專利名稱：多色熒光復合擴增11個肺癌易感性相關snp位點試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于體外一次性復合擴增染色體上肺癌易感性相關的11個 SNP基因座的試劑盒，屬于肺癌易感性檢測領域的發(fā)明。
背景技術：
隨著人類基因組計劃(Human Genome Project)精確序列圖的完成，功能基 因的克隆與鑒定、人類基因組多樣性的研究已成為下一個科技制高點。限制性 片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism RFLP)和微衛(wèi)星多 態(tài)性(microsatellite polymorphisms)作為第一代和第二代遺傳標記，在物理圖 和遺傳圖的構建、序列基圖的拼接和裝搭過程中曾起到了決定性的作用。1996年美國的E. Lander首次提出被稱之為"第三代遺傳標記"的"單核 苷酸多態(tài)性"(single nucleotide polymorphism, SNP)。 SNP是指在染色體基 因組水平上單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性，而其中最少的一種等位 基因在群體中的頻率不小于1%。它包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入及缺失等形 式。SNP具有如下特點首先，SNP位點非常豐富。幾乎分布于整個基因組， 基因組中大約平均每lOOObp就會出現(xiàn)1個SNP，總數(shù)約有300萬個。其次，S NP的突變率較低，每代每堿基突變率約為2 x 10—8。尤其是處于編碼區(qū)的(co ding region) SNP (又稱cSNP)，是高度穩(wěn)定的，而串聯(lián)重復的微衛(wèi)星位點的高 突變率使得對群體的遺傳分析出現(xiàn)困難。第三，具有代表性。cSNP經(jīng)常引起表 達蛋白的多態(tài)性變異，并進而影響他們的功能、特性。第四，擴增片斷短，易
于符合擴增，易實現(xiàn)分析的自動化。目前，人類基因組的研究工作己進入后基因組時代(Post genome Era),研究人員重點在功能基因組學領域，其中包括疾病基因鑒定、基因表達調(diào)節(jié)、人 類多樣性和進化、蛋白質(zhì)結構和功能等各項研究工作。在這種情況下，作為一 類基因研究工具，SNP被廣泛應用于遺傳疾病、人類進化、生物種群多樣性等 方面的研究。SNP與各種疾病關系的研究越來越受到研究人員的重視。如果得出某些SN P或某些SNP的特定組合與特定疾病、特定地區(qū)發(fā)病人群有明顯相關性，就可 以以此SNP作為分子遺傳標記，進行分子標記輔助選擇和疾病預測預防，在流 行病學調(diào)査中確定疾病患者的高危人群，以及進行患病危險程度的評價，建立 有效的預警系統(tǒng)，達到有效的一級預防目的。近年來的研究表明，許多腫瘤易感性與SNP之間具有強相關性，比如 JO CC3( Thr241Met)的Met/Met基因型、丄/G《T1977C)的T等位基因、iL4D57 (G135C)的C等位基因、Z尸D(Lys751Gln)的Lys等位基因分別增加個體患前 列腺癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肺癌的風險。攜帶有此種基因型或單倍 型的個體更易患腫瘤。GSrM《T2517C)的T等位基因增加個體患肺癌的可能性， 而iVg07 ( C609T')的CC基因型增加個體患肺癌的風險，WX7G7(A11656G)的 GG基因型增加肺癌的易感性；Z/WIle658Val、 ，5^Arg72Pro、 Thr706Ala、 ^fiY7 Phe257Ser SNP突變均與肺癌易感性相關；Pro50Ser、 Z尸P Lys751Gln、 Z尸C Lys939Gln 、 ^尸/9"463G->A 、 iT C6V 194Trp/Arg 、 iffi^ Glu346Lys、綴尸V141L、腐6F7 Alal33Ser、 OT， Val432Leu、,臘al762Ala 等SNP突變均增加肺癌的易感性。這些特異性標記可以作為判斷個體某腫瘤易 感性的分子標記，進行疾病預測，從而可確定患某腫瘤的高危人群。SNP基因座的研究大多是逐個位點進行的，檢測手段或者使用測序技術， 或者采用測序或者采用限制性內(nèi)切酶消化的方法，前者技術復雜，費用昂貴； 后者操作繁瑣、準確性差。復合擴增(Multiplex PCR)又稱為多重PCR，即在 一個反應體系中使用多套引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域進行 擴增的過程。它可大幅度地簡化操作程序、節(jié)省時間和試劑，同時能滿足同時 分析不同基因位點的需要?；跈z測體系的不同，目前世界上將復合擴增主要可以分為兩大類硝酸 銀染色復合擴增和熒光復合擴增。前者是復合擴增后的產(chǎn)物利用普通電泳槽分 離，進行硝酸銀染色檢測的方法，方法簡單，成本較低，在普通實驗室可以開 展這個項目。但由于所得結果只是單種顏色，故其復合擴增試劑盒的位點數(shù)不 能太多， 一般1次復合擴增的位點不能超過4個，否則會因為不同位點的擴增 產(chǎn)物互相重疊，難以區(qū)分檢材的基因型。再加上所得結果是用肉眼觀察，所以 其靈敏度受到一定的限制。熒光復合擴增是在普通復合擴增PCR的其中一條引物一端加上熒光標記， 利用自動激光熒光遺傳檢測儀檢測PCR擴增產(chǎn)物，結果準確、靈敏度高、自動 化程度高、可重復性強等。用一種顏色的熒光素標記一組3或4個基因位點(其 擴增片段不能相重疊)，另一種顏色的熒光素標記另一組3或4個基因位點，多 種熒光素則可以標記多組不同的基因位點。目前自動激光熒光遺傳檢測儀可以 檢測幾十種熒光素，但在一個反應體系中，最多可以同時檢測5種熒光素，除 其中一種用作內(nèi)標外，其余四種熒光素可以用于標記產(chǎn)物，加在一起，就可以 達到1次檢測IO個以上的基因位點的目的。熒光復合擴增已成為目前先進的復合擴增方法。
本發(fā)明篩選了 11個已經(jīng)過研究證明與肺癌易感性相關的SNP基因座，根據(jù) 引物特異性PCR的原理，每個SNP基因座設計了 3條引物。在每一個SNP基因 座側(cè)面100-280bp范圍內(nèi)設計了一條引物，作為該基因座的共享引物，并在引 物5，末端選用一種熒光物質(zhì)標記；針對SNP基因座的不同等位基因，又設計了 分別與SNP基因座不同等位基因相匹配的兩條引物，作為特異性引物，引物3' 末端的最后一個堿基分別與SNP基因座不同等位基因的堿基匹配，但由于只有3' 末端的最后一個堿基不匹配往往不能抑制擴增，所以為了防止錯誤性擴增，3' 末端第3或4位堿基人為引入一個錯配堿基，這是引物設計最為關鍵的部分； 最后為了在檢測時自動區(qū)分不同的等位基因，設計引物時兩條引物長度相差4bp (如果兩條引物Tm值相差過大，則人為引入TATA四個堿基，這是引物差異設 計的另一個關鍵，因為TATA對引物的退火溫度影響最小，同時又滿足了擴增片 斷長度不同的要求)，所有引物長度18-28bp，為了便于復合擴增，所有引物的 Tra值保持在60士0.5'C，為了減少引物之間的競爭抑制，對反應體系中不同SNP 位點的引物濃度進行調(diào)整，獲得了最佳引物濃度配比，防止了非特異性擴增片 斷的產(chǎn)生。利用該試劑盒，就能方便地同時對肺癌易感性相關的11個SNP基因 座進行復合擴增，獲得各基因座的基因型結果；同時，利用該試劑盒提供的等 位基因分型標準物，利用基因分析軟件(Genetyper2.5.2)，還可以方便地自動 檢測、分析擴增結果。


圖1為藍色熒光標記物6-FAM的結構式。圖2為黃色熒光標記物6-TAMRA(Tetramethyl-rhodamine)的結構式。圖3為綠色熒光標記物JOE(6-carboxy誦4，，5，-dichloro畫2，，7，-dimethoxy-fluorescein)的結構式。圖4為紅色熒光標記物6-ROX(X-RHODAMINE)的結構式。
具體實施方式
本試劑盒是由分離包裝的11個SNP位點引物混合物、DNA聚合酶、反應緩沖液(含MgC12)、以及11個SNP位點等位基因分型標準物和質(zhì)控DNA構成。11個SNP基因座的引物混合物2. 0ml(不同基因座引物濃度不相同，從30nM-240 nM，每個20ul的復合PCR反應體系中用量為2ul); DNA聚合酶1000u (5u/pl每個20ul的復合PCR反應體系中用量為lu);緩沖液2. Oml (10倍濃縮緩沖液，每個20ul的復合PCR反應體系中用量為2ul);等位基因分型標準物混合物總量1 ml (40nM，供1000次檢測使用)，等位基因分型標準物混合物中所含各個基因座的等位基因分型標準物等量；質(zhì)控DNAO. lml (10ng/ul)。熒光復合擴增的技術核心主要在于引物序列與熒光標記的位置以及各種引 物的濃度配比。在本發(fā)明試劑盒中，11個SNP位點均為已有研究表明與肺癌易 感性密切相關的基因座，其參考序列均可通過NCBI查閱，ll個SNP位點的名錄為IL4SOT(Alal33Ser) ， MBZ)《Glu346Lys) ， APZ)(Lys751Gln) , A3 CC/(194Trp/Arg)， ^LD戶i rO/7624/") ， CTil 5/(Val432Leu)， 及五K/(Phe257Ser) ， APC(Lys939Gln)， GSrM^(T2517C)， ^A7iV2(Pr。5。Ser)，戶丄O/(Thr706Ala)。11個肺癌易感性相關SNP位點引物序列為RASSFl-pub-5，-Fl-GAAGCCCTGGGTTCCTCAA-3， (RASSF1位點共享引物， Fl熒光素標記)RASSF 1 -spe 1 -5 ，-GATCTTCTGCTCAATCTCGGC-3 ， ( RASSF1位點特異性弓I物 1，針對C等位基因)RASSFl-spe2-5，-TATAGATCTTCTGCTCAATCTCGGA -3， (RASSF1位點特異 性引物2，針對A等位基因)MBD4-pub-5 ，-F1-TTTCCTGGTTGGTGAGCAGTT-3 ， ( MBD4位點共享引物，F(xiàn)l熒光素標記)MBD4-spel-5，-GCCAAAGACTCAGAACACACCA-3， (MBD4位點特異性引物 1，針對A等位基因)MBD4-spe2-5，- TATATCCAAAGACTCAGAACACATCG-3， (MBD4位點特異性 引物2，針對G等位基因)XPD-pub-5，-Fl-CGGACATCTCCAAATTCATTCA-3， (XPD位點共享引物，F(xiàn)l 熒光素標記)XPD—spel-5，-CTGAGCAATCTGCTCTATCCTGTT-3， (XPD位點特異性引物1， 針對T等位基因)XPD -spe2-5，-TATACTGAGCAATCTGCTCTATCCTATG-3， (XPD位點特異性引 物2，針對G等位基因)
XRCCl-pub-5，-Fl-TCCAGACAAAGATGAGGCAGAG-3， (XRCC1位點共享引 物，F(xiàn)l熒光素標記)XRCC1 -spe 1 -5 ，-CTGGGGATGTCTTGTTGAACC-3 ， ( XRCC1位點特異性引物1，針對G等位基因)XRCC 1 -spe2-5 ，匿TATATTGGGGATGTCTTGTTGAGCT-3 ， ( XRCC 1位點特異性 引物2，針對A等位基因)ADPRT-pub-5，-F2-CAGCAGGAGGGTTTGCCA-3， (ADPRT位點共享引物，F(xiàn)2 熒光素標記)ADPRT-spel-5，-AGCAGGTTGTCAAGCATTTACG-3， (ADPRT位點特異性引 物l，針對C等位基因)ADPRT-spe2-5，-TATAAGCAGGTTGTCAAGCATTTACA-3， (ADPRT位點特異 性引物2，針對T等位基因)CYPlBl-pub-5，畫F2-GAGGGACCGTCTGCCTTGTA-3， (CYP1B1位點共享引物， F2熒光素標記)CYPlBl-sepl-5，-CCGGGTTAGGCCACTTGAG-3， (CYP1B1位點特異性引物1， 針對C等位基因)CYPlBl-s印2-5，-TATACCGGGTTAGGCCACTTTAC-3， (CYP1B1位點特異性引 物2,針對G等位基因)REVl-pub-5，-F2-AGTCAATGGCATGAACAGTTGG-3， (REV1位點共享引物，F(xiàn)2熒光素標記)REVl-spel-5，-CCTTATCCTCCTCCTGGGAAA-3， (REV1位點特異性引物1， 針對T等位基因)REVl-spe2-5，-TATACCTTATCCTCCTCCTGGGTAG-3' (REV1位點特異性引物 2，針對C等位基因)XPC-pub-5，-F2-TGATTACTAACCCTCGCCTGTG-3， (XPC位點共享引物，F(xiàn)2 熒光素標記)XPC-spel-5'-GGCGCTCAGCTCACAGGTT-3， (XPC位點特異性引物1，針對 A等位基因)XPC —spe2-5，-TATAAGCGCTCAGCTCACAGTTG-3， (XPC位點特異性引物2, 針對C等位基因)GSTM4-pub-5 ，-F3-GGAAAGGCGTCCAAGCAGT-3 ， ( GSTM4位點共享引物，F(xiàn)3熒光素標記)GSTM4-sepl-5，-GGCCATGGTTTGTTGGACAC-3， (GSTM4位點特異性引物1， 針對C等位基因)GSTM4-sep2-5，-TATAGGCCATGGTTTGTTGGATAT—3， (GSTM4位點特異性引 物2，針對T等位基因)AXIN2-pub-5，-F4-CAGCAGCAGCTTCCGTGAG-3， (AXIN2位點共享引物，F(xiàn)4 熒光素標記)AXIN2-spe 1 -5 ，-CCTGGTGTTGGAAGAGACTGG-3 ， ( AXIN2位點特異性引物1，針對C等位基因)AXIN2-spe2-5，TATACCTGGTGTTGGAAGAGACCGA-3， (AXIN2位點特異性 引物2，針對T等位基因)PLOI-pub-5，—F4-CAGATAGCCATAAGCAAACAGTAGC-3， (PLOI位點共享引 物，F(xiàn)4熒光素標記)PLOI-spel-5，-ATGTGGAAATCTGATCCGGC-3， (PLOI位點特異性引物1，針 對G等位基因)PLOI-spe2-5，-TATAATGTGGAAATCTGATCCGGT-3， (PLOI位點特異性引物2， 針對A等位基因)四種熒光素的名稱和結構分別為Fl:藍色熒光標記物6-FAM，結構式為圖l。F2:黃色熒光標記物6-TAMRA(Tetramethyl-rhodamine)，結構式為圖2。F3:纟錄色熒光豐示"i己物JOE(6曙carboxy-4，,5，一dichloro國2，，7，-dimethoxy國fluorescein)，'結構式為圖3。F4:紅色熒光標記物6-ROX(X-RHODAMINE)，結構式為圖4。 需要說明的是四種熒光標記物可以互換。上述引物的設計是極為關鍵的，其設計需要考慮以下幾個方面的要素(1)、 所有位點同時得到擴增，即所有引物對的退火溫度須相近；(2)引物之間不形 成引物二聚體；(3)、不形成二級結構。本發(fā)明的試劑盒中包含了上述11個SNP基因座的所有引物，每個位點3條
引物，其中一條是共享引物，分別用不同的熒光素標記，另外兩條引物針對不同的SNP等位基因設計，與共享引物分別配對擴增不同的等位基因，由于引物 長度不同，所以不同的等位基因擴增產(chǎn)物長度不同， 一般相差4bp，通過自動激 光熒光遺傳檢測儀檢測，就可以根據(jù)產(chǎn)物長度的不同區(qū)分不同的等位基因，如 果是純合子，只能得到l個產(chǎn)物峰；而如果是雜合子，則可以得到兩個產(chǎn)物峰。
對于SNP等位基因的檢測，最直接最準確的方法是基因測序，但這種方法 只能逐個位點進行，效率低下、技術要求高而且費用昂貴；其次常用的方法是 根據(jù)SNP位點的等位基因，尋找適合的限制性內(nèi)切酶，根據(jù)限制性內(nèi)切酶消化 后產(chǎn)物長度的不同，區(qū)分不同的等位基因，但這種方法也只能逐個位點SNP進 行檢測，而且有時會由于酶的消化不完全而得出錯誤結論，所以具有效率低下、 準確性差的缺點。本方法將11個SNP位點在一個反應管中同時擴增，同時檢測， 效率大大提高，結合基因分析軟件(GenoTyper2.5.2)可以自動對結果進行分 析， 一天可以完成上百例樣品的檢測；由于熒光檢測具有高靈敏性，所以檢測 所需要的樣品量極其微量， 一次只需要5-10ng;不同等位基因的擴增產(chǎn)物長度 相差4bp，完全能滿足檢測的要求；通過調(diào)試引物濃度，獲得了最佳引物濃度配 比，可以有效抑制非特異性擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)；本試劑盒中選擇的SNP位點均位 肺癌易感性相關基因位點，可以在肺癌易感風險預測中發(fā)揮重要作用，達到一 級預防的目的。
在進行復合擴增反應時，可在PCR反應體系中同時加入本試劑盒中分離包 裝的引物混合物、DNA聚合酶、緩沖液和常規(guī)反應所需的四種脫氧核苷三磷酸， 就可以進行有效地PCR擴增。具體反應體系如下-樣品DNA (5-10ng) lul 引物混合物 2uldNTPs 1. 6ul緩沖液 2ulDNA聚合酶 0. 2ul (lu)無菌去離子水補充至 20ul本發(fā)明的試劑盒中還提供了用于規(guī)范不同實驗室檢驗結果的質(zhì)控DNA樣品 和11個SNP位點等位基因分型標準物(Ladder),質(zhì)控DNA樣品是已經(jīng)過測序 確證了的按照本試劑盒的操作說明能夠準確分型的DM樣品，可以作為陽性對 照或標準DNA樣品使用；等位基因分型標準物是發(fā)明人收集了所有11個SNP位 點所有等位基因的擴增產(chǎn)物，用于基因分析軟件自動分型時作為標準使用，采 用該等位基因分型標準物，可以快速、準確對檢測結果進行分型；同時只要將 等位基因分型標準物與樣本PCR擴增產(chǎn)物同步電泳，不同的實驗室，不同的設 備，不同的電泳方法，均可得到一致的可重復性結果，可以用于規(guī)范不同實驗 室的檢測結果，避免了因電泳引起的誤差。本發(fā)明試劑盒能夠高效率地對ll個肺癌易感性相關的SNP基因座進行復合 擴增，通過自動熒光測序儀進行檢測分型，達到高自動化水平，實驗結果準確、 可重現(xiàn)性好的目的，本發(fā)明的試劑盒用于肺癌預測和風險性評價具有很大的優(yōu) 勢和潛力。
權利要求
1、一種11個肺癌易感性相關SNP位點多色熒光復合擴增試劑盒，該試劑盒包括a)引物混合物，b)DNA聚合酶，c)緩沖液(含MgCl2)，d)質(zhì)控DNA，e)等位基因分型標準物混合物，其特征是引物混合物由11條熒光標記共享引物和22條針對不同等位基因的長度特異性引物組成；分別針對11個肺癌易感性相關SNP基因位點，分別為RASSF1(Ala133Ser)，MBD4(Glu346Lys)，XPD(Lys751Gln)，XRCC1(194Trp/Arg)，ADPRT(Val762Ala)，CYP1B1(Val432Leu)，REV1(Phe257Ser)，XPC(Lys939Gln)，GSTM4(T2517C)，AXIN2(Pro50Ser)，PLOI(Thr706Ala)。
2、 一種長度特異性PCR引物設計方法，其特征是在每一個SNP基因位點側(cè)面設計一條共享引物，并在引物5'末端選用一種熒光物質(zhì)標記;針對SNP基 因位點的不同等位基因，又設計了針對SNP基因座不同等位基因的兩條引物， 兩條引物長度不同，作為特異引物。
3、 根據(jù)權利要求1所述的11個肺癌易感性SNP基因位點引物序列為RASSFl-pub-5，-Fl-GAAGCCCTGGGTTCCTCAA-3， (RASSF1位點共享引物， Fl熒光素標記)RASSF1畫spe 1 -5 ，國GATCTTCTGCTCAATCTCGGC-3 ， ( RASSF1位點特異性引物 1，針對C等位基因)RASSFl誦spe2國5，誦TATAGATCTTCTGCTCAATCTCGGA -3， (RASSF1位點特異 性引物2，針對A等位基因)MBD4-pub-5 ，-Fl-TTTCCTGGTTGGTGAGCAGTT-3 ， (MBD4位點共享引物，F(xiàn)l熒光素標記)MBD4-spel-5，-GCCAAAGACTCAGAACACACCA-3， (MBD4位點特異性引物 1，針對A等位基因) MBD4-spe2國5 ，國TATATCCAAAGACTCAGAACACATCG-3 ， (MBD4位點特異性 引物2，針對G等位基因)XPD-pub-5，-Fl-CGGACATCTCCAAATTCATTCA-3， (XPD位點共享引物，F(xiàn)l 熒光素標記)XPD—spel-5，-CTGAGCAATCTGCTCTATCCTGTT-3， (XPD位點特異性引物1， 針對T等位基因)XPD—spe2-5，-TATACTGAGCAATCTGCTCTATCCTATG-3， (XPD位點特異性引 物2,針對G等位基因)XRCC1 -pub-5 ， -Fl -TCCAGACAAAGATGAGGC AGAG-3 ， ( XRCC1位點共享引物，F(xiàn)l熒光素標記)XRCCl-spel-5，-CTGGGGATGTCTTGTTGAACC-3， (XRCC1位點特異性引物 1，針對G等位基因)XRCC 1 -spe2-5 ， -TATATTGGGGATGTCTTGTTGAGCT—3, ( XRCC 1位點特異性 引物2，針對A等位基因)ADPRT—pub-5，—F2-CAGCAGGAGGGTTTGCCA-3， (ADPRT位點共享引物，F(xiàn)2 熒光素標記)ADPRT-spe 1 -5，-AGCAGGTTGTCAAGCATTTACG-3， ( ADPRT位點特異性弓I 物l，針對C等位基因)ADPRT—spe2-5，畫TATAAGCAGGTTGTCAAGCATTTACA-3， (ADPRT位點特異 性引物2，針對T等位基因)CYPlBl誦pub-5，-F2國GAGGGACCGTCTGCCTTGTA-3， (CYP1B1位點共享引物， F2熒光素標記)CYPlBl-sepl-5，-CCGGGTTAGGCCACTTGAG-3， (CYP1B1位點特異性引物1， 針對C等位基因)CYP1B1-sep2畫5，誦TATACCGGGTTAGGCCACTTTAC-3， (CYP1B1位點特異性引 物2，針對G等位基因)REV 1 -pub- 5 ， -F2-AGTC AATGGC ATGAAC AGTTGG-3 ， ( REV 1位點共享引物，F(xiàn)2熒光素標記)REVl-spel-5，-CCTTATCCTCCTCCTGGGAAA-3， (REV1位點特異性引物1， 針對T等位基因)REVl-spe2-5，-TATACCTTATCCTCCTCCTGGGTAG-3' (REV1位點特異性引物 2，針對C等位基因)XPC-pub畫5，-F2畫TGATTACTAACCCTCGCCTGTG-3， (XPC位點共享引物，F(xiàn)2 熒光素標記)XPC —spel-5，-GGCGCTCAGCTCACAGGTT-3， (XPC位點特異性引物1 ，針對 A等位基因)XPC —spe2-5，-TATAAGCGCTCAGCTCACAGTTG-3， (XPC位點特異性弓|物2， 針對C等位基因) GSTM4-pub-5 ，-F3-GGAAAGGCGTCCAAGCAGT-3 ， ( GSTM4位點共享引物，F(xiàn)3熒光素標記)GSTM4-sepl-5，-GGCCATGGTTTGTTGGACAC-3， (GSTM4位點特異性引物1, 針對C等位基因)GSTM4-sep2-5，-TATAGGCCATGGTTTGTTGGATAT—3， (GSTM4位點特異性引 物2，針對T等位基因)AXIN2-pub-5，-F4-CAGCAGCAGCTTCCGTGAG-3， (AXIN2位點共享引物，F(xiàn)4 熒光素標記)AXIN2-spe 1 -5 ，-CCTGGTGTTGGAAGAGACTGG-3 ， ( AXIN2位點特異性引物1，針對C等位基因)AXIN2-spe2-5，TATACCTGGTGTTGGAAGAGACCGA-3， (AXIN2位點特異性 引物2，針對T等位基因)PLOI—pub-5 ，—F4-CAGATAGCCATAAGCAAACAGTAGC-3 ， ( PLOI位點共享引物，F(xiàn)4熒光素標記)PLOI-spel-5，-ATGTGGAAATCTGATCCGGC-3， (PLOI位點特異性引物1，針 對G等位基因)PLOI—spe2-5，-TATAATGTGGAAATCTGATCCGGT-3， (PLOI位點特異性引物2， 針對A等位基因)四種熒光素的名稱分別為Fl:藍色熒光標記物FAM; F2:黃色熒光標記物TAMRA; F3:綠色熒光標記　物JOE; F4:紅色熒光標記物ROX;四種熒光標記物可以互換。
4、根據(jù)權利要求1所述的一種11個肺癌易感性相關SNP位點多色熒光復 合擴增試劑盒，其特征是各組份的用量比為11個SNP基因座的引物混合物 2.0ml (不同基因座引物濃度不相同，從30nM-240 nM，每個20ul的復合PCR反 應體系中用量為2ul); DNA聚合酶lOOOu (5u/pl每個20ul的復合PCR反應 體系中用量為lu);緩沖液2. Oml (IO倍濃縮緩沖液，每個20ul的復合PCR反 應體系中用量為2ul);等位基因分型標準物混合物總量1 ml (40nM，供1000 次檢測使用)，等位基因分型標準物混合物中所含各個基因座的等位基因分型標 準物等量；質(zhì)控DNAO. lml (10ng/ul)。
5、根據(jù)權利要求2所述的一種長度特異性PCR引物設計方法，其特征是 針對每個SNP位點不同的等位基因，兩條特異性引物3'末端的最后一個堿基 分別與SNP基因座不同等位基因的堿基匹配，并在3'末端第3或4位堿基人為 引入一個錯配堿基； 一條引物的5'端人為增加TATA四個堿基，兩條特異性引 物長度相差4bp;所有引物的Tm值盡可能保持一致，相差不超過rC。
6、 根據(jù)權利要求1所述的一種11個肺癌易感性相關SNP位點多色熒光復 合擴增試劑盒，在快速、準確檢測肺癌易感性SNP基因型中的應用。７、 根據(jù)權利要求2所述的一種長度特異性PCR引物設計方法，在SNP位點 等位基因檢測中引物設計的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于體外一次性多色熒光復合擴增肺癌易感性相關的11個SNP基因座的試劑盒，是由分離包裝的引物混合物、DNA聚合酶、緩沖液、質(zhì)控DNA樣品和等位基因分型標準物混合物構成。引物混合物由11條熒光標記的共享引物和22條針對不同等位基因的長度特異性引物組成，具體組成為引物混合物2.0ml(不同基因座引物濃度不相同，從30nM-240nM)；DNA聚合酶1000u；緩沖液2.0ml；等位基因分型標準物混合物總量1ml；質(zhì)控DNA0.1ml(10ng/ul)。本發(fā)明在最佳引物配比條件下，可快速、準確獲得11個肺癌易感性相關的SNP位點的基因型。
文檔編號G01N21/00GK101158633SQ20071011277
公開日2008年4月9日 申請日期2007年6月17日 優(yōu)先權日2007年3月24日
發(fā)明者王瑞恒 申請人:遼寧師范大學