專利名稱：：檢測乳腺癌特征蛋白的優(yōu)化質(zhì)譜模型及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于質(zhì)譜檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及對乳腺癌血液優(yōu)化的質(zhì)譜檢測方法。一種通過能與蛋白質(zhì)結(jié)合的磁珠基質(zhì)去捕獲生物標(biāo)志，并用有定量控制的質(zhì)譜分析來檢測乳腺癌生物標(biāo)志。在此提及的此項(xiàng)發(fā)明涉及蛋白質(zhì)檢測領(lǐng)域，為一種新的非侵入性的體外質(zhì)譜檢測方法。本發(fā)明可以應(yīng)用到已經(jīng)脫離人體的體液中的乳腺癌生物標(biāo)志組合的檢測方法或試劑盒。
背景技術(shù)：
：乳腺癌的發(fā)生是一個多基因突變導(dǎo)致抑癌基因失活、癌基因活化的過程?；蚪M學(xué)研究由于自身的限制難以完全闡明基因與蛋白質(zhì)參與過程及其具體作用，而近年來蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為人們從整體上了解惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了較為理想的技術(shù)平臺。目前臨床上對惡性腫瘤預(yù)后評估主要依賴于臨床表現(xiàn)、病理學(xué)及傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志(tumormarker),但腫瘤早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時常常無明顯臨床表現(xiàn)，而病理學(xué)證據(jù)很難得到且重復(fù)性差。乳腺癌在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率都比較高，在美國每年的新發(fā)乳腺癌病人占女性各種惡性腫瘤的1/3。在我國乳腺癌發(fā)病率也已居女性各種惡性腫瘤前列。雖然對于乳腺癌的治療已經(jīng)取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，預(yù)防和早期發(fā)現(xiàn)仍是降低乳腺癌死亡率的有效途徑和提高患者成活率的關(guān)鍵。但目前的檢測方法敏感性和特異性均較低，己成為乳腺癌早期檢測的一個瓶頸。乳腺癌的高發(fā)病率和高死亡率使得人們不斷地尋求一種有效的早期檢測方法，臨床上僅以CA153—種蛋白作為血清學(xué)檢測指標(biāo)在敏感性和特異性上是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足的，而影象學(xué)檢測一旦發(fā)現(xiàn)占位病變則已經(jīng)不是很早期了。能夠使疾病在發(fā)生的極早期就能夠得已發(fā)現(xiàn)，并得到控制和治療，進(jìn)而大大提高治愈率或明顯改善病人的預(yù)后和生活質(zhì)量。近年來隨著臨床蛋白質(zhì)組學(xué)的開展，使得乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)成為可能。蛋白質(zhì)的分離技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用分離技術(shù)有兩個目的。第一、通過將蛋白質(zhì)的混合物分離成單一蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)小組以簡化復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物；第二、通過標(biāo)記的方法可以比較兩個蛋白質(zhì)的混合物樣品中蛋白質(zhì)的不同表現(xiàn)。其中主要的技術(shù)有雙向電泳gelelectrophoresis,2-DE)、高效液相層析(high-performanceliquidchromatography,HP1X)、毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)、親禾口層析(affinitychoromatography)、蛋白芯片(proteinmicroarray)、磁性微球(magneticbeads,簡稱磁珠)和免疫組等。特別是蛋白芯片和磁珠兩項(xiàng)新的蛋白指紋圖譜技術(shù)克服了以往技術(shù)的缺點(diǎn)，具有高靈敏度、高通量、結(jié)果重復(fù)性好、可機(jī)械化操作和方法靈活等特點(diǎn)。待測樣品來源廣泛，不需作特殊前處理，可以直接點(diǎn)樣檢測，如血清、尿液及組織液等；檢測快速，一般一例標(biāo)本的檢測時間僅需約5分鐘，從標(biāo)本制備到出結(jié)果全過程僅約1小時。蛋白芯片和磁珠兩項(xiàng)新的蛋白指紋圖譜技術(shù)有可能在體液中潛在生物標(biāo)志(biomarker)檢測方面創(chuàng)造革命性突破(許洋，蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007,27:134-142)?；|(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,MALDI-T0F-MS)與蛋白芯片分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用即為表面增強(qiáng)激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,SELDI-TOF-MS)。2-DE最先被用于臨床蛋白組學(xué)研究，但其對疏水性、強(qiáng)酸性和強(qiáng)鹼性蛋白的分辯率不夠，而且不能檢測低豐度蛋白，故實(shí)用價值受限。近來，蛋白芯片與質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-T0F-MS)的結(jié)合，己被成功地用于腫瘤研究；但由于磁珠表面的結(jié)合面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白芯片，從而磁珠的靈敏性比蛋白芯片更高(劉建棟等，血液蛋白質(zhì)組與質(zhì)譜儀檢測流程標(biāo)準(zhǔn)化初探?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007,27:193-197)。磁珠具有優(yōu)于二維電泳、蛋白芯片和其他質(zhì)譜方法的特點(diǎn)，已被廣泛地用于腫瘤生物標(biāo)志的篩査等研究(屠世良等，癌胚抗原陰性結(jié)直腸癌的檢測和結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007)。該技術(shù)具有操作簡便、無需離心樣品、可直接分析原始生物樣本(如血清、尿液等)、樣本用量小等特點(diǎn)，同時適合多樣品平行檢測和直接進(jìn)行蛋白質(zhì)全景式的搜索和分析，特別是對小分子量蛋白和低豐度蛋白具有較高的捕獲效果，可以與其他蛋白質(zhì)組學(xué)方法互補(bǔ)，目前已被廣泛地用于腫瘤標(biāo)志的篩査和臨床檢測，并均已獲得很好的結(jié)果。但國內(nèi)迄今尚無采用磁珠與質(zhì)譜技術(shù)獲得檢測乳腺癌血清特征蛋白的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為克服對目前乳腺癌血清檢測技術(shù)的不足之處，建立一種檢測乳腺癌特征蛋白的優(yōu)化質(zhì)譜模型及其制備方法和應(yīng)用，該模型為早期檢測提供了新的途徑和方法，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的腫瘤生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明提出的檢測乳腺癌血清蛋白質(zhì)的質(zhì)譜模型，其特征在于從血清中篩選出8個上調(diào)蛋白和3個下調(diào)蛋白作為特征蛋白；選取上述11個特征蛋白中的任意兩個或兩個以上的蛋白，根據(jù)各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M，建立了乳腺癌患者與正常人、乳腺良性疾病、乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者兩兩鑒別的血清特征蛋白檢測質(zhì)譜模型;所述的特異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/^3164，M》3.30;m/z=3404，M《13.76;m/z=7977,M》14.88;m/z=6116，M《9.71;m/z=4180，M》22.64;m/z=4202，M^l.76;m/z=11683，M》1.88;m/z=8938，M》2.75;分子量(m/z)誤差〈0.01%，臨界峰值均值M的CV<510%。本發(fā)明提出上述的檢測乳腺癌血清蛋白質(zhì)譜模型的制備方法，包括以下步驟1)4t條件下2小時內(nèi)收集經(jīng)病理明確診斷的乳腺癌患者血清及經(jīng)體檢確定為正常健康者的血清作為兩組血清標(biāo)本，進(jìn)行一8(TC低溫冷凍備用；2)采用WCX磁珠對所述乳腺癌患者及正常人的兩組血清標(biāo)本的蛋白進(jìn)行吸附；3)用激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標(biāo)志后用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)對結(jié)合在弱陰離子表面的WCX磁珠上的兩組血清蛋白進(jìn)行讀取，設(shè)定最高檢測分子量為50kDa,優(yōu)化分子量范圍100015000Da，最佳聚集中心8000Da，數(shù)據(jù)采集參數(shù)范圍2080，激光強(qiáng)度150-180，檢測敏感度為7-8，收集總數(shù)為130次，由此獲得兩組蛋白質(zhì)譜圖譜；4)在每次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集前，用All-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白及質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控0型血清校正儀器，用2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da標(biāo)準(zhǔn)峰為質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)定性(分子量)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，使分子量誤差<0.01%,從而獲得的精確的蛋白質(zhì)譜圖譜；5)定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da等強(qiáng)度調(diào)至50%信號強(qiáng)度的最大值，使臨界峰值均值M的CV<510%，并收集精確的質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)；6)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行Mann-Whitney〃檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，根據(jù)乳腺癌患者和正常人血清之間蛋白峰值的差異(共得到231個蛋白峰，認(rèn)定P值小于10—5時具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，檢測出2組血清蛋白指紋質(zhì)譜圖譜之間有11個穩(wěn)定的差異蛋白，見表一表一乳腺癌患者特征蛋白的表達(dá)變化蛋白分子量(m/z)乳腺癌患者蛋白臨界峰值均值特征蛋白的表達(dá)變化M±SD31648.23±3.9620922.62±1.8342023.29±2.23418033.31±17.13797727,91±13.93418039.68±17.8489382.75±3.511168310,71±3.5161169.71±2.75340413.76±5.8760952.83±1.50表一中向上箭頭"t"為在乳腺癌患者血清中高表達(dá)的上調(diào)特征蛋白；向下箭頭"I"為在乳腺癌患者血清中低表達(dá)的下調(diào)特征蛋白；將上述11個差異蛋白作為乳腺癌質(zhì)譜檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶卣鞯鞍祝?)由于多個特征蛋白組合起來才可將乳腺癌與正常人等完全分幵，故選取上述ll個特征蛋白中的任意兩個或兩個以上的蛋白，根據(jù)各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M，建立了乳腺癌患者與正常人、乳腺良性疾病、乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者兩兩鑒別的血清特征蛋白檢測質(zhì)譜模型(圖2-5)，所說的特異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/z=3164，M>3.30;m/z=3404，M《13.76;m/z=7977，M》14.88;m/z=6116，M《9.71;m/z=4180，M》22.64;m/z=4202，M》1.76;m/z=11683，M》1.88;m/z=8938，M>2.75;其中乳腺癌患者與正常人鑒別的質(zhì)譜模型A由m/z=3164，M》3.30;m/z=3404，M《13.76繪制而成，乳腺癌患者與乳腺良性疾病鑒別的質(zhì)譜模型B由m/z-7977，M》14.88;m/z=6116，M《9.71繪制而成，乳腺癌患者與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鑒別的質(zhì)譜模型C由m/z=4180，M》22.64;m/z=4202，M》1.76繪制而成，乳腺癌患者與乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移鑒別的質(zhì)譜模型D由m/z41683，M^1.88;m/z=8938，M》2.75繪制而成；分子量(m/z)誤差<0.01%，臨界峰值均值M的CV<510%。利用該質(zhì)譜模型，只要將受檢人血清中相應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與本發(fā)明質(zhì)譜模型逐一進(jìn)行對比分析，就可用于乳腺癌篩查和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的評估。利用該質(zhì)譜模型A-D(圖2-5)，將受檢者血清中相應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與本發(fā)明的質(zhì)譜模型逐一進(jìn)行對比分析，經(jīng)臨床試用及雙盲測試，其鑒別乳腺癌患者與正常人的敏感性為100%,特異性為90%;乳腺癌與乳腺良性疾病患者敏感性95%，特異性87%，乳腺癌患者與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移敏感性89%，特異性87%;乳腺癌患者與乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移敏感性81%，特異性98%。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本發(fā)明采用上述質(zhì)譜模型可用于乳腺癌早期檢測、篩査和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的評估。本發(fā)明的特點(diǎn)及效果本發(fā)明與其他乳腺癌的檢測方法比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)第一、本發(fā)明采用乳腺癌患者與正常人具有差異的多個特征蛋白組合起來進(jìn)行對乳腺癌血清的檢測，提供的質(zhì)譜模型是乳腺癌早期檢測和篩査的新方法和新途徑，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的乳腺癌生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)；第二、與以往的血清學(xué)檢測方法比較具有較高的敏感性和特異性，是一種在蛋白組學(xué)水平上的檢測，對乳腺癌的早期檢測提供了新標(biāo)準(zhǔn)；第三、本發(fā)明由于磁珠表面的結(jié)合面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白芯片，從而磁珠的靈敏性比蛋白芯片更高而具有了更高的靈敏度，從而優(yōu)化了質(zhì)譜模型；第四、本發(fā)明首創(chuàng)采用了定量性質(zhì)譜調(diào)控，CV<510%，使磁珠的臨界峰值均值M比蛋白芯片更可靠及精確；第五、本發(fā)明首創(chuàng)采用了用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)定性的2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da標(biāo)準(zhǔn)峰(分子量)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，使分子量誤差〈0.01%,從而獲得的精確的蛋白質(zhì)譜圖譜；第六、本發(fā)明質(zhì)譜模型的構(gòu)建方法設(shè)計(jì)精確及合理可行，為降低我國乳腺癌的病死率、提高乳腺癌的臨床治愈提供了一種新的篩査和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的評估方法；第七、利用本發(fā)明用雙盲法分析了268份血清標(biāo)本，其鑒別乳腺癌患者與正常人的敏感性為100%，特異性為90%;乳腺癌與乳腺良性疾病患者敏感性95%，特異性87%，乳腺癌患者與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移敏感性89%，特異性87%;乳腺癌患者與乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移敏感性81%，特異性98%。因此本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)對乳腺癌進(jìn)行早期預(yù)警、早期發(fā)現(xiàn)。說明書附1乳腺癌及正常人血清蛋白多肽質(zhì)譜圖譜圖2乳腺癌患者與正常人鑒別的質(zhì)譜模型圖3乳腺癌患者與乳腺良性疾病鑒別的質(zhì)譜模型圖4乳腺癌患者與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鑒別的質(zhì)譜模型圖5乳腺癌患者與乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移鑒別的質(zhì)譜模型圖中m/z表示特異蛋白的質(zhì)荷比，M代表該特異蛋白的臨界峰值均值具體實(shí)施方式本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明，這些實(shí)例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1正常與乳腺癌患者的區(qū)分及質(zhì)譜的試劑盒制備(1)實(shí)驗(yàn)方法88例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者(其中I期22例，1I期35例，m期19例，IV期12例，年齡3372歲，中位年齡48歲)和46例乳腺良性腫瘤患者(年齡3671歲，中位年齡44歲)的術(shù)前血清。134名對照血清來自健康志愿者(年齡2569歲，中位年齡45歲)，來源于肝功能、腎功能等檢査均正常的體檢人群。受檢者空腹采集靜脈血1mL，采集后立即于4。C冰箱靜置2小時，4°C4000r/min離心IO分鐘分離血清，將血清于4°C12000r/min再次離心5分鐘，去除所有殘留細(xì)胞碎片和不溶物，在冰上將血清分裝為100^/管，共5管，保存于-8(TC冰箱。避免反復(fù)凍融。磁珠操作步驟血清樣品處理從-8(TC冰箱中取出血清，于4°C，10000rpm離心5min。取10叱血清樣品，力卩2(￥LU9處理液(9mol/L尿素，2%CHAPS,1%DTT，50咖ol/LTris-CL'pH9.0)，充分混勻，冰浴振蕩30min后取出，加入360叱結(jié)合緩沖液(100mmol/LNaAc,pH4.0),立即混勻。磁珠上樣及洗脫將處理好的樣品IOO叱加至已裝好WCX磁珠(弱陰離子表面，羧酸基團(tuán)，捕獲正電荷基團(tuán)蛋白)的PCR管中，置磁性處理器上孵育30min，除去液體。加IOO叱磁珠結(jié)合緩沖液(50mmol/LNaAc，pH4.04.3)至已裝好WCX磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作2次。加10MLElutionBuffer2min，洗脫標(biāo)本至上清液。取5叱上清液移至另一個PCR管中，加入5叱SPA飽和溶液充分混勻，取lPL混合溶液加樣到Au或Steel片上，晾干后上機(jī)測量。數(shù)據(jù)收集將處理好的Au或Steel片置入MALDI-TOF-MS進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。在讀取數(shù)據(jù)前，用加有al1-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的芯片校正質(zhì)譜儀，使分子量誤差〈0.1%。本研究中閱讀儀的主要參數(shù)設(shè)定為，最高檢測分子量為50kDa,優(yōu)化分子量范圍100015000Da，最佳聚集中心8000Da，數(shù)據(jù)采集參數(shù)范圍2080，收集總數(shù)為130次。軟件中設(shè)定讀片程序，以讀取數(shù)據(jù)。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強(qiáng)度的最大值。用2746±1Da、5909土1Da、6634土1Da標(biāo)準(zhǔn)峰為質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)定性(分子量)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，使分子量誤差<0.01%，從而獲得的精確的蛋白質(zhì)譜圖譜。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用軟件分析處理所有峰譜，形成蛋白質(zhì)譜圖譜。所有的圖譜都進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)一到它們自己全部的離子總數(shù)(峰面積的總和)。將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至4050y。信號強(qiáng)度的最大值，并且用最顯著的峰進(jìn)行了校正，而后又進(jìn)行了"減少基線"，定義蛋白峰(s/n>5，最小的峰強(qiáng)度〉1.6)。分析所有150kDa之間的蛋白峰，并且仔細(xì)檢查了每個相應(yīng)的峰，計(jì)算出峰的平均值M，標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)和變異系數(shù)(CV%)。用Mann-Whitney〃檢驗(yàn)比較配對樣本的蛋白峰，計(jì)算尸值。乳腺癌檢測多肽蛋白篩選用Mann-Whitney〃檢驗(yàn)比較配對樣本的蛋白峰，CV<510%;初步分析篩選出,〈0.00001的乳腺癌患者與正常人群有11個差異多肽蛋白，不同峰的分子量、臨界峰值均值M及特征蛋白的表達(dá)變化見表一表一乳腺癌患者特征蛋白的表達(dá)變化蛋白分子量(m/z)乳腺癌患者蛋白臨界峰值均值特征蛋白的表達(dá)變化<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表一中向上箭頭"t"為在乳腺癌患者血清中高表達(dá)的上調(diào)特征蛋白；向下箭頭"4"為在乳腺癌患者血清中低表達(dá)的下調(diào)特征蛋白；圖1為乳腺癌及正常人血清中3個差異蛋白峰(3164，3404和4180m/z)的原始質(zhì)譜圖譜；上5張圖譜(C認(rèn)CER)為乳腺癌，下五張圖譜(NORMAL)為正常健康人。其中3404m/z在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，而3164m/z和4180m/z在乳腺癌中表達(dá)升高；將上述11個差異蛋白作為乳腺癌質(zhì)譜檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶卣鞯鞍祝粚?shí)施例2臨床試用及雙盲測試由于多個特征蛋白組合起來才可將乳腺癌與正常人等完全分開，故選取上述11個特征蛋白中的任意兩個或兩個以上的蛋白，根據(jù)各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M，建立了乳腺癌患者與正常人、乳腺良性疾病、乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者兩兩鑒別的血清特征蛋白檢測質(zhì)譜模型(圖2-5)，所說的特異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/z=3164，M》3.30;m/z=3404，M《13.76;m/z=7977，M》14.88;m/z=6116，M《9.71;m/z=4180，M》22.64;m/z=4202，M》1.76;m/z=11683，M^l.88;m/z=8938，M>2.75;其中乳腺癌患者與正常人鑒別的質(zhì)譜模型A由m/z=3164，M》3.30;m/z=3404，M《13.76繪制而成，乳腺癌患者與乳腺良性疾病鑒別的質(zhì)譜模型B由m/z二7977，M》14.88;m/z=6116，M《9.71繪制而成，乳腺癌患者與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鑒別的質(zhì)譜模型C由m/z=4180，M^22.64;m/z=4202，M76繪制而成，乳腺癌患者與乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移鑒別的質(zhì)譜模型D由m/z=11683，M》1.88;m/z=8938，M》2.75繪制而成；分子量(m/z)誤差〈0.01%，臨界峰值均值M的CV<510%。利用該質(zhì)譜模型，只要將受檢者血清中相應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與本發(fā)明質(zhì)譜模型逐一進(jìn)行對比分析，就可用于乳腺癌檢驗(yàn)。利用該質(zhì)譜模型A-D(圖2-5)，將受檢者血清中相應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與本發(fā)明的質(zhì)譜模型逐一進(jìn)行對比分析，經(jīng)臨床試用及雙盲測試，其鑒別乳腺癌患者與正常人的敏感性為100%，特異性為90%;乳腺癌與乳腺良性疾病患者敏感性95%，特異性87%，乳腺癌患者與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移敏感性89%，特異性87%;乳腺癌患者與乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移敏感性81%，特異性98%。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種檢測乳腺癌血清特征蛋白的質(zhì)譜模型，其特征在于從血清中篩選出8個上調(diào)蛋白和3個下調(diào)蛋白作為特征蛋白；選取上述11個特征蛋白中的任意兩個或兩個以上的蛋白，根據(jù)各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M，建立了乳腺癌患者與正常人、乳腺良性疾病、乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者兩兩鑒別的血清特征蛋白質(zhì)譜模型；其中乳腺癌患者與正常人鑒別的質(zhì)譜模型A由m/z＝3164，M≥3.30；m/z＝3404，M≤13.76繪制而成，乳腺癌患者與乳腺良性疾病鑒別的質(zhì)譜模型B由m/z＝7977，M≥14.88；m/z＝6116，M≤9.71繪制而成，乳腺癌患者與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鑒別的質(zhì)譜模型C由m/z＝4180，M≥22.64；m/z＝4202，M≥1.76繪制而成，乳腺癌患者與乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移鑒別的質(zhì)譜模型D由m/z＝11683，M≥1.88；m/z＝8938，M≥2.75繪制而成。2、一種檢測乳腺癌血清蛋白質(zhì)譜模型的制備方法，包括以下步驟1)4'C條件下2小時內(nèi)收集經(jīng)病理明確診斷的乳腺癌患者血清及經(jīng)體檢確定為正常的健康者的血清作為兩組血清標(biāo)本，進(jìn)行一8(TC低溫冷凍備用；2)采用WCX磁珠對所述乳腺癌患者及正常人的兩組血清標(biāo)本的蛋白進(jìn)行吸附；3)用激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的血清蛋白后用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)對結(jié)合在弱陰離子表面的WCX磁珠或C8及C18疏水基質(zhì)磁珠上的兩組血清蛋白進(jìn)行讀取，由此獲得兩組蛋白質(zhì)譜圖譜；4)在每次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集前，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白及質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控0型血清校正儀器，使蛋白質(zhì)分子量誤差<0.0P/。和臨界峰值均值M的CV〈510%，并精確地、定量地收集乳腺癌患者和正常人優(yōu)化的血清質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)；5)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，根據(jù)乳腺癌患者和正常人血清之間蛋白峰的差異，檢測出2組血清蛋白質(zhì)譜圖譜之間有11個穩(wěn)定的差異蛋白及其臨界峰值，8個上調(diào)蛋白和3個下調(diào)蛋白作為特征蛋白；將所述ll個差異蛋白作為乳腺癌蛋白質(zhì)譜模型的特征蛋白；6)選取所述11個特征蛋白中任意兩個或兩個以上的蛋白，以各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M構(gòu)成用于檢測乳腺癌血清特征蛋白質(zhì)譜模型；其中所述的特異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/z=3164，M》3.30;m/z=3404，M《13.76;m/z=7977，M》14.88;m/z=6116，M《9.71;m/z=4180，M》22.64;m/z=4202，M》1.76;m/z=11683，M》1.88;m/z=8938，M>2.75。3、選取如權(quán)利要求1所述的血清11個蛋白中任意兩個或兩個以上的特征蛋白，利用該質(zhì)譜模型，將受檢者血清中相應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與本發(fā)明的質(zhì)譜模型逐一進(jìn)行對比分析，就可應(yīng)用于乳腺癌的早期檢測、篩查和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的評估。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測乳腺癌特征蛋白的優(yōu)化質(zhì)譜模型及其制備方法，屬于質(zhì)譜檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明從血清中篩選出8個上調(diào)蛋白和3個下調(diào)蛋白作為特征蛋白，選取所述11個蛋白中任意兩個或兩個以上的蛋白，根據(jù)各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值，建立了乳腺癌患者與正常人、乳腺良性疾病、乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者兩兩鑒別的血清特征蛋白質(zhì)譜模型；本發(fā)明為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的乳腺癌生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明對于乳腺癌的檢測優(yōu)于目前所采用的任何單一檢測方法，為乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療提供了一種非侵入性技術(shù)，從而為降低乳腺癌的病死率、提高乳腺癌的治愈率，并進(jìn)一步為高危人群篩查乳腺癌提供了一種新方法。文檔編號G01N30/02GK101329346SQ20071011121公開日2008年12月24日申請日期2007年6月18日優(yōu)先權(quán)日2007年6月18日發(fā)明者周云峰,洋許申請人:洋許