專利名稱：一種檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種嗜肺軍團(tuán)菌抗原的檢測試紙及其制備方法，特別是涉及一種檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙及其制備方法。
背景技術(shù)：
軍團(tuán)菌(Legionella)是1976年發(fā)現(xiàn)的。當(dāng)時美國退伍軍人于費城集會，期間暴發(fā)流行了一種原因不明的嚴(yán)重肺炎，與會者149人感染，34人死亡。從死者肺組織中分離得到一種新菌，命名為軍團(tuán)菌。目前，已發(fā)現(xiàn)的軍團(tuán)菌屬有43個種、65個血清型，其中與人類疾病關(guān)系最密切的為嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila，LP)，研究表明，80％～85％的軍團(tuán)菌肺炎由LP引起，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)15個血清型的LP。
軍團(tuán)病(Legionnarires′disease，LD)是由軍團(tuán)菌感染引起的一種急性細(xì)菌性呼吸道傳染病，以軍團(tuán)菌肺炎和龐蒂亞克熱為主要表現(xiàn)，易暴發(fā)流行。近年來，國外有許多軍團(tuán)病疫情的報道2000～2002年，僅歐洲就共報道軍團(tuán)病189次，10322人感染。我國也有軍團(tuán)病小規(guī)模疫情的發(fā)生2000年1月，北京市某新兵訓(xùn)練營地發(fā)生了軍團(tuán)病，發(fā)病率為89％；2000年7月，因空調(diào)系統(tǒng)冷凝水導(dǎo)致的龐蒂亞克熱型軍團(tuán)病在某寫字樓員工中發(fā)生，發(fā)病率為61.9％。
大多數(shù)軍團(tuán)病患者有與其它病原體引起的非典型肺炎一致的臨床表現(xiàn)，如咳嗽、發(fā)熱和肌痛，胸部X片顯示肺部浸潤現(xiàn)象等，故常導(dǎo)致誤診、漏診，未經(jīng)治療的軍團(tuán)病患者死亡率達(dá)25％。由于嗜肺軍團(tuán)菌是引起軍團(tuán)菌肺炎的主要病原體，故對其的快速檢測顯得尤為重要。嗜肺軍團(tuán)菌抗原檢測的方法很多，例如ELISA、PCR、免疫傳感器技術(shù)等。但在實踐中，這些方法的使用暴露出一些共同的劣勢，例如實驗必須在專門的實驗室中進(jìn)行；需要電源和特殊的儀器；操作人員必須經(jīng)過專門培訓(xùn)；實驗系統(tǒng)不容易標(biāo)準(zhǔn)化，為使結(jié)果可信，需要進(jìn)行多次預(yù)試驗和設(shè)立多項對照；試驗操作步驟繁瑣，至少需要2小時以上。
免疫膠體金技術(shù)是近年來迅速發(fā)展的快速檢測技術(shù)，該技術(shù)與其它方法比較，優(yōu)勢在于檢測過程中標(biāo)本處理簡單，不需要專門儀器和人員培訓(xùn)，非專業(yè)技術(shù)人員按照說明書即可操作，并可迅速觀察結(jié)果，很適合突發(fā)事件現(xiàn)場和基層使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙(Immuno-Chromatographic Assay，ICA)。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙(ICA試紙)，包括樣品墊、緊密連接于所述樣品墊一端的含有抗嗜肺軍團(tuán)菌血清抗原的抗體標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊、與所述金標(biāo)墊的另一端緊密連接的硝酸纖維膜(NC膜)和緊密連接于所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線含有嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體，所述質(zhì)控線含有能與所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體特異結(jié)合的抗抗體。
所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體為以嗜肺軍團(tuán)菌抗原為抗原免疫動物得到的抗體，所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原可為嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型或10型抗原，優(yōu)選為嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原，所述免疫動物的選擇是多種多樣的，如兔、猴、雞或鼠等常用的免疫動物；所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的抗抗體優(yōu)選為抗兔抗抗體，尤其優(yōu)選為羊抗兔IgG；所述檢測線含有的嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的濃度可為5-7mg/mL，所述質(zhì)控線含有的能與嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體特異結(jié)合的抗抗體的濃度可為3-5mg/mL。
所述吸水墊和樣品墊均由吸水材料制備。
檢測樣品時可將上述檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的樣品墊直接浸于樣品中；為使使用更加方便，所述檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的背面還緊密連接一背板，背板材料的選擇是多種多樣的，如塑料、樹脂或聚氯乙烯板(PVC板)等，再將該帶有背板的免疫層析試紙裝入試劑盒中，該試劑盒對應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有點樣口，對應(yīng)于檢測線和質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測窗。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備上述檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的方法。
本發(fā)明所提供的制備上述檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)制備嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體和嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的抗抗體；將嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體溶液噴到纖維素膜上形成檢測線，將嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的抗抗體溶液噴到所述纖維膜的另一區(qū)域形成質(zhì)控線，然后將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠(yuǎn)離所述測試帶的一端；2)制備嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液，將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入該免疫膠體金探針溶液，得到金標(biāo)墊，將其粘貼在步驟1)得到的纖維素膜的靠近所述檢測線的一端；
3)將在步驟2)中得到的金標(biāo)墊上遠(yuǎn)離所述檢測線的一端粘貼樣品墊，得到檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙。
在上述檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的制備方法中，步驟1)中所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體為以嗜肺軍團(tuán)菌抗原為抗原免疫動物得到的抗體，所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原可為嗜肺軍團(tuán)菌血清1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型或10型抗原，優(yōu)選為嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原，所述免疫動物的選擇是多種多樣的，如兔、猴、雞或鼠等常用的免疫動物，優(yōu)選為兔；所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的抗抗體優(yōu)選為抗兔抗抗體，尤其優(yōu)選為羊抗兔IgG；所述檢測線含有的嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的濃度可為5-7mg/mL，所述質(zhì)控線含有的能與嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體特異結(jié)合的抗抗體的濃度可為3-5mg/mL。
步驟1)中所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的制備方法可為采用皮下多點注射方式進(jìn)行免疫，每只注射嗜肺軍團(tuán)菌抗原2mg/mL，同時加注福氏佐劑0.1mL/只，共免疫4-6次(優(yōu)選為5次)，每次間隔10天，末次免疫10天后對免疫動物血清進(jìn)行瓊脂糖雙向擴散試驗，檢測血清效價，達(dá)到1∶32以上即可采血，對抗血清進(jìn)行純化，得到嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體。
步驟1)中的干燥溫度可為30-45℃，優(yōu)選為37℃，干燥時間可為2.5-3.5小時。
步驟2)中嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液的制備方法可包括以下步驟A.將HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100mL加熱至沸，攪動下準(zhǔn)確加入1.6mL的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O72H2O)水溶液，繼續(xù)加熱煮沸(優(yōu)選為10-12分鐘)，直到液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液，冷卻后用水恢復(fù)至原體積；B.將步驟1)獲得的膠體金溶液的pH值調(diào)至8.5-9.5，每100mL膠體金溶液加入終濃度為48μg/mL的嗜肺軍團(tuán)菌血清抗原特異性抗體，攪拌25-35分鐘，加入5mL 10％BSA，攪拌20-30分鐘，再加入1mL 10％ PEG20000，攪拌20-30分鐘，先在20,000-23,500rpm下離心25-35分鐘，吸出上清，再將上清在10000-12000rpm下離心25-35分鐘，棄上清，用0.05-0.1M的四硼酸鈉溶液洗滌沉淀，并將其保存于8-10mL0.05-0.1M的四硼酸鈉溶液中，得到嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體標(biāo)記的膠體金探針溶液。
在上述嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液的制備方法中，可用K2CO3溶液或HCl溶液調(diào)pH值為8.5-9.5，所述調(diào)節(jié)pH值的K2CO3溶液的濃度可為0.15-0.25M，優(yōu)選為0.2M；所述調(diào)節(jié)pH值HCl溶液的濃度可為0.08-0.12mol/L，優(yōu)選為0.1mol/L。為彌補因加熱蒸發(fā)損失的水分，可用水將膠體金溶液恢復(fù)至原體積。
為使嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針與玻璃纖維膜或聚脂膜更好地結(jié)合，可向步驟2)中的嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；為使金標(biāo)墊更易與纖維素膜粘貼，可將金標(biāo)墊在-20℃至-50℃冷凍10-12小時，并將其冷凍抽干后，再與纖維素膜粘貼。
所述吸水墊和樣品墊均由吸水材料制備。
檢測樣品時可將上述檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的樣品墊直接浸于樣品中為使使用更加方便，所述檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的背面還緊密連接一背板，背板材料的選擇是多種多樣的，如塑料、樹脂或聚氯乙烯板(PVC板)等，再將該帶有背板的免疫層析試紙裝入試劑盒中，該試劑盒對應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有點樣口，對應(yīng)于檢測線和質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測窗。
在實際應(yīng)用中，所述纖維素膜可為硝酸纖維素膜(NC膜)或醋酸纖維素膜，寬度控制在2.5-3.0mm為宜；所述吸水墊可為吸水紙，寬度為20-40mm，厚度為0.1-0.2mm；所述金標(biāo)墊的寬度為5-10mm；所述樣品墊為玻璃纖維膜，寬度為20-40mm。
本發(fā)明提供了一種檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙及其制備方法。該試紙利用了免疫膠體金技術(shù)及雙抗體夾心檢測法，用其檢測嗜肺軍團(tuán)菌或嗜肺軍團(tuán)菌抗原的基本原理是用嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體包被纖維素膜，用以捕捉標(biāo)本中的嗜肺軍團(tuán)菌或嗜肺軍團(tuán)菌抗原，然后用標(biāo)記了嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的抗抗體的免疫膠體金探針進(jìn)行檢測。本發(fā)明的免疫層析試紙具有以下優(yōu)點1)敏感性及特異性高實驗室考核結(jié)果顯示，本發(fā)明的免疫層析試紙可用于檢測嗜肺軍團(tuán)菌血清1-10型抗原標(biāo)本，并且不與其它生物發(fā)生交叉反應(yīng)；2)檢測方法簡單、快速檢測過程中標(biāo)本處理簡單，不需要專門儀器和人員培訓(xùn)，非專業(yè)技術(shù)人員按照說明書即可操作，并可迅速觀察結(jié)果，標(biāo)本中的嗜肺軍團(tuán)菌或嗜肺軍團(tuán)菌經(jīng)過約5分鐘的紙層析后，即可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線，從而為嗜肺軍團(tuán)菌病的治療爭取了時間，很適合突發(fā)事件現(xiàn)場和基層使用；3)制備方法簡單，成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將在嗜肺軍團(tuán)菌的檢測及其相關(guān)疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的正面和縱截面結(jié)構(gòu)示意圖具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
材料
硝酸纖維膜(NC膜)、樣品墊和吸水濾紙，購自Millipore公司。
塑料背板，購自北京燕華公司。
實施例1、檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的制備一、嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原特異性抗體的制備1、嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原的制備將嗜肺軍團(tuán)菌血清1型菌株(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所菌種庫，保藏號510101)接種在BCYE平板上，置于37℃、5％ CO2孵箱中培養(yǎng)，觀察平板上的菌落形態(tài)，挑取典型的單個菌落，轉(zhuǎn)接置BCYE斜面，置于37℃、5％ CO2孵箱中培養(yǎng)3-5天。將培養(yǎng)的斜面用無菌PBS(0.01M pH7.2)洗下菌苔，8000rpm離心25分鐘，棄上清，收集菌體沉淀；每克濕重菌體懸浮在10mL 0.1M NaOH溶液中，室溫攪拌1小時；濃醋酸調(diào)溶液pH值至3.0，8000rpm離心20分鐘，棄沉淀，將上清用5N NaOH調(diào)至pH值為6.5-7.0，所得溶液用PBS(0.01M pH7.0)透析48小時，得到嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原，凍干保存。
2、嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原特異性抗體的制備選用體重2kg健康雌性大耳白家兔(購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心)，將福氏完全佐劑與步驟1獲得的嗜肺軍團(tuán)菌抗原混合乳化后皮下多點注射進(jìn)行免疫，免疫劑量為2mg/mL/只，分別于初次免疫后的第20日、第30日、第40日追加免疫水劑1針，追加劑量和途徑與初次免疫相同，末次免疫后10天對免疫動物血清進(jìn)行瓊脂糖雙向擴散試驗，檢測血清效價，結(jié)果為1∶64(1∶32以上即可)采血，采用常規(guī)的飽和硫酸銨鹽析法對抗血清進(jìn)行純化，即用33％飽和硫酸銨鹽析2次，透析脫鹽后收集抗體，得到嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體。采用紫外分光光度儀測定上述制備的嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體蛋白的濃度，方法為將蛋白適當(dāng)稀釋，分別在280nm及260nm波長下測定A值，根據(jù)以下公式計算得到蛋白濃度蛋白含量(mg/mL)＝(1.45A280nm-0.74A260nm)稀釋倍數(shù)。
結(jié)果按照上述方法純化所得的嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體蛋白的濃度為180mg/mL。
3、制備免疫膠體金探針1)制備膠體金溶液采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，具體方法為將HAuCl4(購自Sigma公司，1g/瓶包裝)配制成0.01％水溶液，取100mL加熱至沸騰，攪動下準(zhǔn)確加入1.6mL的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O72H2O)水溶液，液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，即得到膠體金溶液。冷卻后用蒸餾水恢復(fù)至原體積，制成顆粒直徑為25nm的膠體金顆粒。
2)確定膠體金偶聯(lián)抗體飽和濃度用0.2M K2CO3溶液(或0.1M HCl溶液)調(diào)節(jié)膠體金溶液pH 8.5-9.5，準(zhǔn)備6支潔凈試管，分別加入lmL膠體金溶液。將經(jīng)純化的嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原特異性抗體稀釋為lmg/mL，分別向5支試管中加入10μl、20μl、30μl、40μl、50μl，另一支為對照，混勻后于室溫下放置5分鐘，加入10％NaCl水溶液，混勻，靜置10-20分鐘后觀察液體顏色。膠體金溶液顏色不變時所含最少抗體量，即為穩(wěn)定1mL膠體金所需抗體的最適濃度，以此為基礎(chǔ)增加20％抗體量，即為膠體金偶聯(lián)抗體飽和濃度。結(jié)果表明維持膠體金溶液顏色不變的抗體量為40μl，即40μg/mL，選擇偶聯(lián)抗體濃度為48μg/mL。
3)金標(biāo)墊的制備按上述方法配制含有濃度為48μg/mL的嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原特異性抗體免疫膠體金探針溶液50mL，攪拌30分鐘(25-35分鐘均可)，加10％ BSA5mL，攪拌25分鐘(20-30分鐘均可)，加1mL 10％PEG20000，攪拌25分鐘(20-30分鐘均可)，20,000～23,500rpm離心25分鐘(20-30分鐘均可)，棄上清，將沉淀用四硼酸鈉洗滌1次后用四硼酸鈉保存液收集沉淀5mL。取嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原特異性抗體免疫膠體金探針溶液5mL加入0.5g蔗糖，充分溶解均勻加在玻璃纖維膜上，-35℃(-20℃～-50℃均可)放置11小時(10-12小時均可)，凍干機抽干，得到金標(biāo)墊。
4、嗜肺軍團(tuán)菌抗原快速檢測試紙的制備如圖1所示(圖中a為檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的正面結(jié)構(gòu)圖，圖中b為檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的縱截面結(jié)構(gòu)圖)，檢測霍亂弧菌的免疫層析試紙由吸水墊4、硝酸纖維素膜(NC膜)3、金標(biāo)墊2和玻璃纖維膜樣品墊1四部分組成；硝酸纖維膜3上設(shè)有檢測線5和質(zhì)控線6，該試紙的制備方法包括以下步驟1)NC膜3的包被用0.01M pH7.2的PB緩沖液(NaH2PO4·2H2O 0.39g，Na2HPO41.07g，去離子水1000mL)稀釋嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原特異性抗體，濃度為6mg/mL，用于包被檢測線。用0.01MpH7.2 PBS(NaH2PO4·2H2O 0.39g，Na2HPO41.07g，NaCl 8.5g，去離子水1000mL)稀釋羊抗兔IgG，濃度為4mg/mL，用于包被質(zhì)控線。用BIODOT公司XYZ3000噴膜機分別噴于2.5mm厚的硝酸纖維素膜上，形成相互分離的檢測線5和質(zhì)控線6，37℃干燥2.5-3.5h。
2)嗜肺軍團(tuán)菌抗原快速檢測試紙的制備將吸水墊4用雙面膠粘貼在包被的硝酸纖維膜3的一端；將包被的NC膜3用雙面膠粘貼在步驟2中制備的金標(biāo)墊2的一端；在金標(biāo)墊2上用雙面膠粘貼玻璃纖維膜樣品墊1；再最后將它們用雙面膠粘貼在塑料背板上，按所需大小切割，即為檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙，加干燥劑后密封保存。
5、檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試劑盒的制備為了方便使用，將步驟3制備的嗜肺軍團(tuán)菌抗原快速檢測的免疫層析試紙的下面再緊密連接一塑料背板，再將該帶有背板的試紙裝入試劑盒中，加干燥劑后密封保存。該試劑盒對應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有點樣口，對應(yīng)于對照帶和測試帶的部位設(shè)有觀測窗。
6、嗜肺軍團(tuán)菌抗原快速檢測試紙的使用方法和原理測定時將試紙條樣品墊1浸入液體標(biāo)本中，樣品墊1即吸取液體向上端移動，流經(jīng)金標(biāo)墊2時使干片上的免疫金復(fù)合物溶液，并帶動其向硝酸纖維膜3滲移。若標(biāo)本中有待測特異抗原，其可與免疫金復(fù)合物的抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至檢測線5即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條。過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至質(zhì)控線6與固相抗兔抗抗體結(jié)合，而顯出紅色質(zhì)控線條。反之，陰性標(biāo)本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。
實施例2、嗜肺軍團(tuán)菌抗原的檢測及與其它相關(guān)細(xì)菌的交叉試驗一、不同血清型嗜肺軍團(tuán)菌抗原的檢測實施例1步驟一中嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原的制備方法同樣適用于嗜肺軍團(tuán)菌其它血清型抗原的制備，用由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所微生物檢驗研究中心提供的嗜肺軍團(tuán)菌血清1、2、3、4、5、6、7、9、10型菌株按實施例1的方法制備的抗原分別稀釋成濃度為100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL的樣品檢測液備用。
取實施例1制備的裝有本發(fā)明檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的試劑盒，分別于點樣口中加入上述樣品檢測液3滴(約150ul)，2分鐘后開始觀察結(jié)果，15分鐘觀察終止。
結(jié)果報告僅于質(zhì)控觀測窗口“C”(質(zhì)控線)處出現(xiàn)1條紅色沉淀線為陰性，即無嗜肺軍團(tuán)菌抗原檢出；于檢測觀測窗口“T”(檢測線)和質(zhì)控觀測窗口“C”(質(zhì)控線)處出現(xiàn)2條紅色沉淀線為陽性，即有嗜肺軍團(tuán)菌抗原檢出；如質(zhì)控觀測窗口“C”(質(zhì)控線)處未出現(xiàn)紅色沉淀線，則說明檢測試紙失效，此時無論檢測觀測窗口“T”(檢測線)處是否出現(xiàn)沉淀線，檢測結(jié)果不成立。
用實施例1制備的包被嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原特異性抗體和羊抗兔IgG的免疫層析試紙對上述嗜肺軍團(tuán)菌血清1、2、3、4、5、6、7、9、10型檢測液進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均為陽性，證明本發(fā)明的免疫層析試紙可用于各個血清型的嗜肺軍團(tuán)菌抗原的快速檢測。
二、其它相關(guān)細(xì)菌的交叉試驗由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所微生物檢驗研究中心提供的濃度為100μg/mL鼠疫菌410050株F1抗原作為樣品檢測液備用。
用實施例1制備的包被嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原特異性抗體和羊抗兔IgG的免疫層析試紙對上述鼠疫菌410050株F1抗原樣品檢測液進(jìn)行檢測，結(jié)果為陰性，證明本發(fā)明的免疫層析試紙可用于各個血清型的嗜肺軍團(tuán)菌抗原的快速檢測，特異性高。
實施例3、實驗室考核1、樣品制備實驗共使用細(xì)菌10株，其中9株嗜肺軍團(tuán)菌(株號為510101-5101010，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所微生物檢驗研究中心)，1株鼠疫菌(株號為410050，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所微生物檢驗研究中心)。將上述細(xì)菌分別接種至各自適宜的培養(yǎng)基，并在不同的條件下培養(yǎng)后提取抗原，嗜肺軍團(tuán)菌血清1、2、3、4、5、6、7、9、10型抗原分別稀釋成濃度為100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL和10ng/mL，鼠疫菌F1抗原濃度為100μg/mL，作為檢測液備用。
2、實驗方法用實施例1制備的包被嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原特異性抗體和羊抗兔IgG的免疫層析試紙對步驟1制備的嗜肺軍團(tuán)菌抗原快速檢測試劑進(jìn)行檢測，取上述用不同菌株制備的嗜肺軍團(tuán)菌抗原快速檢測試劑，分別于樣品墊上加入上述樣品檢測液3滴(約150μl)，2分鐘后開始觀察結(jié)果，15分鐘觀察終止。
結(jié)果報告僅于質(zhì)控觀測窗口“C”(質(zhì)控線)處出現(xiàn)1條紅色沉淀線為陰性，即無嗜肺軍團(tuán)菌抗原檢出；于檢測觀測窗口“T”(檢測線)和質(zhì)控觀測窗口“C”(質(zhì)控線)處出現(xiàn)2條紅色沉淀線為陽性，即有嗜肺軍團(tuán)菌抗原檢出；如質(zhì)控觀測窗口“C”(質(zhì)控線)處未出現(xiàn)紅色沉淀線，則說明檢測試紙失效，此時無論檢測觀測窗口“T”(檢測線)處是否出現(xiàn)沉淀線，檢測結(jié)果不成立。
3、實驗結(jié)果嗜肺軍團(tuán)菌抗原快速檢測試劑的實驗室考核結(jié)果如表1所示，從表1可以看出，本發(fā)明的檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙可以檢出10ng/mL的嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原，10μg/mL嗜肺軍團(tuán)菌血清2、3、4、5、6、7、9、10型抗原，且不與100μg/mL鼠疫菌F1抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。上述檢測結(jié)果證明本發(fā)明的免疫層析試紙可用于各個血清型的嗜肺軍團(tuán)菌抗原的快速檢測，并具有較高的靈敏度及特異性。
表1 嗜肺軍團(tuán)菌抗原快速檢測試劑(膠體金法)實驗室考核


權(quán)利要求
1.一種檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙，包括樣品墊、緊密連接于所述樣品墊一端的含有抗嗜肺軍團(tuán)菌血清抗原的抗體標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊、與所述金標(biāo)墊的另一端緊密連接的硝酸纖維膜和緊密連接于所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線含有嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體，所述質(zhì)控線含有能與所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體特異結(jié)合的抗抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙，其特征在于所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體為以嗜肺軍團(tuán)菌抗原為抗原免疫動物得到的抗體；所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原為嗜肺軍團(tuán)菌血清1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型或10型抗原；所述免疫動物為兔、猴、雞或鼠；所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的抗抗體為抗兔抗抗體；所述檢測線含有的嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的濃度為5-7mg/mL，所述質(zhì)控線含有的能與嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體特異結(jié)合的抗抗體的濃度為3-5mg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙，其特征在于所述檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的背面緊密連接一背板。
4.一種制備權(quán)利要求1所述的檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)制備嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體和嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的抗抗體；將嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體溶液噴到纖維素膜上形成檢測線，將嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的抗抗體溶液噴到所述纖維膜的另一區(qū)域形成質(zhì)控線，然后將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠(yuǎn)離所述測試帶的一端；2)制備嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液，將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入該免疫膠體金探針溶液，得到金標(biāo)墊，將其粘貼在步驟1)得到的纖維素膜的靠近所述檢測線的一端；3)將在步驟2)中得到的金標(biāo)墊上遠(yuǎn)離所述檢測線的一端粘貼樣品墊，得到檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的制備方法，其特征在于所述步驟1)中的嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體為以嗜肺軍團(tuán)菌抗原為抗原免疫動物得到的抗體；所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原為嗜肺軍團(tuán)菌血清1型抗原、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型或10型抗原；所述免疫動物為兔、猴、雞或鼠；所述檢測線含有的嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的濃度為5-7mg/mL，所述質(zhì)控線含有的能與嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體特異結(jié)合的抗抗體的濃度為3-5mg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的制備方法，其特征在于所述步驟1)中嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體的制備方法為將福氏完全佐劑與嗜肺軍團(tuán)菌抗原混合乳化后皮下多點注射進(jìn)行免疫，免疫劑量為2mg/mL/只，共免疫4-6次，每次間隔10天，末次免疫10天后對免疫動物血清進(jìn)行瓊脂糖雙向擴散試驗，檢測血清效價，達(dá)到1∶32以上后采血，對抗血清進(jìn)行純化，得到嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的制備方法，其特征在于所述步驟1)中的干燥溫度為30-45℃，干燥時間為2.5-3.5小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的制備方法，其特征在于所述步驟2)中嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液的制備方法包括以下步驟A.將HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100mL加熱至沸，攪動下準(zhǔn)確加入1.6mL的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱煮沸，直到液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液，冷卻后用水恢復(fù)至原體積；B.將步驟1)獲得的膠體金溶液的pH值調(diào)至8.5-9.5，每100mL膠體金溶液加入終濃度為48μg/mL的嗜肺軍團(tuán)菌血清抗原特異性抗體，攪拌25-35分鐘，加入5mL 10％BSA，攪拌20-30分鐘，再加入1mL 10％PEG20000，攪拌20-30分鐘，先在20,000-23,500rpm下離心25-35分鐘，吸出上清，再將上清在10000-12000rpm下離心25-35分鐘，棄上清，用0.05-0.1M的四硼酸鈉溶液洗滌沉淀，并將其保存于8-10mL0.05-0.1M的四硼酸鈉溶液中，得到嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體標(biāo)記的膠體金探針溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的制備方法，其特征在于所述步驟B中用K2CO3溶液或HCl溶液調(diào)pH值；所述調(diào)節(jié)pH值的K2CO3溶液的濃度為0.15-0.25M；所述調(diào)節(jié)pH值HCl溶液的濃度為0.08-0.12mol/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9任一項所述的檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的制備方法，其特征在于向所述步驟2)中的嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；將金標(biāo)墊在-20℃至-50℃冷凍10-12小時，并將其冷凍抽干后，再與纖維素膜粘貼；在所述步驟3)獲得的檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙的背面緊密粘貼一背板；所述纖維素膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；所述吸水墊為吸水紙；所述樣品墊為玻璃纖維膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測嗜肺軍團(tuán)菌抗原的免疫層析試紙及其制備方法。該試紙包括樣品墊、緊密連接于所述樣品墊一端的含有抗嗜肺軍團(tuán)菌血清抗原的抗體標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊、與所述金標(biāo)墊的另一端緊密連接的硝酸纖維膜和緊密連接于所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線含有嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體，所述質(zhì)控線含有能與所述嗜肺軍團(tuán)菌抗原特異性抗體特異結(jié)合的抗抗體。本發(fā)明的免疫層析試紙具有簡便性、敏感性、特異性和快速性的優(yōu)點，適于臨床和現(xiàn)場使用。
文檔編號G01N33/532GK101074956SQ200710119068
公開日2007年11月21日 申請日期2007年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月19日
發(fā)明者端青, 汪黎, 李艷, 柏長青, 朱虹, 檀華, 何君, 左婷庭, 宋立華 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所