檢測結(jié)果，將同一傳感器在不同階段置于電解池檢測底液 中(0.4 mmol/L H202 + 1.0 mmol/L硫堇+ 0.1 mol/L pH7.0醋酸緩沖溶液)檢測 響應(yīng)電流，以比較同一免疫傳感器在不同階段產(chǎn)生的響應(yīng)電流變化。如圖2所示，為本發(fā)明裝置的免疫傳感器在不同階段的電流響應(yīng)曲線圖。其中曲線a為裸絲網(wǎng)印刷電極在檢測底液中的電流響應(yīng)曲線。裸絲網(wǎng)印刷 電極出現(xiàn)的是一對穩(wěn)定的硫堇氧化還原峰。曲線b為免疫傳感器在檢測底液中的電流響應(yīng)曲線。其氧化還原峰信號有 所增強(qiáng)，可能由于鈉米金顆粒的信號放大作用所致。曲線c為經(jīng)過牛血清白蛋白封閉后的免疫傳感器在檢測底液中的電流響應(yīng) 曲線。曲線中的氧化還原峰幾乎沒有變化。曲線d為免疫傳感器與檢測樣本孵育后在檢測底液中的電流響應(yīng)曲線。曲 線中的氧化還原峰也幾乎沒有變化。曲線e為免疫傳感器與檢測樣本孵育后，又與酶標(biāo)二抗(辣根過氧化物酶 標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體)發(fā)生反應(yīng)的免疫傳感器在檢測底液中的電流響應(yīng)曲線。 可以看出，氧化還原峰電流明顯增強(qiáng)，表明免疫電極上的禽流感病毒抗原與檢 測樣本中的病毒抗體發(fā)生了特異性免疫反應(yīng)，生成抗原抗體復(fù)合物?？乖贵w 復(fù)合物進(jìn)一步結(jié)合標(biāo)記辣根過氧化物酶的兔抗雞IgG抗體；辣根過氧化物酶引 發(fā)電催化過程，催化硫堇和H2Cb反應(yīng)，使氧化還原峰電流明顯增大。
以K = (Ip2-Ipl) / Iplxl00% (即免疫傳感器與酶標(biāo)二抗反應(yīng)前后的催化電 流的增大率)作為判斷被測血清中是否含有禽流感抗體的依據(jù)。當(dāng)K》30。/。時為 陽性，表示被測樣本中含有AIV抗體；當(dāng)20%<K<30%為可疑樣品，需作進(jìn) 一步確證；當(dāng)K〈20。/。時為陰性，表示被測樣本中不含AIV抗體。本實施例中，K=(7.092uA—4.286 uA)/4.286uAxl00% =65.47%, >30%，表明 被測樣本中含有AIV抗體。當(dāng)然，本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，以上的實施例僅是用來 說明本發(fā)明，而并非作為對本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，對以 上所述實施例的變化、變型都將落在本發(fā)明權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測禽流感病毒抗體的裝置，包括免疫傳感器、酶標(biāo)二抗反應(yīng)體系、電解池和數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)；免疫傳感器包括印刷在絕緣基板上的工作電極、參比電極和輔助電極所構(gòu)成的電極系統(tǒng)；電解池包括檢測底液、攪拌器和溫控器；數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)包括電化學(xué)工作站、計算機(jī)和軟件系統(tǒng)；免疫傳感器通過導(dǎo)線與電化學(xué)工作站相連，其特征在于免疫傳感器的工作電極為碳電極，其上涂布有包埋禽流感病毒抗原的金膠感應(yīng)膜。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測禽流感病毒抗體的裝置，其特征在于所述的禽流 感抗原為H5N1型禽流感抗原。
3. 如權(quán)利要求1所述的檢測禽流感病毒抗體的裝置，其特征在于所述的酶標(biāo) 二抗為標(biāo)記辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氧酶、葡萄糖氧化酶、青霉 素酰化酶或尿素水解酶的兔抗雞IgG抗體。
4. 如權(quán)利要求1所述的檢測禽流感病毒抗體的裝置，其特征在于所述的包埋 禽流感抗原的膜材料為殼聚糖、醋酸纖維素、PVB、 Naficm、明膠或瓊脂糖中的 一種或者它們的混合物。
5. 如權(quán)利要求1所述的檢測禽流感病毒抗體的裝置，其特征在于所述的工作 電極為4~10個。
6. —種檢測禽流感病毒抗體的方法，包括以下步驟1) 待測樣本滴于如權(quán)利要求1所述免疫傳感器的工作電極表面，2(TC孵 育IO分鐘；2) 免疫傳感器置于酶標(biāo)二抗溶液中，3(TC孵育30分鐘；3) 免疫傳感器置于電解池中，電解池的檢測底液為含有0.4 mmol/LH202 的1 mmol/L硫堇醋酸鹽緩沖液，PH值為7.0;4) 設(shè)定適宜的掃描參數(shù)，對工作電極施加電壓，檢測輔助電極與工作電極間的電流值；5) 測定獲得的電流信息輸入數(shù)據(jù)釆集與處理系統(tǒng)；6) 信息處理結(jié)果輸出。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測禽流感病毒抗體的方法，其特征在于數(shù)據(jù)采集與 處理系統(tǒng)采用循環(huán)伏安法和差分脈沖法作為免疫電極表征和定性判定的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種準(zhǔn)確、快速、靈敏、特異性高且經(jīng)濟(jì)的檢測禽流感病毒抗體的裝置。本發(fā)明裝置包括免疫傳感器、酶標(biāo)二抗反應(yīng)體系、電解池和數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)；免疫傳感器包括印刷在絕緣基板上的工作電極、參比電極和輔助電極所構(gòu)成的電極系統(tǒng)；電解池包括檢測底液、攪拌器和溫控器；數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)包括電化學(xué)工作站、計算機(jī)和軟件系統(tǒng)；免疫傳感器通過導(dǎo)線與電化學(xué)工作站相連；免疫傳感器的工作電極為碳電極，其上涂布有包埋禽流感病毒抗原的金膠感應(yīng)膜。本發(fā)明還公開了一種使用該裝置檢測禽流感病毒抗體的方法。
文檔編號G01N33/569GK101149383SQ20071007154
公開日2008年3月26日 申請日期2007年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月30日
發(fā)明者吳淑春, 趙廣英 申請人:浙江工商大學(xué)