專利名稱：試樣分析用試劑、試樣分析用試劑盒及試樣分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于分析從生物體采集的試樣中的血細(xì)胞的試樣分析用試劑、試樣分析用試劑盒及試樣分析方法。
背景技術(shù)：
在臨床檢查領(lǐng)域，試樣中的血細(xì)胞成份分析對(duì)于診斷受檢者循環(huán)器官等的各種疾病非常有用。根據(jù)疾病的不同，有時(shí)特定的血細(xì)胞數(shù)量會(huì)增加或減少、通常不存在的血細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)在末梢血液中。
近年來，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)的各種自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置面市。人們用該裝置在一般檢查室進(jìn)行血細(xì)胞的分類和計(jì)數(shù)。使用這些自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置可以自動(dòng)地對(duì)試樣中的血細(xì)胞進(jìn)行分類和計(jì)數(shù)。
要進(jìn)行白細(xì)胞的分類和計(jì)數(shù)，首先要溶解血液試樣中的紅細(xì)胞。只要將所得試樣導(dǎo)入檢測器，檢測出電阻信號(hào)即可將白細(xì)胞分成3類?；蛘呖梢杂靡韵路椒▽准?xì)胞分成淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞5類。首先溶解血樣中的紅細(xì)胞，用熒光色素對(duì)所得試樣中的血細(xì)胞染色。然后向血細(xì)胞照射勵(lì)起光，檢測血細(xì)胞發(fā)出的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)。分析這些信號(hào)即可將白細(xì)胞分成5類。
嗜堿性細(xì)胞通常比較少，因此也可以在一次測定中不將白細(xì)胞分為5類，而只測定嗜堿性細(xì)胞。根據(jù)嗜堿性細(xì)胞在酸性條件下比其他白細(xì)胞更難被破損的特性，可以對(duì)血樣進(jìn)行處理使其成為嗜堿性細(xì)胞測定專用，再對(duì)嗜堿性細(xì)胞進(jìn)行測定(參照專利公開平成6-8817號(hào)公報(bào))。將此結(jié)果與其他方法得到的白細(xì)胞分類結(jié)果組合起來，即能更正確地將白細(xì)胞分為5類。
在白細(xì)胞測定中常常成為問題的是有核紅細(xì)胞的出現(xiàn)。由于存在有核紅細(xì)胞，即使對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行溶解處理也會(huì)有核殘留。殘留的核在上述測定方法中會(huì)發(fā)出近似淋巴細(xì)胞的信號(hào)，從而使白細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)產(chǎn)生加法誤差。為排除此影響，比如可以進(jìn)行有核紅細(xì)胞測定專用處理，測定有核紅細(xì)胞數(shù)(專利公開平成10-339729號(hào)公報(bào))，再從用其他方法獲得的白細(xì)胞數(shù)中減去有核紅細(xì)胞數(shù)。用此方法可以得到正確的白細(xì)胞數(shù)。
但是，為了得到正確的白細(xì)胞分類而增加特定的血細(xì)胞專用處理，會(huì)很費(fèi)事，裝置也會(huì)復(fù)雜化或大型化。而且，多用特定的血細(xì)胞測定專用試劑，會(huì)增加血液檢查成本。出于這種觀點(diǎn)，最好盡可能減少特定的血細(xì)胞專用處理。
嗜堿性細(xì)胞和有核紅細(xì)胞都可以通過在酸性條件下處理血樣來測定，因此，如果在酸性條件下處理血樣，則有可能嗜堿性細(xì)胞和有核紅細(xì)胞二者一次即能測定。比如，專利2002-148261號(hào)公報(bào)上記載有嗜堿性細(xì)胞和紅芽球(有核紅細(xì)胞)測定方法，即將含有能使白細(xì)胞和異常細(xì)胞易于染色的紅細(xì)胞溶解劑和表面活性劑的水溶液與試樣混合，加入含熒光色素的染色劑進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀測定熒光強(qiáng)度和散射光強(qiáng)度等。
然而，用上述這種老方法在白細(xì)胞數(shù)量多的標(biāo)本中，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)嗜堿性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞以外的白細(xì)胞不易分離的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的范圍只由后附權(quán)利要求書所規(guī)定，在任何程度上都不受這一節(jié)發(fā)明內(nèi)容的陳述所限。
本發(fā)明的第一部分為測定嗜堿性細(xì)胞和/或有核紅細(xì)胞的試樣分析用試劑，至少含選自以下通式所示熒光色素的一種熒光色素的試樣分析用試劑。
通式(I)的熒光色素化1
(式中，R1和R2為相同或不同的烷基；化2
為 或 但是當(dāng)化3

為 時(shí)則化4
為 當(dāng)化5
為 時(shí)則化6
為 或 R3、R4、R5和R6相同或不同，為氫原子或烷基；X-為陰離子)
通式(II)的熒光色素化7
(式中，R7和R8為相同或不同、也可含酸基的烷基；化8
為 或化9
為 或 R9、R10、R11及び R12為相同或不同的氫原子或酸性基，但是R7～R12中的某一個(gè)含酸性基；可能存在于R7～R12的酸性基也可形成鹽，但是R7～R12可能存在的酸性基中總有一個(gè)是放出了質(zhì)子的游離基。)本發(fā)明第二部分涉及測定嗜堿性細(xì)胞和/或有核紅細(xì)胞的試劑盒，它包含含有溶解紅細(xì)胞并給白細(xì)胞細(xì)胞膜以熒光色素能透射的破損的表面活性劑的溶液和含有選自上述通式(I)和通式(II)熒光色素中至少一種熒光色素的溶液。
本發(fā)明第三部分涉及一種試樣分析方法，其包括，用上述通式(I)和通式(II)熒光色素中的至少一種對(duì)試樣中的血細(xì)胞染色的步驟；激光照射上述經(jīng)染色的血細(xì)胞、獲取散射光信息和熒光信息的步驟；以及根據(jù)上述散射光信息和熒光信息區(qū)分和/或計(jì)數(shù)上述試樣中嗜堿性細(xì)胞和/或有核紅細(xì)胞的步驟。


圖1為用本發(fā)明試樣分析用試劑分析試樣時(shí)使用的散點(diǎn)圖的模式圖。
圖2為用本發(fā)明試樣分析用試劑分析試樣時(shí)使用的散點(diǎn)圖(實(shí)施例1)。
圖3為用本發(fā)明試樣分析用試劑分析試樣時(shí)使用的散點(diǎn)圖(實(shí)施例1)。
圖4為用本發(fā)明試樣分析用試劑分析試樣時(shí)使用的散點(diǎn)圖(實(shí)施例2)。
具體實(shí)施例方式下面參照附圖，詳細(xì)說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例本發(fā)明可以測定的嗜堿性細(xì)胞是被堿性色素染色的含大型酸性顆粒的白細(xì)胞的一種。有核紅細(xì)胞也俗稱為紅芽球，含前紅芽球、嗜堿性紅芽球、多染性紅芽球和正染性紅芽球。
在本說明書中，所謂“試樣”指，采自哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的血液、骨髓液、尿液和用單采血液成份技術(shù)采集的試樣等體液試樣。
本發(fā)明試劑所含熒光色素為上述通式(I)和/或(II)所示物質(zhì)。
本說明書中，通式(I)和(II)中的“烷基”可以是直鏈或分鏈。烷基的碳原子數(shù)一般為1～20，最好為1～10，但從熒光色素的水溶性考慮，碳原子數(shù)1～6更好。作為理想的該烷基可以舉例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和已基等。
作為通式(I)中的陰離子X-，有諸如F-、Cl-、Br-及I-等鹵負(fù)離子、CF3SO3-、BF4-、ClO4-等。
在本說明書中，通式(II)可能存在的“酸性基”包括能釋放質(zhì)子的基和能釋放質(zhì)子的基釋放了質(zhì)子的游離酸基兩種基。能釋放質(zhì)子的基有羧基、磺酸基和磷酸基，其中以羧基或磺酸基為佳。
上述酸性基也可形成鹽。這種鹽包括鈉鹽、鉀鹽等堿性金屬鹽和銨鹽、三乙銨鹽等烷基銨鹽等。其中比較理想的鹽是堿性金屬鹽或烷基銨鹽，更好的是鈉鹽或三乙銨鹽。
上述通式(I)、(II)的熒光色素可以使用一種或二種以上。
上述熒光色素比如可以購買株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所的產(chǎn)品。
本發(fā)明的試劑中的色素濃度可以根據(jù)色素種類適當(dāng)選擇，一般為0.01～100mg/L、比較適宜的為0.1～10mg/L、更理想的是0.3～6.0mg/L。
本發(fā)明的試樣分析用試劑所含上述通式(I)和通式(II)的熒光色素對(duì)嗜酸性細(xì)胞和中性細(xì)胞的親和性比對(duì)嗜堿性細(xì)胞的親和性更強(qiáng)，因此，對(duì)嗜酸性細(xì)胞和中性細(xì)胞的染色比嗜堿性細(xì)胞強(qiáng)。根據(jù)經(jīng)這些熒光色素染色的細(xì)胞發(fā)出的熒光差異，可以明確區(qū)分粒細(xì)胞中的嗜堿性細(xì)胞。嗜堿性細(xì)胞也可根據(jù)細(xì)胞的大小和細(xì)胞內(nèi)小器官的構(gòu)造等不同明確與淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞區(qū)分開。
用本發(fā)明的試樣分析用試劑對(duì)血細(xì)胞染色時(shí)，最好使妨礙有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞)測定的紅細(xì)胞溶血，破損有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞的細(xì)胞膜。通過這種破損處理，熒光色素對(duì)有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞的透射性更高，可以更有效地對(duì)血細(xì)胞染色。
一般來說，以大約150mOsm/kg以下的滲透壓即可使紅細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生微孔。紅細(xì)胞內(nèi)部的血紅蛋白通過該微孔溶出，則紅細(xì)胞在光學(xué)上變?yōu)橥该?溶血)。在光學(xué)上透明的紅細(xì)胞實(shí)際上不會(huì)成為使用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行測定的障礙。紅細(xì)胞的溶血比較適用低滲透壓條件和低pH條件。這兩個(gè)條件都滿足的滲透壓是20mOsm/kg～150mOsm/kg。
本發(fā)明的試劑的pH值以2.0～4.5為宜，2.0～3.5更好。pH值只要在此范圍內(nèi)，嗜堿性細(xì)胞的顆粒就會(huì)穩(wěn)定，而且，能夠在不對(duì)白細(xì)胞和有核紅細(xì)胞等產(chǎn)生過度影響的情況下，高效地使紅細(xì)胞溶血。以此pH值處理試樣，無核的紅細(xì)胞的散射光和熒光極其微弱，實(shí)際上不會(huì)給有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞的測定造成負(fù)面影響。
上述試劑的pH值也可用緩沖劑調(diào)整。比較適宜的緩沖劑為在所期望的pH值±2.0附近有pKa的緩沖劑。比如可以使用檸檬酸、蘋果酸、二甘醇酸、丙二酸和馬來酸等作為緩沖劑。
本發(fā)明的試劑中的上述緩沖劑濃度只要能保持pH值在上述范圍內(nèi)即可，無特別限定。
為了使本發(fā)明的試劑滲透壓在適于紅細(xì)胞溶血的范圍內(nèi)，可以使用NaCl、KCl等電解質(zhì)和糖類等。也可根據(jù)上述緩沖劑濃度調(diào)整滲透壓。
本發(fā)明的試劑應(yīng)含有使紅細(xì)胞溶血并給白細(xì)胞細(xì)胞膜以熒光色素能透射的破損的表面活性劑。該表面活性劑最好使用陽離子型表面活性劑。其中以第四級(jí)銨鹽或吡啶鎓鹽為宜。上述第四級(jí)銨鹽比如最好使用下式表示的第四級(jí)銨鹽化10
(式中，R7、R8和R9相同或不同，為氫原子、C1-8烷基或C6-8芳烷基；R10為C8-18烷基、C8-18鏈烯基或C6-18芳烷基；X-為陰離子。)作為上述吡啶鎓鹽，比如可以使用以下式子表示的吡啶鎓鹽化11
(式中，R11為C8-18烷基；X-為陰離子)這種表面活性劑已經(jīng)公開，比如可以使用專利公告2002-148261號(hào)上公開的東西。
作為上述表面活性劑可以舉出以下具體例子十二烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基氯化銨、辛基三甲基溴化銨、辛基三甲基氯化銨、月桂三甲基溴化銨、月桂三甲基氯化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基氯化銨或氯化月桂吡啶鎓等。
本發(fā)明的試劑中的上述表面活性劑濃度以10～10000mg/l為宜，100～5000mg/l更好，濃度只要在此范圍內(nèi)，即可在不過度影響白細(xì)胞和有核紅細(xì)胞的情況下高效地使紅細(xì)胞溶血。
本發(fā)明的試劑最好分子內(nèi)至少含有一個(gè)至少有一個(gè)芳香環(huán)的有機(jī)酸(以下稱“芳香有機(jī)酸”)或其鹽。使用芳香有機(jī)酸可以更有效地在短時(shí)間內(nèi)使紅細(xì)胞溶血。比較理想的芳香有機(jī)酸是水楊酸或酞酸。
至于本發(fā)明的試樣分析用試劑中的上述芳香有機(jī)酸或其鹽的濃度，沒有特別限定，只要本發(fā)明的試劑達(dá)到上述范圍的濃度即可，但以0.1～100mM，1～50mM更好。
將上述熒光色素加入適當(dāng)?shù)娜苊街校⒏鶕?jù)希望在該溶媒中加入上述表面活性劑和芳香有機(jī)酸或其鹽，加到上述濃度，再根據(jù)需要用NaOH和HCl等調(diào)整pH值即可得到本發(fā)明的試劑。另外，將分別溶解于適當(dāng)溶媒的熒光色素溶液、根據(jù)希望添加的表面活性劑溶液和芳香有機(jī)酸或其鹽的溶液混合，使上述各成份最終濃度達(dá)到上述范圍，再根據(jù)需要用NaOH、HCl等調(diào)整pH值也可得到本發(fā)明的試劑。上述適當(dāng)溶媒無特別限定，只要能溶解上述成份即可，例如有水、酒精、乙二醇、二甲基亞砜(DMSO)以及這些混合液等。
本發(fā)明的試劑最好以試劑∶試樣的容量比為5～1000∶1、最好10～500∶1與試樣混合。以這種比例混合試劑和試樣可以加快紅細(xì)胞的溶解，更好地對(duì)血細(xì)胞成份染色。試樣的量只要有數(shù)μl～100μl即能較好地進(jìn)行測定。
含有含上述表面活性劑的第一試劑和含熒光色素的第二試劑的試劑盒也是本發(fā)明之一。第一試劑和第二試劑是分別含有表面活性劑的溶液和含熒光色素的溶液。用于這些溶液的溶媒無特別限定，只要能夠溶解表面活性劑或熒光色素即可。比如可以用水、酒精、有機(jī)溶媒(乙二醇、二甲基亞砜(DMSO))及其混合液等。當(dāng)使用在水溶液中長期保存穩(wěn)定性低的熒光色素時(shí)，最好將其溶解在上述有機(jī)溶媒中。
第一試劑也可以包含上述芳香族有機(jī)酸或其鹽。
或者本發(fā)明的試劑盒還可以包含不同于第一試劑和第二試劑另含芳香族有機(jī)酸或其鹽的第三試劑。
本發(fā)明的試樣分析方法包括以下步驟用上述熒光色素對(duì)試樣中的血細(xì)胞染色；用光束照射經(jīng)染色的血細(xì)胞，獲取散射光信息和熒光信息；根據(jù)獲取的散射光信息和熒光信息將試樣中的嗜堿性細(xì)胞與其他白細(xì)胞成份區(qū)分并計(jì)數(shù)。在該染色步驟中，最好先使紅細(xì)胞溶血，破損被溶血的紅細(xì)胞以外的其他細(xì)胞的細(xì)胞膜，使熒光色素能透射，再對(duì)受損的血細(xì)胞進(jìn)行染色。
在該染色步驟中，將熒光色素與試樣混合。最好在此步驟將熒光色素和上述表面活性劑和試樣混合。此表面活性劑會(huì)破損血細(xì)胞細(xì)胞膜使熒光色素能透射，因此，通過混合表面活性劑和試樣可以有效地用熒光色素對(duì)待測血細(xì)胞染色。
在該染色步驟中，如果使用表面活性劑，對(duì)表面活性劑、熒光色素和試樣的混合順序無特別限定?？梢韵然旌媳砻婊钚詣┖蜔晒馍?，再將其混合液與試樣混合，也可以先混合表面活性劑和試樣，再將其混合液與熒光色素混合。無論用哪個(gè)順序混合都能得到同樣的測定結(jié)果。
在上述染色步驟中，也可以將本發(fā)明的試劑與試樣混合，也可以將本發(fā)明的試劑盒的各組成部分與試樣混合。
在上述染色步驟中，混合熒光色素和試樣后，應(yīng)使其在15～50℃、最好20～40℃的溫度中反應(yīng)5～120秒、最好5～30秒。
在上述染色步驟中染色的血細(xì)胞可以用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。下面就用流式細(xì)胞儀分析血細(xì)胞的過程作一說明。當(dāng)染色的血細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀的流動(dòng)池時(shí)，通過用光束照射血細(xì)胞，即可得到散射光信息和熒光信息。作為散射光信息，是市面上出售的流式細(xì)胞儀能夠測定的散射光即可，無特別限定。比如前向散射光(如受光角度0～20度附近)、側(cè)向散射光(受光角度90度附近)等的散射光光幅、強(qiáng)度等都可作為散射光信息使用。眾所周知，側(cè)向散射光反映細(xì)胞核和顆粒等內(nèi)部信息，前向散射光反映細(xì)胞大小等信息。在本發(fā)明的方法中，最好使用前向散射光強(qiáng)度作為散射光信息。
所謂熒光信息，指以適當(dāng)波長的光照射待測試樣，測定勵(lì)起的熒光所得到的信息。根據(jù)所用熒光色素不同，可以選擇適當(dāng)?shù)氖芄獠ㄩL。熒光從被上述熒光色素染色的細(xì)胞內(nèi)的核和顆粒產(chǎn)生。
所用流式細(xì)胞儀的光源無特別限定，可以選擇適于熒光色素勵(lì)起的波長的光源。比如可使用紅色半導(dǎo)體激光器、蘭色半導(dǎo)體激光器、氬激光器、He-Ne激光器等。特別是半導(dǎo)體激光器比氣體激光器便宜很多，比較合適。
根據(jù)上述測定的散射光和熒光，可以從其他成份中區(qū)分有核紅細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞并計(jì)數(shù)。此步驟最好包括(1)比如以熒光信息和前向散射光信息為二軸繪制散點(diǎn)圖；(2)用適當(dāng)分析軟件分析所得散點(diǎn)圖。當(dāng)以熒光強(qiáng)度為X軸、以前向散射光強(qiáng)度為Y軸繪制散點(diǎn)圖時(shí)，如圖1所示，各細(xì)胞成群(聚類)分布。有核紅細(xì)胞比粒細(xì)胞(中性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞)個(gè)頭小。因此，在這種散點(diǎn)圖中，有核紅細(xì)胞出現(xiàn)在比粒細(xì)胞前向散射光強(qiáng)度小、比白細(xì)胞熒光強(qiáng)度小的區(qū)域，因此而能明確區(qū)分白細(xì)胞和有核紅細(xì)胞。嗜堿性細(xì)胞出現(xiàn)在熒光強(qiáng)度比嗜酸性細(xì)胞和中性細(xì)胞小的區(qū)域，因此能夠明確將嗜堿性細(xì)胞與其他粒細(xì)胞明確區(qū)分開。至于散點(diǎn)圖上的各群對(duì)應(yīng)于哪個(gè)血細(xì)胞，要待用本發(fā)明處理了只含各血細(xì)胞的試樣后，通過測定、確認(rèn)出現(xiàn)位置才能確定。
通過用適當(dāng)分析軟件分析散點(diǎn)圖上的細(xì)胞群，能夠計(jì)算出有核紅細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞的數(shù)量和比例。具體而言，在散點(diǎn)圖中，當(dāng)確認(rèn)細(xì)胞群出現(xiàn)在被認(rèn)為某一特定細(xì)胞出現(xiàn)的位置上時(shí)，首先劃定此細(xì)胞群的中心?？梢詫拇酥行牡狡渌?xì)胞群出現(xiàn)區(qū)域之間直至特定細(xì)胞群的細(xì)胞出現(xiàn)的部分止設(shè)為此細(xì)胞群的界限。出現(xiàn)在所設(shè)區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞即可作為特定細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過對(duì)嗜堿性細(xì)胞以外的白細(xì)胞計(jì)數(shù)，可以算出嗜堿性細(xì)胞對(duì)全白細(xì)胞的比率(嗜堿性細(xì)胞/全白細(xì)胞以下稱“嗜堿性細(xì)胞比率”)和有核紅細(xì)胞對(duì)全白細(xì)胞的比率(有核紅細(xì)胞/全白細(xì)胞以下稱“有核紅細(xì)胞比率”)。有核紅細(xì)胞比率通常用每100個(gè)白細(xì)胞出現(xiàn)的有核紅細(xì)胞的百分率表示，單位記為“個(gè)/100WBC”。
使用本發(fā)明的試樣分析用試劑、試樣分析用試劑盒及其試樣分析方法，可以明確將有核紅細(xì)胞形成的細(xì)胞群、嗜堿性細(xì)胞形成的細(xì)胞群分別從其他血細(xì)胞形成的細(xì)胞群區(qū)分開。因此可以更正確地對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分類和/或計(jì)數(shù)。
下面用實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明。對(duì)于本發(fā)明可以進(jìn)行各種變更和修飾，本發(fā)明的范圍不受以下實(shí)施例所限。
以下實(shí)施例中使用的熒光色素如下NK-1840[化12]
NK-2929[化13] NK-3375[化14]
NK-3662[化15] NK-5056[化16]
NK-9001[化17] NK-9002[化18]
NK-9003[化19] NK-4249[化20] NK-3606[化21]
NK-3620[化22] 比較例1試樣使用的是分別從2名受檢者采集的血液。用XE-2100自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(希森美康公司制配備紅色半導(dǎo)體激光器(633nm))測定血樣2標(biāo)本中所含嗜堿性細(xì)胞，算出嗜堿性細(xì)胞比率。試劑使用的是STROMATOLYSER-FBII(希森美康公司制)。
測定結(jié)果，確認(rèn)這些試樣嗜堿性細(xì)胞的含量很高(以下將此試樣稱為Baso試樣1和Baso試樣2)。Baso試樣1的嗜堿性細(xì)胞比率為2.3％，Baso試樣2的嗜堿性細(xì)胞比率為1.7％，將這些結(jié)果與實(shí)施例1作比較。
接下來，以從不同于上述受檢者的其他2名受檢者采集的血液作為試樣使用。用XE-2100自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定血樣2標(biāo)本中所含有核紅細(xì)胞，計(jì)算出有核紅細(xì)胞比率。試劑使用的是STROMATOLYSER-NR(希森美康公司制)。
測定結(jié)果，確認(rèn)這些試樣有有核紅細(xì)胞出現(xiàn)(以下將此試樣稱為NRBC試樣1和NRBC試樣2)。NRBC試樣1的有核紅細(xì)胞比率為3.0個(gè)/100WBC，NRBC試樣2的有核紅細(xì)胞比率為5.9個(gè)/100WBC。將此結(jié)果與實(shí)施例1比較。
實(shí)施例1將含有水楊酸10mM(pH3.0)和十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)3000ppm的水溶液1mL放入35℃恒溫槽。在此，將圖2和圖3顯示的各種色素(NK-1840 2ppm、NK-2929 6ppm、NK-3375 6ppm、NK-3662 6ppm、NK-5056 6ppm、NK-3620 6ppm、NK-9001 2ppm、NK-9002 2ppm、NK-9003 2ppm、NK-4249 2ppm及NK-3606 2ppm)分別加到上述濃度溶解，得到試樣分析用試劑。
所得試劑1mL與血樣(Baso試樣1或2或者NRBC試樣1或2)20pl充分混合，在35℃反應(yīng)20秒后，試樣從恒溫槽取出，送至有633nm勵(lì)起光源的流式細(xì)胞儀檢測部分。試樣中的細(xì)胞受勵(lì)起光照射發(fā)出散射光和熒光，檢測細(xì)胞發(fā)出的散射光信號(hào)和熒光信號(hào)。分析所得信號(hào)，測定試樣中的嗜堿性細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和全白細(xì)胞。此測定使用XE-2100自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行。
另外，在Baso試樣1中分別添加含NK1840的試劑、含NK2929的試劑、含NK3375的試劑、含NK3662的試劑、含NK5056的試劑和含NK3620的試劑進(jìn)行測定。
在Baso試樣2中分別添加含NK9001的試劑、含NK9002的試劑、含NK9003的試劑、含NK4249的試劑及含NK3606的試劑進(jìn)行測定。
在NRBC試樣1中分別添加含NK1840的試劑、含NK2929的試劑、含NK3375的試劑、含NK3662的試劑、含NK5056的試劑和含NK3620的試劑進(jìn)行測定。
在NRBC試樣2中分別添加含NK9001的試劑、含NK9002的試劑、含NK9003的試劑、含NK4249的試劑及含NK3606的試劑進(jìn)行測定。
再就各個(gè)試樣繪制以熒光強(qiáng)度和前向散射光強(qiáng)度為二軸的散點(diǎn)圖。此散點(diǎn)圖如圖2和圖3所示。根據(jù)這些散點(diǎn)圖，對(duì)全白細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞和有核紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，算出嗜堿性細(xì)胞比率和有核紅細(xì)胞比率。將根據(jù)比較例1和本實(shí)施例算出的Baso試樣中的嗜堿性細(xì)胞比率顯示為表1，將NRBC試樣中的有核紅細(xì)胞比率顯示為表2。
表1


表2


從圖2和3可以看出，使用本發(fā)明的試樣分析用試劑，嗜堿性細(xì)胞被從嗜堿性細(xì)胞以外的白細(xì)胞成份明確區(qū)分開，有核紅細(xì)胞也被明確區(qū)分開。如此，如圖2和3所示，在散點(diǎn)圖上出現(xiàn)在一定區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞作為嗜堿性細(xì)胞和有核紅細(xì)胞劃定出來，并求出這些細(xì)胞的個(gè)數(shù)和對(duì)全白細(xì)胞的比率。
從表1和2可以看出，實(shí)施例1算出的比率和比較例1算出的比率值很近似，因此可以確認(rèn)，使用本發(fā)明的試樣分析用試劑能夠以與分別使用不同試劑測定有核紅細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞時(shí)同樣的精度測定有核紅細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞。
比較例2除使用嗜堿性細(xì)胞含量高且有有核紅細(xì)胞出現(xiàn)的試樣(以下稱BN試樣)取代在比較例1中使用的試樣外，其他同比較例1，測定試樣中的嗜堿性細(xì)胞，算出嗜堿性細(xì)胞比率。嗜堿性細(xì)胞比率為2.1％。與嗜堿性細(xì)胞測定分開，使用BN試樣測定有核紅細(xì)胞，算出有核紅細(xì)胞比率。有核紅細(xì)胞比率為3.6個(gè)/100WBC。將這些結(jié)果與實(shí)施例2比較。測定嗜堿性細(xì)胞使用的試劑是STROMATOLYSER-FBII(希森美康公司制)，使用的儀器是XE-2100自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(希森美康公司制)。測定有核紅細(xì)胞使用的試劑是STROMATOLYSER-NR(希森美康公司制)，使用的儀器是XE-2100自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(希森美康公司制)。
實(shí)施例2除使用BN試樣取代實(shí)施例1使用的試樣、作為色素使用含有NK-2929、NK-3375、NK-3662和NK-5056的試劑外，其他同實(shí)施例1，對(duì)嗜堿性細(xì)胞和有核紅細(xì)胞進(jìn)行測定，算出嗜堿性細(xì)胞比率和有核紅細(xì)胞比率。試樣分析用試劑中的色素濃度調(diào)整到6ppm。這些比率如表3所示。在本實(shí)施例中繪制的以前向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度為二軸的散點(diǎn)圖如圖4所示。


從圖4的結(jié)果可以確認(rèn)，使用本發(fā)明的試樣分析用試劑一次測定即可明確將試樣中的嗜堿性細(xì)胞與其他成份區(qū)分開，將有核紅細(xì)胞與其他成份明確分開。從表3可以看出，實(shí)施例2算出的比率與比較例2算出的比率值很近似。因此，使用本發(fā)明的試劑能夠以與分別用不同試劑測定嗜堿性細(xì)胞和有核紅細(xì)胞時(shí)同樣的精度測定嗜堿性細(xì)胞和有核紅細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種測定試樣中的嗜堿性細(xì)胞和/或有核紅細(xì)胞的試劑，至少含選自以下通式所示熒光色素的一種熒光色素的試劑；通式(I) 式中，R1和R2為相同或不同的烷基； 為 或 但是當(dāng) 為 時(shí)則 為 當(dāng) 為 時(shí)則 為 或 R3、R4、R5和R6為相同或不同的氫原子或烷基；X-為陰離子；和通式(II) 式中，R7和R8為相同或不同、也可含酸基的烷基； 為 或 為 或 R9、R10、R11及びR12為相同或不同的氫原子或酸性基，但是R7～R12中的某一個(gè)含酸性基；可能存在于R7～R12的酸性基也可形成鹽，但是R7～R12可能存在的酸性基中總有一個(gè)是放出了質(zhì)子的游離基。
2.權(quán)利要求1所述試劑，其特征在于通式(II)R7～R12可能存在的酸性基至少是由羧基和磺酸基構(gòu)成的群體中的1種酸性基。
3.權(quán)利要求1所述試劑，其特征在于上述通式(II)R7～R12可能存在的酸性基至少是由堿性金屬鹽的基和烷基銨鹽的基組成的群體中的1種酸性基。
4.權(quán)利要求1所述試劑，還含有溶解紅細(xì)胞并給白細(xì)胞細(xì)胞膜以熒光色素能透射的破損的表面活性劑。
5.權(quán)利要求4所述試劑，其中所述表面活性劑為陽離子型表面活性劑。
6.權(quán)利要求4所述試劑，其特征在于所述表面活性劑為選自第四級(jí)銨鹽和吡啶鎓鹽型構(gòu)成的群體中的至少一種表面活性劑。
7.權(quán)利要求1所述試劑，其特征在于pH值從2.0到4.5。
8.權(quán)利要求1所述試劑，還含有芳香族有機(jī)酸。
9.權(quán)利要求8所述試劑，其特征在于所述芳香族有機(jī)酸是選自水楊酸、酞酸及其鹽構(gòu)成的群體中至少一種芳香族有機(jī)酸。
10.一種試樣分析用試劑盒，用于測定選自由嗜堿性細(xì)胞和有核紅細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞群的細(xì)胞，其包含含有溶解紅細(xì)胞并給白細(xì)胞細(xì)胞膜以熒光色素能透射的破損的表面活性劑的溶液和含有選自下述通式(I)和通式(II)熒光色素中至少一種熒光色素的溶液，通式(I) 式中，R1和R2為相同或不同的烷基； 為 或 但是當(dāng) 為 時(shí)則 為 當(dāng) 為 時(shí)則 為 或 R3、R4、R5和R6為相同或不同的氫原子或烷基；X-為陰離子；和通式(II) 式中，R7和R8為相同或不同、也可含酸基的烷基； 為 或 為 或 R9、R10、R11及びR12為相同或不同的氫原子或酸性基，但是R7～R12中的某一個(gè)含酸性基；可能存在于R7～R12的酸性基也可形成鹽，但是R7～R12可能存在的酸性基中總有一個(gè)是放出了質(zhì)子的游離基。
11.一種對(duì)可能含有選自嗜堿性細(xì)胞和有核紅細(xì)胞組成的細(xì)胞群的血細(xì)胞的試樣進(jìn)行分析的方法，該試樣分析方法包括以下步驟用選自下述通式(I)和(II)所示熒光色素的至少一種熒光色素對(duì)試樣中的血細(xì)胞染色的步驟；通式(I) 式中，R1和R2為相同或不同的烷基； 為 或 但是當(dāng) 為 時(shí)則 為 當(dāng) 為 時(shí)則 為 或 R3、R4、R5和R6為相同或不同的氫原子或烷基；X-為陰離子；通式(II) 式中，R7和R8為相同或不同、也可含酸基的烷基； 為 或 為 或 R9、R10、R11及び R12為相同或不同的氫原子或酸性基，但是R7～R12中的某一個(gè)含酸性基；可能存在于R7～R12的酸性基也可形成鹽，但是R7～R12可能存在的酸性基中總有一個(gè)是放出了質(zhì)子的游離基；激光照射上述經(jīng)染色的血細(xì)胞的步驟；檢測各個(gè)血細(xì)胞發(fā)出的散射光和熒光的步驟；以及根據(jù)上述散射光和熒光的強(qiáng)度，對(duì)上述試樣中選自由嗜堿性細(xì)胞和有核紅細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞群的血細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的步驟。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于在所述染色步驟，溶解紅細(xì)胞并給血細(xì)胞的細(xì)胞膜以熒光色素能透射的破損，再用上述熒光色素對(duì)受破損的血細(xì)胞染色。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定試樣中的嗜堿性細(xì)胞和/或有核紅細(xì)胞的試劑，至少含通式(I)或(II)所示熒光色素的一種熒光色素。還涉及一種測定嗜堿性細(xì)胞和/或有核紅細(xì)胞的試劑盒及其方法。
文檔編號(hào)G01N15/10GK101086473SQ20071010842
公開日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2007年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者水上利洋, 竹下浩生, 成川隆也 申請(qǐng)人:希森美康株式會(huì)社