專利名稱：乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速定量檢測乳腺癌的Y-synuclein診斷試劑盒， 是一種通過熒光定量RT-PCR對待測樣品中的Y -synuclein進行定量檢測，以期為乳腺癌 早期篩查、預后和制定相應的治療方案提供依據(jù)。
背景技術(shù)：
乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，全世界每年約有一百多萬婦女患有乳腺癌， 發(fā)病率有逐年上升的趨勢。以往的早期乳腺癌病人多因能觸及腫塊，當腫塊較小時，常被 認為處于臨床早期，實際上這并非真正意義上的早期診斷。早期診斷應是針對在臨床上觸
及不到腫塊的乳腺癌病人而言，即亞臨床狀態(tài)。傳統(tǒng)的乳腺癌檢測方法主要包括X線診 斷、超聲顯象檢查、細胞學及組織學診斷等，這些方法在乳腺癌的常規(guī)檢測中起了重要 作用，但普遍不適用于真正意義的乳腺癌準確的早期診斷(胡鐵輝，海健，黃俊輝.乳腺
癌診斷新近展[J].中國醫(yī)師雜志，2003， 12: 1722-1724)。目前乳腺癌的生物診斷技術(shù) 己成為最活躍的研究領(lǐng)域之一。通過傳統(tǒng)病理形態(tài)來早期診斷乳腺癌的概念已逐步發(fā)生了 改變。隨著分子生物學、細胞生物學和免疫學研究的進展，乳腺癌的研究由細胞病理學進 入分子病理學領(lǐng)域，生物診斷技術(shù)成為一種很有前途的治療手段，特別是近年來人類基因 組研究取得的豐碩成果進一步推動了生物診斷技術(shù)的發(fā)展，分子病理診斷已逐歩成為乳腺 癌診斷的一個重要內(nèi)容。
Y-synuclein是一種乳腺癌診斷的新標志基因，又稱乳腺癌特異性基因1 (BCSG1, breast cancer-specific gene 1)，其表達蛋白廣泛分布在神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元突觸前末稍。 除神經(jīng)系統(tǒng)外，正常乳腺組織或良性病變中BCSG1幾乎不表達，而多數(shù)浸潤性乳腺癌、卵 巢癌等腫瘤組織中表達異常增高。BCSG1的異常表達與腫瘤細胞的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移相關(guān) (Ji H ， Liu YE， Jia T， et al. Identification of a breast cancer- specific gene , BCSG1 ， by direct differential cDNA sequencing[J]. Cancer Res， 1997， 57: 759-764)。 BCSG1在乳腺癌中有很高的特異性表達，而在正常乳腺組織或良性病變中幾乎不表達，因 此檢測患者的外周血、腫瘤組織、乳腺分泌液等標本中有無Y-synuclein的表達，可以 對乳腺癌的診斷(尤其是對腫瘤的良性和惡性的鑒別)和預后治療的提供有力證據(jù)，還可 以為腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)情況的監(jiān)測提供幫助。
目前己被眾多的實驗研究和臨床觀察所證實當乳腺癌發(fā)展到大于lcm，在臨床上可 觸及腫塊時，往往已是全身性疾病，可存在遠處微小轉(zhuǎn)移灶，只是用目前的檢査方法診斷 多數(shù)乳腺癌是一種全身性疾病時，尚不能發(fā)現(xiàn)而已。因此，如何盡早快速、準確測定乳腺
癌的腫瘤轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療中面臨的主要難題之一。據(jù)報道，乳腺癌必須確診方可治療， 現(xiàn)有的檢查方法雖然很多，但至今只有活檢所得的病理結(jié)果能作為唯一肯定診斷的依據(jù)。 國外己有報道，通過針吸活檢組織或細胞學穿刺進行乳腺可疑病變中微量DNA或RNA的提 取，并從分子水平檢測基因異常，可早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌。目前常用的基因檢測方法有免疫 組織化學(IHC)、熒光原位雜交(FISH)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)(沈坤偉，沈鎮(zhèn)宙.乳 腺癌研究進展，美國第23屆圣安東尼奧國際乳腺癌大會論文綜述[J].中國腫瘤，2001， 10:352-353)。 FISH能直接和準確地判斷靶基因是否存在擴增，但較為昂貴和繁瑣；免疫 組織化學因其簡便、快速、經(jīng)濟，已成為最常規(guī)的檢測方法，但仍有很多缺點首先免疫 組化的判斷標準不一，使靶基因蛋白表達的檢測結(jié)果不一致，其次石蠟包埋和甲醛固定可 能會對免疫組織化學檢測結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，造成假陰性。第三，采用不同公司的抗體， 檢測結(jié)果也不完全相同。此外，目前已有的乳腺癌試劑盒普遍存在操作繁瑣，特異性和敏 感性差的問題，迫切需要一種靈敏度高、速度快、特異性強的體外檢測試劑盒。近年來 RT-PCR技術(shù)被用于腫瘤檢測，敏感性比IHC提高10 100倍，在基因表達水平分析和定量 檢測等方面得到廣泛應用。實時熒光定量RT-PCR是在實時RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項 新技術(shù)(High-Throughput Reai-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of H印atitis C Virus RNA [J]. J. Clin. Microbiol, 1999， 37:327-332)其探針特異地 同目的模板結(jié)合，與其他RT-PCR技術(shù)相比，實時RT-PCR對mRNA的檢測和定量能提供更 多的信息，耗時更少，其準確性、靈敏性都大大提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速定量檢測乳腺癌的Y-synuclein診斷試劑盒，該試 劑盒不僅可使用目前市場上存在的所有類型熒光定量儀器，更重要的是能快速對乳腺癌診 斷的新標志基因Y-synuclein進行定量檢測，從而提供乳腺癌的早期診斷和預后治療的 重要輔助指標。
本發(fā)明的另外的目的在于提供這種試劑盒的使用方法。
概括的說，這種乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，包括總RNA提取液、逆轉(zhuǎn)錄反 應液、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、熒光PCR定量反應液、標準品和對照 品，其特征在于，逆轉(zhuǎn)錄反應液包括DEPC處理的滅菌雙蒸水、六聚體隨機引物p(dN)6、 5XRT緩沖液和dNTPs。 一種優(yōu)選的方案是，總RNA提取液為TRizoL總RNA提取液。前述 逆轉(zhuǎn)錄反應液中六聚體隨機引物P(dN)6為100 mmol/L六聚體隨機引物p(dN)6， dNTPs 為12. 5 mmol/L dNTPs。前述熒光PCR定量反應液包括10X PCR緩沖液、引物、2mmol/L dNTPs 和SYBR Green I，所述10X PCR緩沖液包括500 mmol/L KC1、 100mmol/L Tris-HC1、7, 5mmol/L MgC12，所述引物包括具有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列反向引物。 一種優(yōu)選的方案是，所述Tris-HC1的PIt9.0。
這種乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，所述標準品為SEQ ID N0:3所示的核苷酸序 列。所述對照品的陰性對照為無Y-synuclein mRNA的RNA樣品，陽性對照為含有 Y-synuclein m脂A的RNA樣品。
這種乳腺癌symjclein快速診斷試劑盒的使用方法，其特征在于，包括下述步驟
(1) 設(shè)計引物——設(shè)計人Y-synuclein的具有SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的正向 引物和具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的反向引物，以人的GAPDH為內(nèi)參對照，其正向 引物和反向引物分別具有SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，
(2) 樣品總RNA的提取——用TRizoL總脂A提取液從待測樣品中提取總RNA，將所 提取的總RNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定，-7(TC保存待用，
(3) 逆轉(zhuǎn)錄反應——l"g的總RNA用于cDNA第一鏈的合成，引物為100腿oI/L六 聚體隨機引物P(dN)6，
(4) SYBR Green I熒光定量PCR——10XPCR緩沖液2. 5 y 1， 2 mmol/L dNTPs 2. 5 y 1， 20XSYBR Green I lii 1， 12. 5 y mol/L的引物各0. 5 y 1， 10 U/u 1的Taq酶0. 2 u 1 ， 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 u 1 ，反應總體積25 n 1 ，
反應條件94。C預變性l分鐘，94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 30秒，共40個循環(huán)， 每個循環(huán)后自動讀板l次，72°C 30秒處采集熒光信號，
每次檢驗均設(shè)陰性對照和陽性對照，標準品用滅菌雙蒸水稀釋為1x102-1x109拷貝 /ml,根據(jù)繪制的標準曲線得到y(tǒng)-synuclein及GAPDH基因表達的相對濃度，以 y-synuclein與GAPDH相對濃度的比值來反映y-synuclein表達量。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果
1、 具有極高的特異性(該檢測基因在乳腺癌中有很高的特異性表達)；
2、 可以對腫瘤的良性和惡性進行初步鑒別(該檢測基因在惡性乳腺腫瘤中有很高的 表達量，而在乳腺良性病變中幾乎不表達)；
3、 該檢測方法定量準確，具有很高的靈敏性；
4、 該檢測方法歩驟簡單，耗時短(4小時左右完成測試)；
5、 需要檢測的樣本量極少(毫克級)；
6、 可以檢測的樣本種類多(外周血、腫瘤組織、乳腺分泌液等標本均可)
7、 可同時進行高通量的樣品檢測。
具體實施例方式
一、制備本發(fā)明的乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒 1、所用到的主要試劑和儀器
TRizoL總RNA提取液(Omega公司)；200UM SuperScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen 公司)；dNTPs 、 10U/rt TaqDNA聚合酶、40 U/W RNA酶抑制劑(Sigm公司)；20XSYBR
Green I染料(上海復興公司)；實時熒光定量PCR系統(tǒng)(印pendorf公司)。
2、 引物設(shè)計及合成 人Y -synuclein
PI:5' -CAAGAAGGGCTTCTCCATCGCCAAGG-3' (SEQ ID NO:1) P2: 5'-CCTCTTTCTCTTTGGATGCCACACCC-3' (SEQ ID NO:2) 內(nèi)參對照為GAPDH
PI: 5'- CCATCACTGCCACCCAGAAGAC -3' (SEQ ID NO:4) P2: 5'- GGCAGGTTTTTCTAGACGGCAG -3' (SEQ ID NO:5)
3、 標準品cDNA的制備
用TRizoL總腿提取液乳腺癌患者新鮮乳腺組織中的總廳，lmg的總腿用于逆 轉(zhuǎn)錄(RT)反應，引物為六聚體隨機引物(Hexamer random primer) p(dN)6; PCR擴增目的 片段，反應條件為94。C預變性1分鐘，94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 30秒，共30個循 環(huán)，PCR產(chǎn)物以pGEM-T載體連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，經(jīng)篩選和測序鑒定，陽性 質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA，分光光度計測A260定量后作為標準，將濃度單位換算成拷貝/ml， -2(TC保存。
二、乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒的使用方法
檢測樣本可以是患者的外周血、腫瘤組織、乳腺分泌液等標本，每次檢驗均設(shè)陰性對 照和陽性對照，標準品用滅菌雙蒸水稀釋為1x102-1x109拷貝/ml。
1、 樣品中RNA的提取
依照使用說明書，用TRizoL總RNA提取液從待測樣品中提取總RNA。 A280/A260比值 均在1. 8-2. 0之間，所提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見明顯的28S， 18S兩條 區(qū)帶，且28S約為18S的2倍，證明其完整性.-7(TC保存待用；
2、 逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應
1 P g的總RNA用于cDNA第一鏈的合成，引物為六聚體隨機引物(Hexamer random primer) p(dN)6;
3、 SYBR Green I熒光定量RT-PCR
優(yōu)化的實時定量RT-PCR體系為10XPCR緩沖液2.5 u 1， 2畫1/L dNTP 2.5 "1， 20XSYBR Green I 1 u 1， 12.5 u mol/L的引物各0. 5 w 1， 10 U/u 1的Taq酶0. 2 y 1， 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5ul，反應總體積25 ul。反應條件94。C預變性1分鐘，94°C 30秒，68 °C 30秒，72°C 30秒，共40個循環(huán)(每個循環(huán)后自動讀板1次)，72°C 30秒處采集熒光信 號。PCR反應之后做68°C — _94°C的融解曲線分析，對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳 分析特異性。
4、 Y -synuclein表達的相對定量分析
每次擴增時拿出1份標準品cDNA用水做10倍系列稀釋，分別對Y-synuclein和 ]3-actin進行實時定量擴增，制作各自的標準曲線。標準曲線相關(guān)系數(shù)r〉0.99的定量結(jié)
果認為可靠。根據(jù)繪制的標準曲線得到Y(jié)-synuclein及GAPDH基因表達的相對濃度，以 Y-synuclein與GAPDH相對濃度的比值來反映Y-synuclein表達量，每個樣品做3個平 行管。
Y-synuclein在乳腺癌中有很高的特異性表達，而在正常乳腺組織或良性病變中幾 乎不表達，因此檢測患者的外周血、腫瘤組織、乳腺分泌液等標本中有無Y-synuclein 的表達，可以對乳腺癌的診斷(尤其是對腫瘤的良性和惡性的鑒別)和預后治療的提供重 要的輔助指標。
SEQUENCE LISTING
<110> 山東大學
<120>乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒 <130>乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒
<160> 5
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 1
caagaagggc ttctccateg cca鄉(xiāng)
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223>人工合成
<400> 2
cctctttctc tttggatgcc acaccc
<210〉 3
<211> 480
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ctca3gcccg c昭ctcgcag ggag3tccag ctccgtcctg cctgc昭cag cccaaccctg 60
cacacccacc atggatgtct tcaagaaggg cttctecatc gccaaggagg gcgtggtggg 120
tgcggtggaa aagaccaagc agggggtgac ggaagcagct gagaagacca鄉(xiāng)agggggt 180
catgtatgtg ggagccaaga ccaaggagaa tgttgtacag agcgtgacct cagtggccga 240
gaagaccaag gagcaggcca acgccgtgag cgaggctgtg gtgagcagcg tcaacactgt 300
ggccaccaag accgtggagg aggcggagaa catcgcggtc acctccgggg tggtgcgcaa 360
ggaggacttg aggccatctg ccccccaaca ggagggtgag gcatccaaag agaaagagga 420
agtggcagag gaggcccaga gtgggggaga ctagagggct acaggccagc gtggatgacc 480
<210> 4
<211> 22
<212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 4
ccatcactgc C3cccagaag 22
<210>
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工合成
<400> 5
ggcaggtttt tctagacggc ag
權(quán)利要求
1、乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，包括總RNA提取液、逆轉(zhuǎn)錄反應液、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、熒光PCR定量反應液、標準品和對照品，其特征在于，逆轉(zhuǎn)錄反應液包括DEPC處理的滅菌雙蒸水、六聚體隨機引物p(dN)6、5×RT緩沖液和dNTPs。
2、 權(quán)利要求1所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，其特征在于，所述總RNA提 取液為TRizoL總RNA提取液。
3、 權(quán)利要求1-2任一所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，其特征在于，所述逆 轉(zhuǎn)錄反應液中六聚體隨機引物P(dN)6為100 mmol/L六聚體隨機引物p (dN) 6， dNTPs為 12.5 mmol/L dNTPs。
4、 權(quán)利要求1所述乳腺癌sy皿clein快速診斷試劑盒，其特征在于，所述熒光PCR 定量反應液包括10XPCR緩沖液、引物、2腦ol/L dNTPs和SYBR Green I，所述10 X PCR 緩沖液包括500 mmol/L KC1、 100mmol/L Tris-HC1、 7. 5咖ol/L MgCl2，所述引物包括具 有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的反向引 物，以人的GAPDH為內(nèi)參對照，其正向引物和反向引物分別具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5 所示的核苷酸序列。
5、 權(quán)利要求4所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，其特征在于，所述Tris-HCl 的PH=9. 0。
6、 權(quán)利要求1所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，其特征在于，所述標準品為 SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
7、 權(quán)利要求1所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，所述對照品的陰性對照為無 Y -synuclein mRNA的脂A樣品，陽性對照為含有Y -synuclein mRNA的RNA樣品。
8、 權(quán)利要求1所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒的使用方法，其特征在于，包 括下述歩驟(1) 樣品總RNA的提取——用TRizoL總RNA提取液從待測樣品中提取總RNA，將所 提取的總RNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定，-7(rC保存待用，(2) 逆轉(zhuǎn)錄反應——lwg的總RNA用于cDNA第一鏈的合成，引物為100咖ol/L六 聚體隨機引物p(dN)6，(3) SYBR Green I熒光定量PCR——10XPCR緩沖液2. 1， 2咖ol/L dNTPs 2. 5 y 1， 20XSYBR Green I 1 U 1， 12. 5 " mol/L的引物各0. 5 y 1 ， 10 U/u 1的Taq酶0. 2 u 1 ， 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 u 1 ，反應總體積25 li 1 ，反應條件94。C預變性l分鐘，94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 30秒，共40個循環(huán)， 每個循環(huán)后自動讀板l次，72°C 30秒處采集熒光信號，每次檢驗均設(shè)陰性對照和陽性對照，標準品用滅菌雙蒸水稀釋為lxl(f-lxl(T拷貝/ml， 根據(jù)繪制的標準曲線得到Y(jié) -synuclein及GAPDH基因表達的相對濃度，以Y -synuclei.n 與GAPDH相對濃度的比值來反映Y -synuclein表達量。
9、權(quán)利要求1-2， 4-7任一所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒在診斷乳腺癌中的 應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，包括總RNA提取液、逆轉(zhuǎn)錄反應液、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、熒光PCR定量反應液、標準品和對照品，其特征在于，逆轉(zhuǎn)錄反應液包括DEPC處理的滅菌雙蒸水、六聚體隨機引物p(dN)6、5×RT緩沖液和dNTPs。該試劑盒克服了傳統(tǒng)方法中存在的不足，可有效方便地對標本中synuclein進行精確定量。該試劑盒可用于臨床和科研中檢測患者的外周血、腫瘤組織、乳腺分泌液等標本中synuclein的表達，以期為今后乳腺癌早期篩查、預后和制定相應的治療方案提供依據(jù)。
文檔編號G01N21/00GK101187626SQ20071011525
公開日2008年5月28日 申請日期2007年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月12日
發(fā)明者瑤 劉, 屈慶春 申請人:山東大學