專利名稱：一種卵母細胞石蠟切片的制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及 一種石蠟切片的制備方法，具體地說是 一種卵母細胞 石蠟切片的制備方法，本發(fā)明方法特別適用于禽類卵巢細胞切片的制 備。
背景技術(shù)：
免疫組織化學(Immunochistochemistry)又稱免疫細胞化學是指 運用免疫學原理，通過特異的抗原抗體結(jié)合反應，并對抗體標記上 可見的顯色物來檢查細胞及組織上原位抗原或抗體成分的方法?？?以識別定位細胞中的各種組織成分，如酶、多肽、核酸、多糖、激 素等，最后通過特異性染色可以在光學顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察 其所在細胞中準確位置，利用細胞分光光度計、圖像分析儀可對檢 測物進行細胞的原位定量測定。免疫組織化學技術(shù)特異性強、靈敏 度高、定位準確并且簡便快速，能夠有機的同形態(tài)、功能及代謝的 研究結(jié)合起來，適合具體研究組織和細胞中的一些理化因子的分布 和功能。免疫組化檢測通常需要先對樣本進行包埋制片處理，如石 蠟切片，冰凍切片等。在樣本切片上進行理化因子的免疫學檢測。生物顯微制片技術(shù)是研究細胞結(jié)構(gòu)與組織化學的主要方法，而 石蠟切片的制作是組織學和病理學中最常用的一種方法，適合于免 疫組化檢測的樣本石蠟切片組織平面平整，厚薄適當，完整地保留 組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)，染色效果好，反差強，并且可以長時間的保存。 隨著細胞生物學的發(fā)展和體外培養(yǎng)技術(shù)的進步，通過細胞培養(yǎng)研究 卵母細胞的生長發(fā)育愈漸深入，對于卵母細胞結(jié)構(gòu)尤其是關(guān)于其生 長發(fā)育過程中的一些基因表達的產(chǎn)物和調(diào)控激素類物質(zhì)的作用更是 人們研究的熱點之一，以往關(guān)于卵母細胞的發(fā)育研究通常釆用卵巢
局部組織切片來獲得卵母細胞的生長發(fā)育信息，對局部卵巢組織進 行切片優(yōu)點是一張切片中可以包含很多處于不同發(fā)育時期的卵母細 胞，缺點是由于其中除含有卵母細胞外還有疏松結(jié)締組織等其它成 分，在樣本的脫水過程中由于其所含多種組織性質(zhì)的不均一，導致 縮水程度不一致，最后卵母細胞發(fā)生形變，無法保持其原有的形態(tài) 結(jié)構(gòu)；并且在免疫組化檢測中會消耗大量昂貴的抗體，不僅不能使 卵母細胞的特異性檢測效果增強反而會導致非卵母細胞特異性染色 的發(fā)生，增加背景干擾程度。如果要研究某個重要調(diào)控因子在雌性 家禽卵母細胞中的作用，運用卵巢切片的方法還必須在不同時期殺 死多只雌禽取樣，這樣不僅耗時耗力成本加大，周期延長，而且個 體針對性不強，檢測的準確性不高，置信區(qū)間變寬?，F(xiàn)在細胞體外培養(yǎng)的技術(shù)和條件均已成熟和完善，雌禽卵巢上 卵母細胞的分離培養(yǎng)技術(shù)也已建立， 一只雌禽卵巢上分離的卵母細 胞在體外就可以培養(yǎng)到不同的發(fā)育階段，因此越來越多的學者投向 對家禽卵母細胞體外培養(yǎng)過程的研究，體外分離得到或經(jīng)體外培養(yǎng)的家禽卵母細胞的初期直徑通常小于400pm,石蠟包埋切片前的酒精脫水和二甲苯透明等復雜工序極易造成卵母細胞的結(jié)構(gòu)破壞和丟失，所以廣泛用于卵巢組織切片的常規(guī)石蠟包埋制片的方法，并不適合于少量甚至單個卵母細胞的切片制作，這為利用生物顯微制片技術(shù)來對卵母細胞發(fā)育過程中的形態(tài)觀察及一些理化因子的免疫組化檢測帶來不便。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對上述不足提供一種卵母細胞石蠟切片的 制備方法，用于對微小卵母細胞樣本制備石蠟切片，本發(fā)明方法特 別適用于制備禽類卵母細胞切片。本發(fā)明方法包括如下步驟1、固定將卵母細胞樣本用吸管轉(zhuǎn)移到含有固定液的無色透明 器皿中固定過夜，所述的固定液有10%的甲醛溶液、80-95%的乙醇 溶液或5%醋酸溶液；2、 脫水及透明處理用移液槍將卵母細胞從固定液中吸出，經(jīng) 脫水后，用移液槍將脫水后的卵母細胞轉(zhuǎn)移到含有透明處理液的無 色透明器皿中進行透明處理，所述的透明處理液為二甲苯、苯、甲 苯或氯仿；3、 包埋及切片將透明處理后的卵母細胞用移液槍轉(zhuǎn)移到模盒 中，去除透明處理液，露出卵母細胞，在卵母細胞周圍點上有色染 料，經(jīng)石蠟包埋后切片。本發(fā)明中的卵母細胞可以是從母體卵巢中中直接分離的卵母細 胞也可以是經(jīng)體外培養(yǎng)獲得的卵母細胞；所用的透明器皿可以是玻 璃器皿；可以用不同濃度梯度的酒精逐級脫水，具體可釆用75%， 85%， 95%以及100%的酒精逐級脫水，每個梯度處理l小時；透明 處理以l小時為宜；卵母細胞轉(zhuǎn)移到模盒后，可以讓透明處理液適當揮發(fā)或?qū)⑵湮?，露出卵母細胞，以便觀察和操作；所用的染料 可以是伊紅、品紅、番紅或次甲紫等不與石蠟反應的染料；可用常 規(guī)程序包埋和切片。本發(fā)明方法使卵母細胞在液體環(huán)境中轉(zhuǎn)移，并且全程沒有外力 直接作用，因此可以減少卵母細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，使得卵母細 胞最大程度上保持原始的形態(tài)結(jié)構(gòu)；使用無色透明器皿盛裝卵母細 胞，可以使得卵母細胞清晰可見；卵母細胞轉(zhuǎn)移到模盒后，將二甲 苯去除，露出卵母細胞，可以更容易地找到卵母細胞；在卵母細胞 周圍點上染料再進行包埋，可以便于卵母細胞在石蠟中定位。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述方法制備得到的卵母細胞切 片，其不含有間質(zhì)細胞等不需要的部分，便于染色，觀察和檢測。本發(fā)明結(jié)合原有的石蠟切片技術(shù)并對之進行了改進創(chuàng)新，降低 了成本，簡化了工藝，使其對于少量甚至單個的直徑在100微米到 600微米的禽類卵母細胞也可以進行石蠟切片的制作。獲得的切片結(jié) 構(gòu)清晰完整，經(jīng)HE染色可以獲得良好的染色和觀察效果，結(jié)合運 用免疫組化和原位雜交技術(shù)，可以更加準確的觀察到卵母細胞在體 外培養(yǎng)的不同時間，不同發(fā)育時期的不同調(diào)控蛋白和激素的作用， 為研究體外培養(yǎng)的卵母細胞的動態(tài)發(fā)育過程提供了一種高效，簡潔， 低耗的新方法。本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點1. 簡單有效，用具易得，成本低廉，可操作性好，可重復度高；2. 使卵母細胞在液體的環(huán)境中轉(zhuǎn)移，卵母細胞的原始形態(tài)結(jié)構(gòu) 可以最大程度的保留；3. 可以清晰地反映細胞的結(jié)構(gòu)和組織學特征，染色效果好；4. 同一樣本可以獲得的多張石蠟切片，可長期保存；5. 可以對同一卵母細胞進行多項不同分子和生化學指標的檢測, 檢測時抗體使用量較卵巢組織切片大為減少并且沒有引入卵巢切片 帶來的個體間遺傳差異；6. 檢測信號清晰，定位準確，結(jié)果對比度高，由于沒有其他組 織的殘留，非特異性染色少，沒有背景干擾，反映了單個卵母細胞 的生存狀態(tài)，在卵母細胞的體外培養(yǎng)研究方面應用前景廣闊。


圖l是經(jīng)透明處理后的卵母細胞； 圖2是模盒中卵母細胞所在位置； 圖3是去除二甲苯后露出的卵母細胞； 圖4是經(jīng)石蠟包埋后的卵母細胞(在有色顆粒中心)； 圖5是經(jīng)染色后卵母細胞切片。
具體實施方式
下面實施例用于對本發(fā)明的進 一步說明，但不用來限制本發(fā)明的 范圍。實施例1卵母細胞切片的制備本例以禽類卵母細胞為樣本來制備卵巢細胞石蠟切片，具體包括如下步驟1. 卵母細胞的取材與固定選取產(chǎn)蛋紀錄好的母雞處死獲取卵巢， 剝?nèi)÷涯讣毎Ⅲw外培養(yǎng)，將體外培養(yǎng)不同時間的卵母細胞在實體 解剖鏡下用玻璃吸管吸出，置于含有10%中性甲醛的玻璃瓶中固定 過夜；2. 卵母細胞的脫水與透明處理取4個玻璃瓶，加入75%, 85%, 95%, 100%酒精，約2/3容積。用移液槍將甲醛固定液中的卵母細 胞吸出，從75%到100%酒精逐級脫水，各1小時。將脫水后的卵母 細胞用移液槍吸到一個小腳量杯(10ml)中，注入5ml二甲苯透明1 小時，量杯封口；3. 卵母細胞的包埋將小腳量杯中的卵母細胞用移液槍吸出，置于 不銹鋼模盒中，將模盒置于室外使二甲苯揮發(fā)或者使用移液槍緩慢 將二甲苯吸出。此時卵母細胞可以目見，用針頭將其撥到模具中央， 在其四周放上一些伊紅顆粒，用預熱的勺子舀取熔化的石蠟注入模 盒包埋卵母細胞，浸蠟40min后置于-2(TC冰箱速凍30分鐘成型；4. 卵母細胞的切片將成型的石蠟塊從模盒中取出，置于手動輪轉(zhuǎn) 切片機上卡住。先進行粗鏇(從模具盒中取出的石蠟塊切面不會太 平整，先切幾次得到光滑平整的切面的過程)，獲得光滑平整的切面， 看見伊紅顆粒(如圖4)后將切片厚度調(diào)整為5 pm，連續(xù)切片，用 毛筆將連續(xù)切片調(diào)入溫水槽中展平，三折一段(含有一個樣本切面 的切片為一折，石蠟切片是連續(xù)的若干折連在一起，很長不易于操 作，所以將其斷開便于貼附在較小的載玻片上)用鑷子斷開，貼附 于載玻片上，50。C烘箱中烤片40min,即可得到卵巢細胞切片。在上述操作過程中，特別注意直徑微小的卵母細胞不能丟失，選用折光性好的無色玻璃器皿盛裝酒精和二甲苯，在玻璃瓶中脫水 的卵母細胞呈白色，易于定位和轉(zhuǎn)移，在小腳量杯中透明的卵母細 胞無色透明，不易觀察，但其因重力沉積在量杯底部，細致觀察或 結(jié)合使用普通放大透鏡可以觀察到其所在位置，如整個過程換用塑 料制品則因其透光性差，二甲苯透明后不易找到卵母細胞，往往造 成卵母細胞丟失。(圖1中黑線所圈注的為單個卵母細胞)在轉(zhuǎn)移過程中，應使用口徑適宜的槍頭，其口徑應大與被轉(zhuǎn)運的卵母細胞直徑200-300微米為宜，過小可能對卵母細胞造成硬傷， 過大不便于卵母細胞的轉(zhuǎn)運。在本例中卵母細胞樣本為200微米， 所采用的槍頭口徑為400微米。(圖2中黑線圈注的部分為單個卵母 細胞所在的位置)經(jīng)過二甲苯透明后的卵母細胞無色透明，在被從小腳量杯中吸 到模具盒中時完全無法定位，只有去掉二甲苯才能找到卵母細胞， 推薦加熱或自然風干的方式使二甲苯揮發(fā)，露出卵母細胞，但此法 應注意觀察二甲苯揮發(fā)狀況，不宜過干導致卵母細胞形變。也可使 用姬扁的小槍頭將二甲苯吸出，但此操作極易造成卵母細胞的丟失 和可能的結(jié)構(gòu)破壞。(圖3黑線圈注的是二甲苯初退卻時顯露的單個 卵母細胞，與背景反差明顯)釆用本法制得的卵母細胞石蠟切片具有優(yōu)異的質(zhì)量，經(jīng)過HE 染色可得良好的觀察效果，卵母細胞結(jié)構(gòu)清晰完整，胞核胞漿對比 分明。而且一個卵母細胞樣本可以獲得多張石蠟切片，可以應用于 多項免疫組化檢測，不僅檢測成本降低，而且針對性和準確性相較 于卵巢組織切片大為提高。此外本法獲得的石蠟切片易于保存，便 于回顧性研究。(圖5中左圖為HE染色結(jié)果，中圖為熒光下凋亡顆 粒細胞(亮點)的分布，右圖為GDF—9 (棕色)在卵母細胞中的分 布情況)
權(quán)利要求
1、 一種卵母細胞切片的制備方法，該方法包括如下步驟1) 固定將卵母細胞樣本用吸管轉(zhuǎn)移到含有固定液的無色透明 器皿中固定過夜；2) 脫水及透明處理用移液槍將卵母細胞從固定液中吸出，經(jīng) 脫水后，用移液槍將脫水后的卵母細胞轉(zhuǎn)移到含有透明處理液的無 色透明器皿中進行透明處理；3) 包埋及切片將透明處理后的卵母細胞用移液槍轉(zhuǎn)移到模盒 中，去除透明處理液，露出卵母細胞，在卵母細胞周圍點上染料， 經(jīng)石蠟包埋后切片。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的無色透明器皿 為玻璃器皿。
3、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的移液槍槍頭口 徑比卵母細胞的直徑大200~300微米。
4、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟l)中所述的固 定液為10%的甲醛溶液或80-95%的乙醇溶液或5%醋酸溶液；其中 步驟2)中所述的透明處理液為二甲苯、苯、甲苯或氯仿。
5、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟2)中脫水的方 法是釆用75%， 85%， 95%以及100%的酒精逐級脫水。
6、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟3)中所述的染 料為伊紅、品紅、番紅或次甲紫。
7、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟3)中石蠟包埋 的方法是用將融化的石蠟注入模盒包埋卵母細胞，浸蠟40min后置 于-2(TC冰箱速凍30分鐘成型。
8、 如權(quán)利要去l所述的方法，其特征在于步驟3)中切片地方 法是將成型的石蠟塊從模盒中取出，置于手動輪轉(zhuǎn)切片機上卡住， 先進行粗鏇，看見有色顆粒后將切片厚度調(diào)整為5pm,連續(xù)切片， 用毛筆將連續(xù)切片挑入溫水槽中展平，用鑷子挑取完整的切片，貼附于載玻片上，5(TC烘箱中烤片40min。
9、 如權(quán)利要求1 8所述的方法，其特征在于所述的卵母細胞為 禽類卵母細胞。
10、 由權(quán)利要求1 9所述的方法制備得到的卵母細胞石蠟切片。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種卵母細胞石蠟切片的制備方法，本發(fā)明方法包括固定、脫水、透明處理以及石蠟包埋和切片等步驟，本發(fā)明方法在固定脫水透明處理等過程中使卵母細胞在液體環(huán)境中轉(zhuǎn)移，并且全程沒有外力直接作用，因此可以使得卵母細胞最大程度上保持原始的形態(tài)結(jié)構(gòu)；使用無色透明器皿盛裝卵母細胞，使得卵母細胞清晰可見；卵母細胞轉(zhuǎn)移到模盒后，將二甲苯去除，露出卵母細胞，可以更容易地找到卵母細胞；在石蠟包埋前，在卵母細胞周圍撒上有色顆粒，可以便于卵母細胞在石蠟中定位。本發(fā)明方法可以對少量甚至單個的直徑在100微米到600微米的禽類卵母細胞進行石蠟切片的制作，獲得的切片結(jié)構(gòu)清晰完整，染色效果好。
文檔編號G01N1/28GK101144760SQ20071009862
公開日2008年3月19日 申請日期2007年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月23日
發(fā)明者李贊東, 杜美紅, 斌 蔣, 晨 趙, 韓海棠 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學