專利名稱：同時(shí)檢測(cè)ToRCH感染的免疫層析試紙及制備方法
同時(shí)檢測(cè)torch感染的免疫層析試紙及制備方法背景技術(shù)本發(fā)明涉及一種層析試紙及其制備方法，尤其涉及一種同時(shí)檢測(cè)torch感染的免疫層析 試紙及制備方法。
技術(shù)背景ToRCH是弓形體(Toxoplasma gondii, Tox)、風(fēng)疹病毒(Rubella Virus, RubV)、巨細(xì)胞病毒 (Cytomegalovirus, CMV)、單純皰疹病毒(Herpes simplex Virus, HSV)的英文名稱殺頭組合，是可 導(dǎo)致先天性宮內(nèi)感染及圍產(chǎn)期感染而引起圍產(chǎn)兒畸形的病原體。孕婦torch感染多無(wú)臨床癥狀，為隱型感染，診斷胎兒有無(wú)宮內(nèi)感染應(yīng)首先確定孕婦是 否感染，孕婦torch感染對(duì)優(yōu)生優(yōu)育與人口素質(zhì)構(gòu)成很大的威脅，因此對(duì)孕期進(jìn)行ToRCH篩 查是十分必要的。目前醫(yī)院及計(jì)劃生育服務(wù)部門確定孕早期或孕前婦女是否有torch感染， 需要同時(shí)檢測(cè)這四項(xiàng)指標(biāo)。臨床上檢測(cè)ToRCH感染常用的是elisa法，其操作程序比較復(fù)雜， 檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不適應(yīng)孕婦感染的快速診斷和懷孕人群的篩査。層析試紙作為一種快速的檢測(cè)工具，在早孕檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。受其啟發(fā)，在一 些其他的疾病檢測(cè)中人們也采用了層析試紙，而且為了能同時(shí)進(jìn)行多種疾病的檢測(cè)，人們?cè)?一張層析試紙上依次設(shè)置了檢測(cè)線，通過(guò)其變色反應(yīng)檢測(cè)疾病。但這種層析試紙它的膠體金 結(jié)合物墊上涂的膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合物濃度是一定的。若結(jié)合物墊涂的過(guò)高，用其所裝配的 試紙條檢測(cè)標(biāo)本，層析膜上的本底顏色會(huì)深，并且易發(fā)生非特異性反應(yīng)即檢測(cè)標(biāo)本會(huì)出現(xiàn)假 陽(yáng)性結(jié)果情況；若涂的過(guò)低，用其所裝配的試紙條檢測(cè)靈敏度會(huì)達(dá)不到要求，標(biāo)本可能會(huì)出 現(xiàn)漏檢情況。當(dāng)在層析膜上同時(shí)包被固定兩種以上檢測(cè)項(xiàng)目抗原，包被線長(zhǎng)度相同，并間隔 一定距離平行向后排列，固化的層析膜裝配成試紙條。當(dāng)用此試紙條檢測(cè)含有兩種以上病原 體抗體血標(biāo)本時(shí)，膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合物與第一條檢測(cè)線形成復(fù)合物后，剩余的膠體金標(biāo)記 抗體結(jié)合物再與下一個(gè)檢測(cè)線反應(yīng)時(shí)，由于濃度下降檢測(cè)靈敏度會(huì)降低，當(dāng)它"流到"第三 條檢測(cè)線反應(yīng)時(shí)，由于濃度更低，反應(yīng)檢測(cè)靈敏度會(huì)更低，標(biāo)本會(huì)出現(xiàn)假陰性情況。尤其當(dāng)血標(biāo)本與第一條檢測(cè)線呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，在第一條檢測(cè)線處形成復(fù)合物會(huì)多，肉 眼觀察表現(xiàn)為檢測(cè)線紅色帶更加明顯，剩余的膠體金標(biāo)記抗體濃度就會(huì)更少，那么在第二個(gè) 檢測(cè)線反應(yīng)靈敏度就會(huì)更低，標(biāo)本出現(xiàn)漏檢情況就會(huì)更嚴(yán)重。還有人提出將多張層析試紙集成到一個(gè)盒體進(jìn)行檢測(cè)，但其也存在一定問(wèn)題，比如當(dāng)加樣量太少流不到檢測(cè)區(qū)時(shí)，它需要在緩沖液加入?yún)^(qū)(b)處滴2滴緩沖液，該緩沖液在溶解固 相膠體金標(biāo)記抗人IgG/lgM抗體的同時(shí)"沖向"硝酸纖維素膜過(guò)程中同時(shí)稀釋血清，并一起 帶入固化層析膜，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。逆向膠體金檢測(cè)torch免疫層析試紙條沒有表現(xiàn)出想 要得到的結(jié)果，且操作繁瑣，需要兩步加樣。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了克服目前在一條試紙上進(jìn)行多種病原體檢測(cè)時(shí)其靈敏度不高等問(wèn)題，提供一種具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，使用方便，靈敏度髙等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)torch感染的免疫層析試紙及制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種同時(shí)檢測(cè)torch感染的免疫層析試紙，它包括基板，基板上粘接層析膜，在層析膜 上包被固定至少兩種特定檢測(cè)線，在層析膜下端依次粘有膠體金結(jié)合物墊、樣品墊，在層析 膜上端為吸收墊，所述檢測(cè)線以交錯(cuò)排布在層析膜上，吸收墊上有與層析膜上的具體檢測(cè)線相對(duì)應(yīng)的標(biāo)識(shí)區(qū)，本試紙條用來(lái)同時(shí)檢測(cè)人是否有特異性IgG或IgM感染。所述檢測(cè)線排布時(shí)按照階梯式交錯(cuò)排布。 所述檢測(cè)線排布時(shí)以波浪式交錯(cuò)排布。一種同時(shí)檢測(cè)TORCH感染的免疫層析試紙的制備方法，它的步驟為， 1)在層析膜上以交錯(cuò)排布方式包被固定至少兩種特定檢測(cè)線；
2) 制作膠體金結(jié)合物墊；3) 將固相化的層析膜與膠體金結(jié)合物墊、樣品墊、吸收墊按比例重疊在一起，裝配成試 紙條。所述步驟l)中，層析膜上包被抗原的制備方法為用pH-7.6、 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液 分別將多種檢測(cè)抗原、膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體稀釋到l-2mg/ml作為包被應(yīng)用液；在硝酸纖 維素膜上端用膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體包被應(yīng)用液劃線，做為質(zhì)控線即C線，然后在質(zhì)控線 下方包被與給抗原相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)線Tn,各檢測(cè)線Tn交錯(cuò)分布，將己包被好的NC膜放置室溫干燥,供裝配試紙用o所^步驟2)中，膠體金結(jié)合物墊的制備方法為a、 將氯金酸配制成0.01%水溶液，取100ml加熱煮沸，攪拌下加入1.5-2.0ml的1%檸檬 酸鈉溶液，直到溶液顏色穩(wěn)定成酒紅色，即得到膠體金溶液；b、 用0.2mol/L K2C03溶液將膠體金溶液調(diào)pH值至7.6,攪拌下將抗人IgM或抗人IgG 抗體5ug/ml用量加入膠體金溶液中混合，然后加入10%BSA溶液lOrnl，將標(biāo)記好的膠體金結(jié) 合物10000- 14000r/min離心30-60分鐘，棄上清，將沉淀用含1%BSA的磷酸鹽(PBS)緩沖 液懸浮，恢復(fù)原體積后再離心，如此洗滌2 4次。最后將沉淀懸浮于3A0體積含1%BSA的 PBS緩沖液中，然后將此膠體金結(jié)合物溶液均勻涂在玻璃纖維上，冷凍干燥,密封備用。本發(fā)明的試紙條具有一次檢測(cè)，即可知是否有torch四種病原體感染，在圍產(chǎn)期檢査中 具有很大的應(yīng)用價(jià)值。本試紙條提供的這種同時(shí)檢測(cè)torch感染的免疫層析試紙，其方法是 將弓形蟲抗原、風(fēng)疹病毒抗原、巨細(xì)胞病毒抗原、單純皰疹病毒抗原分別在硝酸纖維素膜上的不同位置交錯(cuò)包被成線，通過(guò)膠體金標(biāo)記抗人IgM或抗人IgG顯色，來(lái)同時(shí)檢測(cè)人血清中 針對(duì)抗原的特異性IgM或IgG抗體。本試紙條既克服了單測(cè)試紙條一次只能檢測(cè)一種病原體 的缺點(diǎn)，又避免了在一個(gè)層析條上同時(shí)做幾個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)時(shí)前面檢測(cè)線形成的復(fù)合物會(huì)影響 后面的檢測(cè),在靈敏度上受到很大限制的缺陷。本發(fā)明的有益效果是它在層析膜上對(duì)同時(shí)包被至少兩種特定檢測(cè)線，是以交錯(cuò)排布形式來(lái)完成的，避免了上述的缺陷，又^:服了單測(cè)試紙條一次只能檢測(cè)一種病原體抗體的缺點(diǎn)，本試紙條具有操作方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、不需要特殊儀器設(shè)備、觀察結(jié)果直觀等顯著優(yōu)點(diǎn)。


圖l為本發(fā)明第一實(shí)施例結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為本發(fā)明第二實(shí)施例結(jié)構(gòu)示意圖； 圖3為本發(fā)明第三實(shí)施例結(jié)構(gòu)示意圖。其中，1、樣品墊，2、膠體金結(jié)合物墊，3、固相化層析墊，4、吸收墊。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。 實(shí)施例l:層析試紙條整體外觀形式在一個(gè)12*80mm的PVC板上粘著一張12*25mm的層析膜， 層析膜上包被固定有弓形蟲抗原、風(fēng)疹病毒抗原、巨細(xì)胞病毒抗原、單純皰疹病毒ll型抗原、 膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體，形成固相化的層析膜3，其上的檢測(cè)線呈階梯狀交錯(cuò)分布，層析 膜的下端依次粘有膠體金結(jié)合物墊2、樣品墊l (玻璃纖維)，層析膜的上端粘有吸收墊4 (棉 漿板)，吸收墊4上有與層析膜上包被的具體抗原相對(duì)應(yīng)的標(biāo)識(shí)區(qū)，如圖1所示。實(shí)施例2:層析試紙條整體外觀形式在一個(gè)12*80mm的PVC板上粘著一張12*25mm的層析膜， 層析膜上包被固定有弓形蟲抗原、風(fēng)疹病毒抗原、巨細(xì)胞病毒抗原、單純皰疹病毒ll型抗原、 膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體，形成固相化的層析膜3，其上的檢測(cè)線呈波浪形交錯(cuò)分布，層析 膜的下端依次粘有膠體金結(jié)合物墊2、樣品墊l (玻璃纖維)，層析膜的上端粘有吸收墊4 (棉 漿板)，吸收墊4對(duì)應(yīng)的抗原區(qū)域標(biāo)明具體的檢測(cè)抗體名稱，如圖2所示。實(shí)施例3:
層析試紙條整體外觀形式在一個(gè)15*80mm的PVC板上粘著一張15*25mm的層析膜， 層析膜上包被固定有弓形蟲抗原、風(fēng)疹病毒抗原、巨細(xì)胞病毒抗原、單純皰疹病毒l型抗原、 單純皰疹病毒II型抗原、膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體，形成固相化的層析膜3，其上的檢測(cè)線 呈階梯狀交錯(cuò)分布，層析膜的下端依次粘有膠體金結(jié)合物墊2、樣品墊l (玻璃纖維)，層析 膜的J:端粘有吸收墊4 (棉漿板)，吸收墊4對(duì)應(yīng)的抗原區(qū)域標(biāo)明具體的檢測(cè)抗體名稱，如圖 3所示。
本發(fā)明試紙的制備方法為
(一) 層析膜包被抗原的制備用pH-7.6 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液分別將弓形蟲抗原、風(fēng)疹病毒抗原、巨細(xì)胞病毒抗原、 單純皰疹病毒l型抗原、單純皰疹病毒ll型抗原、膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體稀釋到l-2mg/ml 作為包被應(yīng)用液。
在距離硝酸纖維素膜(NC膜)上端6nm處將膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體包被應(yīng)用液劃一條 15mm長(zhǎng)的線，做為質(zhì)控線(C線)，然后在質(zhì)控線向下4mm處包被一條3mm長(zhǎng)的檢測(cè)線l(Tl)為弓形蟲抗原，在Tl橫線終止處垂直向下間距2mm處再包被一條3mm長(zhǎng)的檢測(cè)線 2(T2)為風(fēng)疹病毒抗原,在T2橫線終止處垂直向下間距2mm處包被一條3mm長(zhǎng)的檢測(cè)線3(T3) 為巨細(xì)胞病毒抗原，T3橫線終止處垂直向下間距2mm處包被一條3mm長(zhǎng)的檢測(cè)線4 (T4) 為單純皰疹病毒I型抗原，T4橫線終止處垂直向下間距2mm處包被一條3mm長(zhǎng)的檢測(cè)線5(T5)為單純皰疹病毒II型抗原。將己包被好的NC膜室溫放置干燥，供裝配試紙用。
(二) 膠體金結(jié)合物墊的制備
1、 將氯金酸(HAuCI4)配制成0.01%水溶液，取100ml加熱煮沸，攪拌下加入1.5-2.0ml 的1%檸檬酸鈉溶液，直到溶液顏色穩(wěn)定成酒紅色，即得到膠體金溶液。2、 用0.2mol/L K2C03溶液將膠體金溶液調(diào)pH值至7.6，攪拌下將抗人IgM抗體或抗人 IgG抗體5ug/ml用量加入膠體金溶液中混合，然后加入10%BSA溶液lOml。將標(biāo)記好的膠體 金結(jié)合物10000-14000r/min離心30-60分鐘，棄上清，將沉淀用含1%BSA的磷酸鹽(PBS) 緩沖液懸浮，恢復(fù)原體積后再離心。如此洗滌2~4次。最后將沉淀懸浮于1/10體積含1%BSA 的PBS緩沖液中，然后將此膠體金結(jié)合物溶液均勻涂在玻璃纖維上，冷凍干燥,密封備用。
(三) 免疫層析檢測(cè)條的制備
按第一步驟(試紙條整體外觀形式)方法將固相化的層析膜與膠體金結(jié)合物墊、樣品墊、 吸收墊等按一定比例重疊在一起，裝配成試紙條。 二、免疫層析檢測(cè)條的結(jié)果判斷1、 取人血清標(biāo)本200ul加在層析檢測(cè)條的樣品墊上，靜置10-20分鐘觀察結(jié)果，若只有 一條紅色質(zhì)控線(C線)出現(xiàn)，則判為陰性；若有一條紅色質(zhì)控線(C線)出現(xiàn)，同時(shí)在包被 有Tox、 RubV、 CMV、 HSV-I、 HSV-II抗原特定位置出現(xiàn)紅色帶，則判為陽(yáng)性，哪個(gè)特定位置出 現(xiàn)紅色帶則判定是什么病原體抗體陽(yáng)性；若無(wú)任何紅色帶出現(xiàn)則判定本試紙條失效。2、 若膠體金結(jié)合物墊中涂的是膠體金標(biāo)記抗人IgG，那么裝配的試紙條是用于檢測(cè)人血 清中的ToRCH-lgG抗體。若膠體金結(jié)合物墊中涂的是膠體金標(biāo)記抗人IgM,那么裝配的試紙條是用于檢測(cè)人血 清中的ToRCH-lgM抗體。
權(quán)利要求
1、一種同時(shí)檢測(cè)ToRCH感染的免疫層析試紙，它包括基板，基板上粘接層析膜，在層析膜上包被固定至少兩種特定抗原檢測(cè)線，在層析膜下端依次粘有膠體金結(jié)合物墊、樣品墊，在層析膜上端為吸收墊，其特征是所述檢測(cè)線以交錯(cuò)排布在層析膜上，吸收墊上有與層析膜上的具體檢測(cè)線相對(duì)應(yīng)的標(biāo)識(shí)區(qū)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的同時(shí)檢測(cè)TORCH感染的免疫層析試紙，其特征是所述檢測(cè)線 排布時(shí)按照階梯式交錯(cuò)排布。
3、 根據(jù)權(quán)利要求i所述的同時(shí)檢測(cè)torch感染的免疫層析試紙，其特征是所述檢測(cè)線排布時(shí)以波浪式交錯(cuò)排布。
4、 一種權(quán)利要求i所述同時(shí)檢測(cè)torch感染的免疫層析試紙的制備方法，其特征是它的步驟為，1) 在層析膜上以交錯(cuò)排布方式包被固定至少兩種特定檢測(cè)線；2) 制作膠體金結(jié)合物墊；3) 將固相化的層析膜與膠體金結(jié)合物墊、樣品墊、吸收墊按比例重疊在一起，裝配成試 紙條。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的同時(shí)檢測(cè)ToRCH感染的免疫層析試紙的制備方法，其特征是 所述步驟l)中，層析膜上包被抗原的制備方法為用pH-7.6、 O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液分別 將多種檢測(cè)抗原、膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體稀釋到l-2mg/ml作為包被應(yīng)用液；在硝酸纖維素 膜上端用膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體包被應(yīng)用液劃線，做為質(zhì)控線即C線，然后在質(zhì)控線下方 包被與給抗原相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)線Tn，各檢測(cè)線Tn交錯(cuò)分布，將己包被好的NC膜室溫放置干燥， 供裝配試紙用。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的同時(shí)檢測(cè)ToRCH感染的免疫層析試紙的制備方法，其特征是-所述步驟2)中，膠體金結(jié)合物墊的制備方法為-a、 將氯金酸配制成0.01%水溶液，取100ml加熱煮沸，攪拌下加入1.5-2.0ml的1%擰檬 酸鈉溶液，直到溶液顏色穩(wěn)定成酒紅色，即得到膠體金溶液；b、 用0.2mol/L K2C03溶液將膠體金溶液調(diào)pH值至7.6，攪拌下將抗人IgM或抗人IgG 抗體5ug/ml用量加入膠體金溶液中混合，然后加入10%牛血清白蛋白(BSA)溶液10ml，將 此標(biāo)記好的膠體金結(jié)合物10000-14000r/min離心30-60分鐘，棄上清，將沉淀用含1%bsa的 磷酸鹽(pbs)緩沖液懸浮，恢復(fù)原體積后再離心，如此洗滌2 4次，最后將沉淀懸浮于1A0 體積含1%BSA的PBS緩沖液中，然后將此膠體金結(jié)合物溶液均勻涂在玻璃纖維上，冷凍干燥， 密封備用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種同時(shí)檢測(cè)ToRCH感染的免疫層析試紙及制備方法。它包括基板，基板上粘接層析膜，在層析膜上包被固定至少兩種特定抗原檢測(cè)線，在層析膜下端依次粘有膠體金結(jié)合物墊、樣品墊，在層析膜上端為吸收墊，所述檢測(cè)線以交錯(cuò)排布在層析膜上，吸收墊上有與層析膜上的具體檢測(cè)線相對(duì)應(yīng)的標(biāo)識(shí)區(qū)，本試紙條用來(lái)同時(shí)檢測(cè)人是否有ToRCH特異性IgM或IgG感染。本試紙條既克服了單測(cè)試紙條一次只能檢測(cè)一種病原體的缺點(diǎn)，又避免了在一個(gè)層析條上同時(shí)做幾個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)時(shí)前面檢測(cè)線形成的復(fù)合物會(huì)影響后面的檢測(cè)，在靈敏度上受到很大限制的缺陷，本試紙條具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏、不需要特殊儀器設(shè)備、觀察結(jié)果直觀等顯著優(yōu)點(diǎn)，大大方便了臨床檢測(cè)和篩查工作。
文檔編號(hào)G01N33/558GK101158684SQ20071011307
公開日2008年4月9日 申請(qǐng)日期2007年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月6日
發(fā)明者吳堅(jiān)美, 崔亞洲, 波 朱, 韓金祥 申請(qǐng)人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心