專利名稱：利用綠色熒光蛋白的腫瘤模型的制作方法
背景技術：
在文獻中已經(jīng)報道了利用腹膜(腹水)腫瘤生長來評估化學療法活性的幾個實例，包括利用LOX黑素瘤細胞的實例。例如，R.H.Shoemaker等，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.，26330(1985)報道LOX黑素瘤細胞可以形成腹水，并且通過使用第20天左右的存活終點，該模型可以用于評估癌癥治療。在2003年，H.Nakanishi等，Cancer Sci.，94112-118(2003)報道了利用胃癌細胞的腹膜模型，該胃癌細胞用GFP標記。該模型被用于研究腹膜細胞生長對抗癌劑的化學敏感性。通過從腹腔中回收GFP細胞、均化所述細胞、在10000g下離心細胞和然后使用熒光計數(shù)器測量上清液的熒光來測量腫瘤負荷。為了推斷產(chǎn)生熒光的細胞數(shù)量，使用用標準數(shù)目的GFP細胞的校準曲線。在該模型中，需要＞1月來在腹膜中產(chǎn)生腹水。
在文獻中已經(jīng)報道了利用轉(zhuǎn)移性腫瘤生長來評估化學療法的活性的幾個實例。LOX實驗轉(zhuǎn)移模型的報道如下O.Fodstad等，Int.J.Cancer，41442-449(1988)，R.H.Shoemaker等，1991，和M.Yeng等，Clin.CancerRes.，53549-3559，(1999)，具有GFP標記的細胞。
例如，F(xiàn)odstad等報道注射到無免疫應答的小鼠尾靜脈中的LOX細胞能夠以幾乎100％的頻率轉(zhuǎn)移到肺中。然而克隆的尺寸和數(shù)目在動物中彼此不同，因此作者發(fā)現(xiàn)不可能在注射的細胞數(shù)目和獲得的克隆數(shù)目之間建立準確關系。由于這個原因，他們使用動物存活作為終點而不對肺上的轉(zhuǎn)移克隆計數(shù)。
在R.H.Shoemaker等1991的報道中，通過16個循環(huán)的自發(fā)(sc)腫瘤移植，接著取出肺轉(zhuǎn)移用于體外生長，產(chǎn)生LOX-L細胞。不同于親代細胞系LOX，LOX-L細胞系能夠由sc腫瘤移植轉(zhuǎn)移到肺中，而LOX細胞僅能夠由靜脈內(nèi)(iv)移植轉(zhuǎn)移。將LOX-L sc腫瘤用于研究化學療法對轉(zhuǎn)移的影響，然而作者經(jīng)過非常費力的將轉(zhuǎn)移肺移植到新小鼠中的方法來評估肺轉(zhuǎn)移。在隨后研究(Wang X等，Int.J.Cancer，112994-1002，2004)中，將LOX-L模型iv植入，然而僅僅通過對克隆計數(shù)和利用存活終點來評估轉(zhuǎn)移。
在M.Yeng等，Clin.Cancer Res.，53549-4559(1999)的報道中，利用GFP標記的LOX或B16黑素瘤細胞建立轉(zhuǎn)移模型。對于LOX-GFP模型，將腫瘤同位移植(透皮)，而對于B16GFP模型，將細胞iv植入。將GFP用來鑒定肺轉(zhuǎn)移，然而作者未能定量肺轉(zhuǎn)移性腫瘤負荷，而是使用主觀(定性)終點。他們簡單地目測活體動物中的轉(zhuǎn)移，或者在尸體剖檢后通過使用熒光顯微鏡觀察來確定轉(zhuǎn)移的存在或不存在。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供一種評估腫瘤是否轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括將表達GFP的腫瘤細胞注射到無胸腺小鼠、如裸鼠或SCID小鼠中，接著處死所述小鼠和摘除待評估的一個或多個組織。將所述摘除的組織均化，和使用激光掃描熒光屏檢查(laser-scanning fluoroscopy)、例如Acumen Explorer，將所述均化組織的樣品中的GFP水平定量。
優(yōu)選地，將所述表達GFP的腫瘤細胞靜脈內(nèi)注射到無胸腺小鼠中。優(yōu)選地，所述無胸腺小鼠是裸鼠或SCID小鼠。
綠色熒光蛋白(GFP)是由軟珊瑚物種產(chǎn)生的熒光蛋白。GFP可以獲自各種各樣的不同來源，包括Renilla muelleri，Renilla reniformis，Renillakollikeri Aeruorea victoria。盡管任何GFP分子可以用于本發(fā)明，優(yōu)選的GFP是來自Renilla muelleri。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法中的腫瘤細胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或結(jié)腸直腸細胞。更優(yōu)選地，所述腫瘤細胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。最優(yōu)選地，所述腫瘤細胞是LOX細胞。
優(yōu)選的表達GFP的腫瘤細胞是LOX-GFP細胞。更優(yōu)選地，表達GFP的腫瘤細胞是LOX-GFP-LM細胞。
LOX-GFP細胞系是通過用如下所述的雙順反子GFP構(gòu)建體轉(zhuǎn)染獲自國立癌癥研究所(National Cancer Institute(NCI))的LOX黑素瘤細胞而產(chǎn)生的細胞系。
LOX-GFP-LM細胞系是通過用LOX-GFP細胞腹膜內(nèi)注射無胸腺小鼠、從所述小鼠中摘除含有LOX-GFP細胞的腹水、將所述腹水靜脈內(nèi)注射到小鼠、從所述小鼠收集獲得的轉(zhuǎn)移肺、和體外培養(yǎng)從所述轉(zhuǎn)移肺組織回收的表達GFP的腫瘤細胞的克隆而產(chǎn)生的細胞系。
人類黑素瘤細胞系LOX可以在將腫瘤細胞腹膜內(nèi)植入時誘導腹水，或者當靜脈內(nèi)接種時誘導肺轉(zhuǎn)移。該腹水模型可以用作快速的藥物篩選模型，而肺轉(zhuǎn)移模型可以用于評估抗轉(zhuǎn)移劑。在兩種模型中，由于評估腫瘤負荷的困難，腫瘤生長和功效的定量分析是個挑戰(zhàn)。為了解決該問題，本發(fā)明提供了用GFP轉(zhuǎn)染的LOX細胞(稱為LOX-GFP)，并且該標記被用于分析腹水或肺中的腫瘤負荷。
對于腹水模型，將10×106LOX-GFP細胞腹膜內(nèi)接種到Nu/Nu小鼠中，在7天后收獲腹水。在熒光顯微鏡下目測腹水，利用Acumen Explorer將相對熒光定量。使用細胞毒性試劑Taxol以及一些開發(fā)的化合物來驗證該模型中的抗增殖功效。
對于肺轉(zhuǎn)移模型，建立稱為LOX-GFP-LM的新細胞系；從通過靜脈內(nèi)接種LOX-GFP細胞誘導的小鼠肺轉(zhuǎn)移克隆中分離該細胞系。在IV接種2×106細胞后25-30天，LOX-GFP-LM細胞系可復制地建群。收獲肺，在熒光顯微鏡下觀測，利用Acumen Explorer評估均化肺懸浮液的相對熒光。在該模型中利用兩種開發(fā)化合物證實抗轉(zhuǎn)移功效，所述化合物先前證明在常規(guī)皮下異種移植研究中具有廣泛和有效的抗腫瘤活性。為了將兩種新細胞系(LOX-GFP和LOX-GFP-LM)與親代細胞系(LOX)比較，表征基因陣列分析和腫瘤組織病理學。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供將GFP應用于小鼠中的兩種人黑素瘤LOX模型，獲得更好的定量腫瘤負荷評估和改善的功效評價。這些改進的模型應當為新癌癥療法的腹水或?qū)嶒炥D(zhuǎn)移評估提供可行的備選方案。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述表達GFP的腫瘤細胞包含新霉素抗性基因。
表達GFP的腫瘤細胞可以如下制備a)制備包含編碼GFP蛋白的核酸的載體和b)用所述載體轉(zhuǎn)染所述腫瘤細胞。優(yōu)選地，所述載體另外包含用于G418選擇的新霉素抗性基因(Neo基因)。優(yōu)選的GFP是來自Renillamuelleri的GFP。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述載體是雙順反子GFP構(gòu)建體。雙順反子構(gòu)建體表示含有兩個插入到表達載體的基因的哺乳動物表達載體。雙順反子GFP構(gòu)建體是其中兩個基因之一編碼GFP分子的雙順反子構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述GFP是來自Renilla muelleri的GFP。優(yōu)選地，另一個基因編碼用于G418選擇的Neo(新霉素抗性基因)。優(yōu)選的哺乳動物表達載體是pCMV-tag 5A(Stratagene，Genbank登記號AF076312)。
從所述小鼠摘除的組織優(yōu)選是來自肺、肝、骨、骨髓、脾、淋巴結(jié)、腎、卵巢或腦的組織。更優(yōu)選地，所述摘除的組織是肺組織。
本發(fā)明還提供一種評估用于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的候選藥物或方案的方法，該方法包括用表達GFP的腫瘤細胞注射無胸腺小鼠和向所述小鼠施用候選藥物或方案。然后處死所述小鼠和摘除一個或多個組織用于評估轉(zhuǎn)移抑制。均化所述摘除的組織，使用激光掃描熒光屏檢查，將所述組織的均化樣品中的GFP水平定量。將所述GFP水平與來自對照動物的均化樣品中的GFP水平比較，所述對照動物沒有用所述候選藥物或方案處理。與對照樣品相比，在所述處理的樣品中降低的GFP水平表示轉(zhuǎn)移的抑制。優(yōu)選地，將所述表達GFP的腫瘤細胞靜脈內(nèi)注射到無胸腺小鼠中。
可以使用任何GFP。優(yōu)選地，使用來自Renilla muelleri的GFP。
優(yōu)選地，所述無胸腺小鼠是裸鼠或SCID小鼠。
從所述小鼠摘除的組織優(yōu)選是來自肺、肝、骨、骨髓、脾、淋巴結(jié)、腎、卵巢或腦的組織。更優(yōu)選地，所述摘除的組織是肺組織。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法中的腫瘤細胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或結(jié)腸直腸細胞。更優(yōu)選地，所述腫瘤細胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。最優(yōu)選地，所述腫瘤細胞是LOX細胞。
優(yōu)選的表達GFP的腫瘤細胞是LOX-GFP細胞。更優(yōu)選地，表達GFP的腫瘤細胞是LOX-GFP-LM細胞。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述表達GFP的腫瘤細胞包含新霉素抗性基因。
表達GFP的腫瘤細胞可以如下制備a)制備包含編碼GFP蛋白的核酸的載體和b)用所述載體轉(zhuǎn)染所述腫瘤細胞。優(yōu)選地，所述載體另外包含用于G418選擇的新霉素抗性基因(Neo基因)。優(yōu)選的GFP是來自Renillamuelleri的GFP。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述載體是雙順反子GFP構(gòu)建體。雙順反子構(gòu)建體表示含有兩個插入到表達載體的基因的哺乳動物表達載體。雙順反子GFP構(gòu)建體是其中兩個基因之一編碼GFP分子的雙順反子構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述GFP是來自Renilla muelleri的GFP。優(yōu)選地，另一個基因編碼用于G418選擇的Neo(新霉素抗性基因)。優(yōu)選的哺乳動物表達載體是pCMV-tag 5A(Stratagene，Genbank登記號AF076312)。
本發(fā)明進一步提供一種評估用于治療腫瘤的候選藥物或方案的方法，所述方法包括用表達GFP的腫瘤細胞腹膜內(nèi)注射無胸腺小鼠和向所述小鼠施用候選藥物或方案。摘除包含腫瘤的腹水或器官用于評估，使用激光掃描熒光屏檢查，將所述腹水或均化組織的樣品中的GFP水平定量。然后將所述腹水或均化樣品中的GFP水平與來自對照動物的GFP水平比較，所述對照動物沒有用所述候選藥物或方案處理。在所述處理的樣品中與對照樣品相比降低的GFP水平表示所述候選藥物或方案有效用于治療所述腫瘤。
可以使用任何GFP。優(yōu)選地，使用來自Renilla muelleri的GFP。
優(yōu)選地，所述無胸腺小鼠是裸鼠或SCID小鼠。
所述從小鼠摘除的組織優(yōu)選是腹水。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法中的腫瘤細胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或結(jié)腸直腸細胞。更優(yōu)選地，所述腫瘤細胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。最優(yōu)選地，所述腫瘤細胞是LOX細胞。
優(yōu)選的表達GFP的腫瘤細胞是LOX-GFP細胞。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述表達GFP的腫瘤細胞包含新霉素抗性基因。
表達GFP的腫瘤細胞可以如下制備a)制備包含編碼GFP蛋白的核酸的載體和b)用所述載體轉(zhuǎn)染所述腫瘤細胞。優(yōu)選地，所述載體另外包含用于G418選擇的新霉素抗性基因(Neo基因)。優(yōu)選的GFP蛋白是來自Renilla muelleri的GFP。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述載體是雙順反子GFP構(gòu)建體。雙順反子構(gòu)建體表示含有兩個插入到表達載體的基因的哺乳動物表達載體。雙順反子GFP構(gòu)建體是其中兩個基因之一編碼GFP分子的雙順反子構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述GFP是來自Renilla muelleri的GFP。優(yōu)選地，另一個基因編碼用于G418選擇的Neo(新霉素抗性基因)。優(yōu)選的哺乳動物表達載體是pCMV-tag 5A(Stratagene，Genbank登記號AF076312)。
本發(fā)明提供一種增加腫瘤細胞系轉(zhuǎn)移至特定組織的傾向的方法，該方法包括用表達GFP的腫瘤細胞腹膜內(nèi)注射無胸腺小鼠，摘除在所述小鼠中形成的腹水，將其靜脈內(nèi)注射到另一只無胸腺小鼠中。處死所述小鼠，摘除欲增加向其轉(zhuǎn)移的組織。然后從所述摘除的組織中回收表達GFP的腫瘤細胞，體外培養(yǎng)，并注射到無胸腺小鼠中，其中所述培養(yǎng)的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到回收所述細胞的所述組織中，其程度要大于原始的表達GFP的腫瘤細胞。
可以使用任何GFP。優(yōu)選地，使用來自Renilla muelleri的GFP。
優(yōu)選地，所述無胸腺小鼠是裸鼠或SCID小鼠。
從所述小鼠摘除的組織優(yōu)選是來自肺、肝、骨、骨髓、脾、淋巴結(jié)、腎、卵巢或腦的組織。更優(yōu)選地，所述摘除的組織是肺組織。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法中的腫瘤細胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或結(jié)腸直腸細胞。更優(yōu)選地，所述腫瘤細胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。最優(yōu)選地，所述腫瘤細胞是LOX細胞。
優(yōu)選的表達GFP的腫瘤細胞是LOX-GFP細胞。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述表達GFP的腫瘤細胞包含新霉素抗性基因。
表達GFP的腫瘤細胞可以如下制備a)制備包含編碼GFP蛋白的核酸的載體和b)用所述載體轉(zhuǎn)染所述腫瘤細胞。優(yōu)選地，所述載體另外包含用于G418選擇的新霉素抗性基因(Neo基因)。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述載體是雙順反子GFP構(gòu)建體。雙順反子構(gòu)建體表示含有兩個插入到表達載體的基因的哺乳動物表達載體。雙順反子GFP構(gòu)建體是其中兩個基因之一編碼GFP分子的雙順反子構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述GFP是來自Renilla muelleri的GFP。優(yōu)選地，另一個基因編碼用于G418選擇的Neo(新霉素抗性基因)。優(yōu)選的哺乳動物表達載體是pCMV-tag 5A(Stratagene，Genbank登記號AF076312)。
本發(fā)明另外提供LOX-GFP-LM細胞系，其轉(zhuǎn)移到肺的程度要大于親代LOX-GFP細胞系。該細胞系提供本文所述的測定中的優(yōu)勢。
本發(fā)明提供對先前使用的LOX腹膜(腹水)模型的幾個關鍵改進，獲得具有比先前使用的那些短得多的持續(xù)時間的模型。本模型允許快速定量作為終點的細胞數(shù)目。盡管先前研究的持續(xù)時間僅20天相當短，但是本模型不依賴于存活作為唯一終點，并且可以在少至7天內(nèi)完成。
本模型利用用GFP標記的細胞，然而腹水定量的方法已經(jīng)通過消除均化和離心步驟而加以改進。本發(fā)明的方法使用激光掃描熒光屏檢查，例如使用Acumen Explorer，直接測量來自腹水的細胞數(shù)目。
本發(fā)明通過將GFP穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到細胞中，以至可以摘除肺并且轉(zhuǎn)移性腫瘤負荷可以通過測量熒光而準確定量，提供了對先前描述的LOX實驗轉(zhuǎn)移模型的重大改進。該方法減小了對存活作為終點的依賴(盡管當科學相關時它可以有時被監(jiān)測)。本發(fā)明的模型利用實驗轉(zhuǎn)移模型，該模型使用LOX細胞的iv植入而不使用LOX-L細胞。另外，使用GFP-標記的細胞而不依賴于克隆計數(shù)和存活來定量轉(zhuǎn)移，因為那些方法不夠準確來鑒別轉(zhuǎn)移性腫瘤負荷的小差異。
在本發(fā)明的模型中，將轉(zhuǎn)移性腫瘤負荷定量以便準確評估使用各種治療方案的實驗療法的抗轉(zhuǎn)移能力。因此，省略了體內(nèi)顯現(xiàn)轉(zhuǎn)移的步驟而贊成摘除肺，均化它們，和測量來自賦形劑處理的小鼠對比治療劑處理的小鼠的肺的相對熒光。
一方面，本發(fā)明提供表達綠色熒光蛋白(GFP)的LOX黑素瘤細胞系的穩(wěn)定克隆和用于評估潛在臨床候選療法(即藥物和方案)的體內(nèi)抗腫瘤功效的測定。具體地，本發(fā)明提供兩種不同的體內(nèi)模型；1)用于快速篩選化合物的功效的短(7-10天)腹膜(腹水)模型，和2)用于評估新的癌療法的抗轉(zhuǎn)移能力的實驗轉(zhuǎn)移模型。
另一方面，本發(fā)明提供用于快速篩選潛在癌臨床候選療法的體內(nèi)抗腫瘤功效的腹膜(腹水)模型。該模型獨特之處在于它在少至7天內(nèi)提供功效數(shù)據(jù)和提供定量而非定性數(shù)據(jù)。
在還有另一方面，本發(fā)明提供用于評估潛在癌臨床候選療法的體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移功效的實驗轉(zhuǎn)移模型。該模型獨特之處在于它提供關于轉(zhuǎn)移性腫瘤負荷的定量數(shù)據(jù)而不依賴于存活作為唯一終點。
自發(fā)轉(zhuǎn)移模型是其中在動物中建立原發(fā)性腫瘤并且在無任何操作或干預的情況下允許生長和擴散到第二部位的模型。該方法要求來自原發(fā)性腫瘤的細胞通過它們天然能力獲得進入循環(huán)系統(tǒng)，然后在遠處部位接種和生長。
實驗轉(zhuǎn)移模型是其中沒有建立原發(fā)性腫瘤的模型。將細胞直接注射到小鼠的循環(huán)系統(tǒng)中以模擬轉(zhuǎn)移至遠處部位的接種和生長過程。
穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的腫瘤細胞例如可以以下列方式制備來自建立的腫瘤細胞系的腫瘤細胞可以以常規(guī)方式用雙順反子GFP構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。雙順反子GFP構(gòu)建體的制備在實施例1中描述。例如，F(xiàn)ugene，一種多組分、基于脂質(zhì)(非脂質(zhì)體)的轉(zhuǎn)染試劑(Roche Molecular Diagnostics)可以加入到無血清培養(yǎng)基如RPMI1640中，接著加入雙順反子GFP構(gòu)建體。盡管Fugene與構(gòu)建體的比率可以變化，該比率有利地為3∶1。例如在室溫下將樣品溫育約30分鐘的時間，將混合物轉(zhuǎn)移到腫瘤細胞燒瓶中。該腫瘤細胞以約80％的比例存在于培養(yǎng)物中。將該細胞溫育約6小時的時間，接著去除溫育培養(yǎng)基和加入含有1％遺傳霉素(G418)的選擇培養(yǎng)基。
對G418抗性的選擇將花費數(shù)周，例如3至6周，之后分選顯示最大GFP表達的那些細胞。然后將最高的5％表達GFP的細胞群體選擇、分離、培養(yǎng)和進一步分選而獲得具有100％GFP表達的細胞。
轉(zhuǎn)移至特定組織比相應的親代腫瘤細胞系更具侵略性的腫瘤細胞可以例如以下列方式制備用約10至20百萬表達GFP的腫瘤細胞各自優(yōu)選腹膜內(nèi)(ip)植入無胸腺小鼠。在約10至14天之后，從小鼠收獲含有表達GFP的腫瘤細胞的腹水液，并且用PBS稀釋腹水。將腹水/PBS溶液過濾通過40μm尼龍細胞濾網(wǎng)，并在約1500rpm下離心。將沉淀的細胞重懸浮在PBS中并計數(shù)以獲得所需細胞濃度。
然后用分離自腹水(以上)的表達GFP的腫瘤細胞靜脈內(nèi)(iv)、例如經(jīng)過尾靜脈植入無胸腺小鼠。優(yōu)選以約1×106細胞/小鼠和約2×106細胞/小鼠之間的濃度植入細胞。一旦小鼠垂死或死亡，將目標組織，例如肺或乳房組織分離和在熒光立體顯微鏡下檢查，以觀察可能的微轉(zhuǎn)移。
例如通過溫和解剖從組織回收表達GFP的腫瘤細胞的克隆，其顯示非常強的表達。然后將該克隆在無菌金屬紗網(wǎng)(No.40)上研磨，用2-3ml培養(yǎng)基洗滌，在約1500rpm下離心。然后可以將細胞沉淀在無血清培養(yǎng)基中洗滌，所述無血清培養(yǎng)基如RPMI1640培養(yǎng)基，其優(yōu)選含有約10％青霉素/鏈霉素和約10％胎牛血清(FBS)。將細胞接種到含有約10％FBS和約2％青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基的燒瓶中。將細胞在含有G418的選擇培養(yǎng)基中常規(guī)傳代以去除任何小鼠細胞污染物。在幾次、優(yōu)選2-3次傳代后，可以將培養(yǎng)物放大和冷凍下來以便將來使用。所述細胞將轉(zhuǎn)移到分離它們的組織，轉(zhuǎn)移程度要大于原始的表達GFP的腫瘤細胞。這種能力可以通過以下測定顯示。下文，這些將被稱為增強轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞(EMTC)。
用約1×106至約5×106EMTC在尾靜脈中iv植入無胸腺小鼠。在植入后約25-30天，評估垂死率或死亡率，將小鼠實施安樂死。分離期望細胞轉(zhuǎn)移到的組織和在PBS中均化。將一個樣品、例如0.1ml均化組織轉(zhuǎn)移到96孔平板并通過激光掃描熒光屏檢查、例如使用Acumen Explorer測量熒光。
通過上述方法制備和評估的細胞系對于評價候選療法、特別是臨床候選藥物和方案在治療癌癥和/或抑制轉(zhuǎn)移方面是有價值的。為了評估針對腫瘤的候選療法，將PBS中的表達GFP的腫瘤細胞腹膜內(nèi)(ip)注射到無胸腺小鼠中。優(yōu)選地注射在約500μl體積PBS中的約1千萬細胞。將小鼠分成對照和治療組，并且用候選藥物或方案處理治療組。應當理解，可以將表達GFP的腫瘤細胞首先注射到小鼠中，接著用候選藥物或方案處理，或者可以施用候選藥物或方案，接著用表達GFP的腫瘤細胞注射小鼠。
通過將小鼠實施安樂死和從腹腔中吸取腹水液來收獲腹水。用鹽水漂洗腹腔，然后將其回收。將腹水和回收的鹽水轉(zhuǎn)移到管中，過濾通過40μm尼龍濾器以獲得單細胞懸浮液，在約1500rpm下離心約10分鐘的時間。去除上清液，將細胞沉淀重懸浮在新鮮鹽水中。將來自每只小鼠的樣品，例如0.1ml，轉(zhuǎn)移至96孔平板以利用激光掃描熒光屏檢查、例如AcumenExplorer來評估細胞數(shù)目(報道為相對熒光單位)。如果處理的小鼠顯示比對照組較低的相對熒光，那么候選療法有效用于治療該類型的腫瘤。
為了在抑制轉(zhuǎn)移方面評估候選療法，將增強轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞保持在加有10％FBS和1％遺傳霉素(G418)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，經(jīng)由尾靜脈靜脈注射到無胸腺小鼠中。優(yōu)選地利用在約200μl體積的無血清RPMI1640中的約2百萬細胞。將小鼠隨機分成對照和治療組，治療組用候選藥物或方案處理。應當理解，EMTC可以首先注射到小鼠中，接著用候選藥物或方案處理，或者可以施用候選藥物或方案，接著用EMTC注射小鼠。當對照小鼠垂死或當它們死亡時，評估它們的轉(zhuǎn)移性腫瘤負荷。
除了存活，使用本發(fā)明通過測量組織勻漿的熒光強度可以進行抗轉(zhuǎn)移功效的定量評估。將活小鼠實施安樂死，摘除待評估的組織并在鹽水中均化。將來自每只小鼠的組織勻漿樣品，例如0.2ml，轉(zhuǎn)移到96孔平板，然后使用激光掃描熒光屏檢查、例如Acumen Explorer讀取熒光。使用該方法，可以測定與對照組相比的轉(zhuǎn)移的量。如果處理的小鼠顯示較低的轉(zhuǎn)移性腫瘤負荷，候選藥物抑制轉(zhuǎn)移。
現(xiàn)在已經(jīng)一般地描述了本發(fā)明，通過參考具體實施例結(jié)合下列附圖將更好地理解本發(fā)明，本文包括所述具體實施例僅僅是為了舉例說明而不是意欲是限制性的，除非另有說明。
附圖簡述

圖1圖解在SCID米色小鼠中LOX，LOX-GFP，和LOX-GFP-LM腫瘤的形態(tài)學。
圖2A至2M顯示從LOX，LOX-GFP，和LOX-GFP-LM細胞分離的Affymetrix微陣列數(shù)據(jù)，證明了這些細胞對所示基因的作用。
圖3顯示了關于在Acumen Explorer上運行的[4-氨基-2-(1-甲磺酰基-哌啶-4-基氨基)-嘧啶-5-基]-(2，3-二氟-6-甲氧基-苯基)-甲酮(化合物A)的腹水樣品的相對熒光單位(RFU)。
圖4描述了關于在Acumen Explorer上運行的4-[4，5-雙-(4-氯-苯基)-2-(2-異丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氫-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物B)和5-(4-乙氧基-喹啉-6-基meth-(Z)-ylidine)-2-(2-羥基-1-(R)-苯基-乙基氨基)-噻唑-4-酮(化合物C)的腹水樣品的相對熒光單位(RFU)。
圖5描述了關于在Acumen Explorer上運行的4-[(4S，5R)-4，5-雙-(4-氯-苯基)-2-(2-異丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氫-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物D)和Taxol與化合物D的組合的腹水樣品的相對熒光單位(RFU)。
圖6舉例說明了與賦形劑對照組相比，來自用[4-氨基-2-(1-甲磺?；?哌啶-4-基氨基)-嘧啶-5-基]-(2，3-二氟-6-甲氧基-苯基)-甲酮(化合物A)處理的Nu/Nu小鼠的腹水樣品的百分比熒光強度。
圖7舉例說明了與賦形劑對照組相比，來自用4-[4，5-雙-(4-氯-苯基)-2-(2-異丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氫-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物B)或5-(4-乙氧基-喹啉-6-基meth-(Z)-ylidine)-2-(2-羥基-1-(R)-苯基-乙基氨基)-噻唑-4-酮(化合物C)處理的Nu/Nu小鼠的腹水樣品的百分比熒光強度。
圖8舉例說明了與賦形劑對照組相比，來自用4-[(4S，5R)-4，5-雙-(4-氯-苯基)-2-(2-異丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氫-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物D)或Taxol與化合物D的組合處理的Nu/Nu小鼠的腹水樣品的百分比熒光強度。
圖9顯示用3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-氨基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮雜(化合物E)處理的小鼠的肺勻漿樣品孔的照片。在植入后第25天收獲肺(2×106細胞/小鼠iv)并均化和在Acumen Explorer上運行測定。
1賦形劑，2化合物E-5mg/kg，第-1-23天，7+/4-；3化合物E-5mg/kg，第-1-7天；4化合物E-5mg/kg，第3-23天，4+/3-圖10提供用4-[(4S，5R)-4，5-雙-(4-氯-苯基)-2-(2-異丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氫-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物D)處理的小鼠的肺勻漿樣品孔的照片。在植入后第26天收獲肺(2×106細胞/小鼠iv)并均化和在AcumenExplorer上運行測定。
1賦形劑；2化合物D-200mg/kg Bid，第1天至第21天；3化合物D-200mg/kg Bid，第-1天至第7天；4化合物D-200mg/kg Bid，第3天至第21天圖11描述了與賦形劑組相比，來自用3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-氨基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮雜(化合物E)處理的SCID米色小鼠的轉(zhuǎn)移肺組織的相對熒光單位(RFU)。
圖12描述了與賦形劑組相比，來自用4-[(4S，5R)-4，5-雙-(4-氯-苯基)-2-(2-異丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氫-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物D)處理的SCID米色小鼠的轉(zhuǎn)移肺組織的相對熒光單位(RFU)。
圖13提供了植入LOX-GFP-LM細胞的、用3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-氨基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮雜(化合物E)處理的SCID米色小鼠的Kaplan-Meier存活曲線。
1Cum.存活(賦形劑)，2Cum.存活(化合物E-5mg/kg，第-1-23天)；3Cum.存活(化合物E-5mg/kg，第-1-7天)；4Cum.存活(化合物E-5mg/kg，第3-23天)圖14提供了植入LOX-GFP-LM細胞的、用4-[(4S，5R)-4，5-雙-(4-氯-苯基)-2-(2-異丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氫-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物D)處理的SCID米色小鼠的Kaplan-Meier存活曲線。
1賦形劑；2化合物D-200mg/kg，po，bid，第-1天至第21天；3化合物D-200mg/kg，po，bid，第-1天至第7天；4化合物D-200mg/kg，po，bid，第3天至第21天圖15是含有GFP和Neo的pCMV-tag 5A質(zhì)粒的關鍵部分的簡單圖示。
圖16(a-i)描述了GFP表達載體的限制圖譜。序列從CMV-啟動子(核苷酸位點1-600)開始。GFP ORF位于位置670-1395之間，毗鄰SfiI位點。NotI-AscI接頭位于位置1400-1410，接著IRES-NEO-模塊。BstBI位點位于位置2910，接著HSV-TK poly A位點。
圖17提供小鼠的肺勻漿樣品孔的照片，所述小鼠注射有LOX-GFP或LOX-GFP-LM腫瘤系。在注射后第14，21，和28天收獲肺。
圖18顯示在SCID小鼠中LOX-GFP-LM和LOX-GFP-誘導的實驗肺轉(zhuǎn)移的比較。將樣品在96孔平板上用Acumen Explorer測量。
圖19提供SCID米色小鼠中LOX-GFP和LOX-GFP-LM腫瘤系兩者的Kaplan-Meier存活曲線。
具體實施例方式
實施例實施例1制備雙順反子GFP構(gòu)建體雙順反子GFP構(gòu)建體由Anne Chua和Ueli Gubler制備和提供，并且含有關于Renilla muelleri GFP(Prolume Ltd.，Pinetop，AZ)和用于G418選擇的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(新霉素抗性標記)兩者的基因。將R.mulleri GFP序列如下工程化到哺乳動物表達載體中。首先通過去除單一NotI和BstBI位點之間的序列片段來改變載體“pCMV-tag 5A”(Stratagene，Genbank登記號AF076312)。這留下了由ColE1復制起點、HSV-TK polyA序列和CMV啟動子組成的質(zhì)粒骨架。然后用編碼[IRES-新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶抗性標記]的片段替換缺失的片段。基于例如通過參考結(jié)合于此的Rees等，Biotechniques 20102，1996描述的原理將IRES-序列禁用。選擇禁用片段來表示細菌β-內(nèi)酰胺酶(“bla”)啟動子；該策略允許使用新霉素-磷酸轉(zhuǎn)移酶標記用于在大腸桿菌中進行質(zhì)粒選擇(卡那霉素)。在第三步中，將R.mulleriGFP的ORF插入兩個SfiI位點之間的IRES序列上游。位于NEO-抗性基因下游的HSV-TK序列用作用于在哺乳動物細胞中表達的polyA信號序列。該質(zhì)粒的關鍵部分的簡單示意圖在圖15中顯示。
實施例2制備雙順反子GFP構(gòu)建體使用特別設計的模塊載體，將R.mulleri GFP的序列改造用于在哺乳動物細胞中穩(wěn)定表達。該構(gòu)建體由Ann Chua和Ueli Gubler制備和提供，并且含有關于Renilla muelleri GFP(Prolume Ltd.，Pinetop，AZ)和用于G418選擇的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(新霉素抗性標記)兩者的基因。將R.mulleri GFP序列如下工程化到哺乳動物表達載體中。
步驟1首先通過去除單一NotI和BstBI位點之間的序列片段來改變載體“pCMV-tag 5A”(Stratagene，Genbank登記號AF076312)。這留下了由ColE1復制起點、HSV-TK polyA序列和CMV啟動子組成的質(zhì)粒骨架。
步驟2通過重疊序列-PCR，產(chǎn)生具有一般組成5’-AscI-IRES-新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶-BstB1-3’的模塊。在該模塊中，基于例如通過參考結(jié)合于此的Rees等，Biotechniques 20102，1996描述的原理將IRES-序列禁用。選擇禁用片段來表示細菌β-內(nèi)酰胺酶(“bla”)啟動子(Seq ID No.1)；該策略允許使用新霉素-磷酸轉(zhuǎn)移酶標記用于在大腸桿菌中(卡那霉素)以及在哺乳動物細胞中在G418中進行質(zhì)粒選擇。它消除了對用于在大腸桿菌進行質(zhì)粒選擇的額外轉(zhuǎn)錄單元的需要，使得最終質(zhì)粒較小。
步驟3將來自步驟1的質(zhì)粒-衍生的NotI/BstbI模塊和來自步驟2的AscI-IRES-Neo-BstbI模塊隨后通過加入合成的短AscI至NotI-接頭連接并環(huán)化。轉(zhuǎn)化DNA并檢查單一分離物的三個片段的正確組裝。選擇正確組裝的質(zhì)?？寺∮糜谧詈蟮男揎?。
步驟4將目的基因(GFP)的克隆位點隨后通過短的結(jié)構(gòu)為EcoRV-SfiIa-stuffer-SfiIb-NotI的合成接頭導入質(zhì)粒。經(jīng)過在OliI-NotI位點之間連接，將該接頭克隆到在步驟3中衍生的質(zhì)粒中，由此將它放置在IRES-NEO模塊的上游。OliI和EcoRV兩者都是平端切割酶，使得它們適合在不再產(chǎn)生位點的情況下連接。使用SfiI位點用于克隆目的基因之后的基本原理是雙重的SfiI是8-堿基切割酶并因此作為選擇用于在該載體中表達的ORF中的內(nèi)部位點極少出現(xiàn)。該位點具有識別序列ggccnnnnnggcc(Seq ID No.2)，允許在ORF的任何一端設計兩個不同位點用于定向克隆。選擇序列5’-ggccattatggcc-3’(Seq ID No.3)作為SfiI-a(上游)位點，而SfiI-b(下游)位點具有序列5’-ggccgcctcggcc-3’(Seq ID No.4)。
步驟5將改造為具有適當SfiI位點的R.mulleri GFP的ORF插入IRES序列上游兩個SfiI位點之間，獲得長度為4196bp的質(zhì)粒(Seq ID No.5)。在圖16中提供了關于GFP表達載體的限制圖譜。
實施例3確立LOX-GFP細胞細胞轉(zhuǎn)染將來自人黑素瘤細胞系LOX(國立癌癥研究所)的細胞培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)基中，RPMI1640培養(yǎng)基含有10％胎牛血清(FBS)。所有的培養(yǎng)基和相關試劑購自Gibco(Invitrogen Corporation，Carlsbad，California)。使用Fugene(Roche Molecular Diagnostics)轉(zhuǎn)染試劑以3∶1(Fugene∶DNA)的比率轉(zhuǎn)染細胞。該順反子GFP構(gòu)建體由Ann Chua和Ueli Gubler友好地按照實施例1制備和提供。該構(gòu)建體含有關于Renilla muelleri GFP(Prolume Ltd.，Pinetop，AZ)和用于G418選擇的Neo(新霉素抗性基因)兩者的基因。
將100μl不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基加入無菌小管，然后加入9μl預溫熱的Fugene。最后，將3μl GFP DNA構(gòu)建體加入管底部，混和，室溫下溫育30分鐘。將整個Fugene/DNA混合物加入80％匯合LOX細胞的一個T-25燒瓶中，將細胞溫育6小時。在溫育后，將燒瓶中的培養(yǎng)基去除并用含有1％遺傳霉素(G418)的選擇培養(yǎng)基替換。
G418抗性選擇花費約4周，之后約30％的細胞以不同水平表達GFP。為了進一步選擇GFP表達最高的細胞，將細胞在Department of Pathologyand Pediatrics，UMDNJ進行分選。分選細胞，收集最高5％表達GFP的細胞群體。從第一次分選分離細胞并培養(yǎng)，數(shù)周后接著分選，以便獲得的細胞獲得100％GFP表達。然后將這些LOX-GFP細胞冷凍用于將來體內(nèi)使用。
實施例4確立LOX-GFP-LM細胞將五只雌性Nu/Nu小鼠(Charles River)各自腹膜內(nèi)(ip)植入1千萬LOX-GFP細胞。在13天后，從小鼠中收獲含有LOX-GFP細胞的腹水液，用PBS 1∶4稀釋腹水。然后將腹水/PBS溶液過濾通過40μm尼龍細胞濾網(wǎng)并在1500rpm下離心。將沉淀的細胞重懸浮在PBS中并計數(shù)獲得所需的細胞濃度。
將20只雌性Nu/Nu小鼠(10只小鼠/組)通過尾靜脈靜脈內(nèi)(iv)以2×106細胞/小鼠或1×106細胞/小鼠植入分離自腹水(以上)的LOX-GFP腫瘤細胞。在發(fā)現(xiàn)組中的一些小鼠垂死或死亡后，將組中剩余的小鼠實施安樂死。將肺分離和在熒光立體顯微鏡下檢查以發(fā)現(xiàn)可能的微轉(zhuǎn)移。獲得的ivLOX-GFP肺轉(zhuǎn)移在表1中列出。
表1.LOX-GFP腹水移植到Nu/Nu小鼠中。

似乎轉(zhuǎn)移到肺中的比率沒有文獻中報道的高，這可能導致定量分析困難。一些轉(zhuǎn)移克隆失去了GFP表達，提示細胞系在體內(nèi)不穩(wěn)定。來自1×106細胞組的一只小鼠(No.10)在肺轉(zhuǎn)移克隆中具有極強的GFP表達。
通過輕微解剖，從No.10小鼠的肺中回收LOX-GFP細胞(約2×3mm)的四個克隆。每個克隆分別在無菌金屬濾網(wǎng)(No.40)上研磨，用2-3ml培養(yǎng)基洗滌并在1500rpm下離心。將細胞沉淀在含有10％青霉素/鏈霉素和10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中洗滌并接種到含有10ml含有10％FBS和2％青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基的T-25燒瓶中。將細胞在含有G418的選擇培養(yǎng)基中常規(guī)傳代，以去除任何小鼠細胞污染物。在2-3次傳代后，由于弱GFP表達和差的生長，丟棄來自1和2號克隆的培養(yǎng)物。將來自3和4號克隆的培養(yǎng)物放大并冷凍備將來使用。來自4號克隆的細胞被認為在GFP和生長方面優(yōu)秀并命名為LOX-GFP-LM(LM表示肺轉(zhuǎn)移)。
實施例5LOX-GFP-LM細胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移將30只雌性SCID米色小鼠(Charles River)iv植入1、2或5百萬LOX-GFP-LM細胞到尾靜脈中。在植入后第29天，記錄到達那點的每組的垂死率或死亡率，將其余小鼠實施安樂死。分離肺并且每個樣品在3mlPBS中均化。將0.1ml/樣品的肺勻漿轉(zhuǎn)移到96孔平板中并且使用AcumenExplorer測量熒光。在植入后29天后，發(fā)病或死亡的發(fā)生率與植入的細胞數(shù)目直接相關，在植入5百萬細胞的小鼠中觀察到最高的發(fā)病率和死亡率(表2)。所有小鼠具有GFP表達肺轉(zhuǎn)移克隆，然而肺轉(zhuǎn)移的數(shù)目和密度變化很大。
表2在SCID米色小鼠中LOX-GFP-LM誘導的實驗肺轉(zhuǎn)移。

實施例6表征LOX-GFP-LM，LOX-GFP，和LOX細胞LOX，LOX-GFP，和LOX-GFP-LM腫瘤體內(nèi)形態(tài)學將9只雌性SCID米色小鼠(Charles River)皮下(sc)植入LOX或LOX-GFP細胞，或者iv植入LOX-GFP-LM細胞。使得LOX和LOX-GFP腫瘤生長直至它們達到～300-400mm3的體積(植入后約10-14天)，然后收集并固定在10％福爾馬林中。使得LOX-GFP-LM細胞在29天內(nèi)發(fā)展肺轉(zhuǎn)移，然后收集肺部分并固定在10％福爾馬林中。將腫瘤和肺樣品用H&E染色并評估形態(tài)學。在來自三種不同LOX腫瘤細胞系(LOX，LOX-GFP和LOX-GFP-LM)的腫瘤之間在形態(tài)學方面沒有觀察到差異(圖1)。
實施例7LOX，LOX-GFP，和LOX-GFP-LM細胞系的基因微陣列分析將細胞鋪平板在具有RPMI-1640，10％FBS和1％青霉素/鏈霉素(對于LOX-GFP和LOX-GFP-LM細胞加上0.5％G418)的6孔培養(yǎng)板中并溫育48小時。在去除培養(yǎng)基后，用PBS洗滌細胞一次，每孔加入0.8ml的RLT緩沖液，室溫下振蕩平板2分鐘。將來自每孔的細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到分開的管中并在-80℃下冷凍用于將來微陣列分析。來自每個腫瘤系的四個分開樣品在微陣列中使用Affymetrix U133plus2芯片運行。對于LOX-GFP和LOX-GFP-LM細胞兩者顯示與LOX親代細胞系相比較的獨特基因標記。(圖2)在LOX-GFP-LM細胞中，發(fā)現(xiàn)124個基因完全改變，與LOX-GFP細胞相比，67個基因上調(diào)和其余57個基因下調(diào)。在至少4倍上調(diào)的基因之中，一系列基因(至少7個基因，以粗體標記)被認為與黏著，基質(zhì)降解或血管發(fā)生相關。另一類基因(下劃線標記)被認為與生長因子或分化相關。兩個系列的基因都包含可能期望在具有更大侵略性和侵襲性表型的細胞群體中富含的基因類型。
實施例8LOX-GFP腹膜(腹水)模型將按照實施例3的方法制備的人黑素瘤LOX-GFP細胞保持在RPMI1640培養(yǎng)基加10％FBS和1％遺傳霉素(G418)中。將雌性Nu/Nu小鼠腹膜內(nèi)(ip)注射在500μl PBS體積中的1千萬LOX-GFP細胞，隨機分為多組，如表3、4和5所示用各種劑量和/或劑量給藥方案處理。
測試的化合物
表3.關于LOX-GFP腹水模型的治療組。

表4.關于LOX-GFP腹水模型的治療組。

表5.關于LOX-GFP腹水模型的治療組。

腹水收獲方法(在植入后第7天或第8天)將小鼠實施安樂死，然后沿著腹部中線透過皮膚和腹膜做一個小切口。利用玻璃巴斯德管從腹膜中吸取和取出腹水液，將腹水轉(zhuǎn)移到15ml管中。使用3ml鹽水漂洗腹腔，回收所有鹽水和轉(zhuǎn)移到含有腹水液的15ml管中。將腹水細胞懸浮液過濾通過40μm尼龍濾器以獲得單細胞懸浮液，并在1500rpm下離心10分鐘。去除上清液，將細胞沉淀重懸浮在2ml新鮮鹽水中。將來自每個樣品的0.1ml轉(zhuǎn)移到96孔平板，利用AcumenExplorer評估細胞數(shù)目(報道為相對熒光單位)。
結(jié)果7或8天是在ip植入LOX-GFP細胞的小鼠中形成充足腹水的足夠持續(xù)時間，并且另外足以測量系統(tǒng)施用的癌癥療法的生長抑制性質(zhì)。Taxol和化合物A都顯示對LOX-GFP腹水生長的抑制效果，所述LOX-GFP腹水生長直接依賴于治療的數(shù)目。單一劑量沒有抑制細胞生長，而兩個劑量減少細胞生長，三個劑量最大地減少細胞生長(圖3和6)?；衔顱和化合物C顯示對LOX-GFP腹水生長的抑制作用(圖4和7)?；衔顳在幾個劑量下抑制LOX-GFP腹水生長，然而效果并不是依賴于劑量的。關于腹水生長抑制，相比于單獨Taxol，將化合物D和Taxol組合并沒有附加益處，然而組合并不是有對抗作用的。(圖5和8)。
實施例9LOX-GFP-LM轉(zhuǎn)移模型將按照實施例4的方法制備的人黑素瘤LOX-GFP-LM細胞保持在RPMI 1640培養(yǎng)基加上10％FBS和1％遺傳霉素(G418)中。將雌性SCID米色小鼠經(jīng)由尾靜脈iv注射在200μl體積的無血清RPMI1640中的2百萬細胞，隨機分成多組，并且如表6和7所示用各種劑量和/或劑量方案處理。當發(fā)現(xiàn)在賦形劑處理組中＞3只小鼠垂死時，每個治療組取出5只小鼠評估轉(zhuǎn)移肺腫瘤負荷。監(jiān)視每個組的其余小鼠的存活益處直至它們垂死。
測試的化合物

表6.關于LOX-GFP-LM實驗轉(zhuǎn)移模型的治療組(化合物E研究)

表7.關于LOX-GFP-LM實驗轉(zhuǎn)移模型的治療組(化合物D研究)

對于抗轉(zhuǎn)移功效的定量評估，評價兩個參數(shù)1)肺勻漿的熒光強度和2)存活。
肺勻漿的熒光強度在第25或26天從研究中取出每個治療組5只小鼠用于評估肺轉(zhuǎn)移性腫瘤負荷。將小鼠實施安樂死，摘除肺，放置在3ml鹽水中，并勻化。將0.2ml肺勻漿轉(zhuǎn)移到96孔平板，使用Acumen Explorer讀取熒光。(圖9和10)。熒光報道為相對熒光單位(RFU)。(表8和9，圖11和12)。通過Student-檢驗或Mann-Whitney U檢驗確定統(tǒng)計學分析，當概率值(p)≤0.05時，組之間的統(tǒng)計學差異被認為是顯著的。
表8.在Acumen Explorer上運行的肺勻漿樣品的相對熒光單位(RFU)(化合物E研究)

*TGI＝相對于賦形劑對照組的腫瘤生長抑制。
表9.在Acumen Explorer上運行的肺勻漿樣品的相對熒光單位(RFU)(化合物D研究)


*TGI＝相對于賦形劑對照組的腫瘤生長抑制。
存活存活表示由于肺轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移到其它器官導致的總的轉(zhuǎn)移狀態(tài)。將由于呼吸困難或下肢麻痹導致的垂死監(jiān)視和記錄為存活的替代終點。對于存活評估，將結(jié)果繪制為相對于在腫瘤植入后天數(shù)的百分比存活。將增加的壽命-時期(％ILS)計算為ILS％＝100×[(治療組的中值存活日-對照組的中值存活日)/對照組的中值存活日]。利用Kaplan Meier存活分析來測定中值存活或(50％存活時間)。(圖13和14)。通過log-秩檢驗分析存活的差異。當概率值(p)≤0.05時，組之間的統(tǒng)計學差異被認為是顯著的。類似于實施例5中LOX-GFP-LM轉(zhuǎn)移模型的初始表征，當iv注射時在100％的小鼠中細胞轉(zhuǎn)移到肺中，并且觀察肺轉(zhuǎn)移的時間范圍也是類似的(在先前研究中40％存活@29天對比在本發(fā)明兩個研究中50％存活@24或28天)。(表10和11；圖13和14)如通過肺勻漿的熒光強度評估，化合物E的晚期干預(第3至第23天劑量給藥)或全長干預(第-1至第23天)具有相當?shù)目罐D(zhuǎn)移活性。
如通過肺勻漿的熒光強度評估，與賦形劑相比，化合物D的晚期干預(第3至第23天劑量給藥)具有優(yōu)秀的抗轉(zhuǎn)移活性。
表10.與賦形劑對照組相比，使用化合物E治療的組的存活。

表11.與賦形劑對照組相比，用化合物D處理的組的存活。

實施例10在實驗肺轉(zhuǎn)移上LOX-GFP-LM和LOX-GFP的比較將先前產(chǎn)生的人黑素瘤LOX-GFP和LOX-GFP-LM細胞保持在RPMI1640培養(yǎng)基加上10％FBS和1％遺傳霉素(G418)中。將雌性SCID米色小鼠(每種腫瘤細胞系25只小鼠)經(jīng)由尾靜脈iv注射在200μl體積的無血清RPMI1640中的2百萬細胞，LOX-GFP或LOX-GFP-LM。對于每個時間點(植入后第14，21和28天，總共15只小鼠，參見表12)，從5只小鼠收獲肺。其余小鼠，每組10只小鼠，監(jiān)視存活益處直至它們垂死。評價兩個參數(shù)用于定量評估腫瘤生長1)肺勻漿的熒光強度和2)存活。
表12將LOX-GFP和LOX-GFP-LM植入SCID米色小鼠

肺勻漿的熒光強度從每組中取出五只(5)小鼠用于評估肺轉(zhuǎn)移性腫瘤負荷。將小鼠實施安樂死，摘除它們的肺，放置在3ml鹽水中并均化。將肺勻漿，0.2ml，轉(zhuǎn)移到96孔平板中，使用Acumen Explorer讀取熒光。(圖17)。將熒光報道為相對熒光單位(RFU)。(圖18和表13)。通過Student-檢驗或Mann-Whitney U檢驗確定統(tǒng)計學分析，當概率值(p)≤0.05時，組之間的統(tǒng)計學差異被認為是顯著的。
表13.腫瘤系(LOX-GFP-LM和LOX-GFP誘導的實驗性轉(zhuǎn)移的總結(jié)表


存活評估對于存活評估，將由于呼吸困難或下肢麻痹導致的垂死小鼠作為終點記錄，并且將結(jié)果繪制為相對于在腫瘤植入后天數(shù)的百分比存活。利用Kaplan Meier存活分析來測定中值存活。通過log-秩檢驗分析存活曲線的差異，當概率值(p)≤0.05時，組之間的統(tǒng)計學差異被認為是顯著的。(圖19)結(jié)果和討論注射LOX-GFP-LM的SCID米色小鼠，與用LOX-GFP注射的小鼠的相同品系(SCID米色)相比，在第21天顯示高得多的肺轉(zhuǎn)移率(100％)和較短的存活時間(所有小鼠在25天內(nèi)死亡)，體內(nèi)GFP轉(zhuǎn)染穩(wěn)定(100％)。在LOX-GFP組中，在第21天，發(fā)現(xiàn)五只小鼠中的兩個具有肺轉(zhuǎn)移而不顯示GFP信號，提示較低的轉(zhuǎn)移率和體內(nèi)不穩(wěn)定的GFP轉(zhuǎn)染。在LOX-GFP組中50％存活時間比LOX-GFP-LM組延遲6天(31天對25天)。
兩個組在第14天都沒有顯示任何肺轉(zhuǎn)移。然而，在LOX-GFP-LM組中，從第21天至第25天，小鼠或者顯示強烈的肺轉(zhuǎn)移或者是垂死的。對于LOX-GFP組，從第26天至第39天小鼠死亡或者垂死。似乎在肺中腫瘤負荷方面沒有平臺時期；換句話說，當肺發(fā)展廣泛的肺轉(zhuǎn)移時，小鼠將在短時期內(nèi)立即變得垂死或死亡。
結(jié)論相比于相同品系小鼠中的LOX-GFP，LOX-GFP-LM導致更多的具有穩(wěn)定GFP信號的肺轉(zhuǎn)移。兩種腫瘤系都顯示隨時間的在肺中的動態(tài)的腫瘤負荷生長。
序列表<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司<120>利用綠色熒光蛋白的腫瘤模型<130>23693<140>
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<150>US 60/788,250<151>2006-03-31<160>5<170>PatentIn Ver.3.3<210>1<211>67<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>1ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata taggaggtat 60aaccatg 67<210>2<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的寡核苷酸<220>
<221>修飾的_堿基<222>(5)..(9)<223>a，c，g，t，未知或其它<400>2ggccnnnnng gcc13<210>3<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>3ggccattatg gcc13<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>4ggccgcctcg gcc13<210>5<211>4196<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成的核苷酸構(gòu)建體<400>5atgcattagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 60gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 120cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 180acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 240tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 300ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 360tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 420acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 480tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 540gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccgcta 600gcgattacgc caagctcgaa attaaccctc actaaaggga acaaaagctg gagctccaca 660tcggccatta tggccgagca agcagatcct gaagaacacc tgcctgcagg aggtgatgag 720ctacaaggtg aacctggagg gcatcgttaa caaccacgtg ttcaccatgg agggctgcgg 780caagggcaac atcctgttcg gcaaccaatt ggtgcagatc cgcgtgacca agggcgcccc 840cctgcccttc gccttcgaca tcgtgagccc cgccttccag tacggcaacc gtacgttcac 900caagtacccc aacgacatca gcgactactt catccagagc ttccccgccg gcttcatgta 960cgagcgcacc ctgcgctacg aggacggcgg cctggtggag atccgcagcg acatcaacct 1020gatcgaggac aagttcgtgt accgcgtgga gtacaagggc agcaacttcc ccgacgacgg 1080gcccgtgatg cagaagacca tcctgggcat cgagcccagc ttcgaggcca tgtacatgaa 1140caacggcgtg ctggtgggcg aggtgatcct ggtgtacaag cttaacagcg gcaagtacta 1200cagctgccac atgaagaccc tgatgaagag caagggcgtg gtgaaggagt tccccagcta 1260ccacttcatc cagcaccgcc tcgagaagac ctacgtggag gacggcggct tcgtggagca 1320gcacgagacc gccatcgccc agatgaccag catcggcaag cccctgggat ccctgcacga 1380gtgggtgtag gccgcctcgg ccgcggccgc atatggcgcg ccgtcgagca tgcatctagg 1440gcggccaatt ccgcccctct ccctcccccc cccctaacgt tactggccga agccgcttgg 1500aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt gattttccac catattgccg tcttttggca 1560atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc 1620ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag 1680cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg 1740gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac 1800aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa 1860gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc 1920tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc 1980ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatat ggccacaacc 2040ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aatattgata taggaggtat 2100aaatatggga tcggccattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt 2160ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt 2220gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc 2280cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc 2340ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga 2400agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat 2460ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca 2520agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga 2580tgatctggac gaagaacatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc 2640gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat 2700catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga 2760ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagaacttg gcggcgaatg 2820ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt 2880ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgatt cgaagaccga ccaagcgacg cccaacctgc 2940catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt 3000tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc 3060accctagggg gaggctaact gaaacacgga aggagacaat accggaagga acccgcgcta 3120tgacggcaat aaaaagacag aataaaacgc acggtgttgg gtcgtttgtt cataaacgcg 3180gggttcggtc ccagggctgg cactctgtcg ataccccacc gagaccccat tggggccaat 3240acgcccgcgt ttcttccttt tccccacccc accccccaag ttcgggtgaa ggcccagggc 3300tcgcagccaa cgtcggggcg gcaggccctg ccatagcctc aggttactca tatatacttt 3360agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 3420atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 3480aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 3540caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 3600ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 3660cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 3720tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 3780gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 3840ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 3900gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 3960caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 4020ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 4080tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 4140ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcc 419權(quán)利要求
1.一種評估腫瘤是否轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括(a)將表達GFP的腫瘤細胞注射到無胸腺小鼠中；(b)處死所述小鼠，(c)摘除待評估的一個或多個組織，(d)將所述摘除的組織均化，和(e)使用激光掃描熒光屏檢查，將所述均化組織的樣品中的GFP水平定量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤細胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或結(jié)腸直腸細胞。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述腫瘤細胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述腫瘤細胞是LOX細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任何一項的方法，其中所述小鼠是裸鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任何一項的方法，其中所述小鼠是SCID小鼠。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項的方法，其中所述摘除的組織是肺、肝、骨、骨髓、脾、淋巴結(jié)、腎、卵巢或腦。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述摘除的組織是肺組織。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任何一項的方法，其中所述表達GFP的腫瘤細胞包含新霉素抗性基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任何一項的方法，其中所述表達GFP的腫瘤細胞是如下制備的(a)制備包含編碼GFP蛋白的核酸的載體；(b)用所述載體轉(zhuǎn)染所述腫瘤細胞。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述載體另外包含用于G418選擇的新霉素抗性基因(Neo基因)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項的方法，其中所述GFP是來自Renillamuelleri。
13.一種評估用于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的候選藥物或方案的方法，該方法包括(a)用表達GFP的腫瘤細胞注射無胸腺小鼠；(b)向所述小鼠施用候選藥物或方案；(c)處死所述小鼠；(d)摘除一個或多個組織用于評估轉(zhuǎn)移抑制；(e)均化所述組織；(f)使用激光掃描熒光屏檢查，將所述組織的均化樣品中的GFP水平定量；和(g)將所述均化樣品中的GFP水平與來自對照動物的GFP水平比較，所述對照動物沒有用所述候選藥物或方案處理；其中在所述處理的樣品中降低的GFP水平表示轉(zhuǎn)移的抑制。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述腫瘤細胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或結(jié)腸直腸細胞。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述腫瘤細胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述腫瘤細胞是LOX細胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16中任何一項的方法，其中所述小鼠是裸鼠。
18.根據(jù)權(quán)利要求13至16中任何一項的方法，其中所述小鼠是SCID小鼠。
19.根據(jù)權(quán)利要求13至18中任何一項的方法，其中所述摘除的組織是肺、肝、骨、骨髓、脾、淋巴結(jié)、腎、卵巢或腦。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述摘除的組織是肺組織。
21.根據(jù)權(quán)利要求13至20中任何一項的方法，其中所述表達GFP的腫瘤細胞包含新霉素抗性基因。
22.根據(jù)權(quán)利要求13至21中任何一項的方法，其中所述表達GFP的腫瘤細胞是如下制備的(a)制備包含編碼GFP蛋白的核酸的載體；(b)用所述載體轉(zhuǎn)染所述腫瘤細胞。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述載體另外包含用于G418選擇的Neo基因。
24.根據(jù)權(quán)利要求13至23中任何一項的方法，其中所述GFP是來自Renillamuelleri。
25.一種評估用于治療腫瘤的候選藥物或方案的方法，所述方法包括(a)用表達GFP的腫瘤細胞腹膜內(nèi)注射無胸腺小鼠；(b)向所述小鼠施用候選藥物或方案；(c)摘除包含腫瘤的腹水或器官用于評估；(f)使用激光掃描熒光屏檢查，將所述腹水或均化組織的樣品中的GFP水平定量；(g)將所述腹水或均化樣品中的GFP水平與來自對照動物的GFP水平比較，所述對照動物沒有用所述候選藥物或方案處理；其中在所述處理的樣品中降低的GFP水平表示所述候選藥物或方案有效用于治療所述腫瘤。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述腫瘤細胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或結(jié)腸直腸細胞。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述腫瘤細胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述腫瘤細胞是LOX細胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求25至28中任何一項的方法，其中所述小鼠是裸鼠。
30.根據(jù)權(quán)利要求25至28中任何一項的方法，其中所述小鼠是SCID小鼠。
31.根據(jù)權(quán)利要求25至30中任何一項的方法，其中所述摘除的組織是腹水。
32.根據(jù)權(quán)利要求25至31中任何一項的方法，其中所述表達GFP的腫瘤細胞包含新霉素抗性基因。
33.根據(jù)權(quán)利要求25至32中任何一項的方法，其中所述表達GFP的腫瘤細胞是如下制備的(a)制備包含編碼GFP蛋白的核酸的載體；(b)用所述載體轉(zhuǎn)染所述腫瘤細胞。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述載體另外包含用于G418選擇的Neo基因。
35.根據(jù)權(quán)利要求25至34中任何一項的方法，其中所述GFP是來自Renillamuelleri。
36.根據(jù)權(quán)利要求25至35中任何一項的方法，其中腹水被摘除并被評估。
37.根據(jù)權(quán)利要求25至36中任何一項的方法，其中器官被摘除并被評估。
38.一種增加細胞系轉(zhuǎn)移至特定組織的傾向的方法，該方法包括(a)用表達GFP的腫瘤細胞腹膜內(nèi)注射無胸腺小鼠；(b)處死所述小鼠；(c)摘除由所述小鼠形成的腹水；(d)將所述腹水靜脈內(nèi)注射到無胸腺小鼠中；(e)處死所述小鼠；(f)摘除欲增加向其轉(zhuǎn)移的組織；(g)從所述摘除的器官中回收表達GFP的腫瘤細胞；(h)體外培養(yǎng)所述回收的細胞；(i)將來自步驟(h)的培養(yǎng)的細胞注射到無胸腺小鼠中；其中所述培養(yǎng)的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到在步驟(f)中摘除的組織，其程度要大于原始的表達GFP的腫瘤細胞。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述腫瘤細胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或結(jié)腸直腸細胞。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述腫瘤細胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述腫瘤細胞是LOX細胞。
42.根據(jù)權(quán)利要求38至41中任何一項的方法，其中所述小鼠是裸鼠。
43.根據(jù)權(quán)利要求38至41中任何一項的方法，其中所述小鼠是SCID小鼠。
44.根據(jù)權(quán)利要求38至43中任何一項的方法，其中所述摘除的組織是肺、肝、骨、骨髓、脾、淋巴結(jié)、腎、卵巢或腦。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述摘除的組織是肺。
46.權(quán)利要38的方法，其中所述表達GFP的腫瘤細胞包含新霉素抗性基因。
47.根據(jù)權(quán)利要求38至46中任何一項的方法，其中所述表達GFP的腫瘤細胞是如下制備的(a)制備包含編碼GFP蛋白的核酸的載體；(b)用所述載體轉(zhuǎn)染所述腫瘤細胞。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述載體另外包含用于G418選擇的Neo基因。
49.根據(jù)權(quán)利要求38至48中任何一項的方法，其中所述GFP是來自Renillamuelleri。
50.LOX-GFP-LM細胞系。
全文摘要
本發(fā)明涉及評估腫瘤是否轉(zhuǎn)移的方法，評估用于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的候選藥物或方案的方法，評估用于治療腫瘤的候選藥物或方案的方法和增加細胞系轉(zhuǎn)移至特定組織的傾向的方法。本發(fā)明還涉及新的LOX－GFP－LM細胞系。
文檔編號G01N21/64GK101046471SQ200710092159
公開日2007年10月3日 申請日期2007年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者青衛(wèi)國 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司