專利名稱：一種毛細(xì)管電泳法檢測(cè)雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種毛細(xì)管電泳法檢測(cè)雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體的方法。
技術(shù)背景手性藥物對(duì)映異構(gòu)體的檢査常用的方法有手性高效液相色譜法，通過(guò)在流 動(dòng)相中加入手性選擇劑或采用手性色譜柱進(jìn)行分離檢査，前者往往分離效果不 好，專屬性不強(qiáng),后者色譜柱較貴,成本較高,且色譜柱在使用過(guò)程中柱效極易下降 造成分離效果不好，加之雷替曲塞及其異構(gòu)體本身結(jié)構(gòu)中既含有羧基又含有氨基,在液相色譜分析過(guò)程中分子內(nèi)容易絞合,給分離增加了難度;氣相色譜法用于手性藥物對(duì)映異構(gòu)體的檢查要求樣品具有一定的揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性，應(yīng)用很有局限性。發(fā)明內(nèi)容為為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種毛細(xì)管電泳法檢測(cè)雷替曲塞對(duì)映異 構(gòu)體的方法，主要是分離并檢測(cè)雷替曲塞的單一對(duì)映異構(gòu)體。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，它主要包括樣品的制備，毛細(xì)管電泳條件及分析方法；它通過(guò)毛細(xì)管電泳將雷替曲塞及其對(duì)映異構(gòu)體分離，按主成份自身對(duì)照法 計(jì)算雷替曲塞中其對(duì)映異構(gòu)體的限度；用甲醇水=1: 1 (體積比)溶液配制 備供試品溶液，毛細(xì)管電泳的電泳緩沖液為Tris-H3P04，該緩沖液pH值為6.0 10，在該緩沖液中加入手性選擇劑和十二烷基硫酸鈉。緩沖液Tris-H3P04的配制是以0.05-0.1M的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液， 用濃度為0.1M的磷酸調(diào)節(jié)pH值，緩沖液的pH值優(yōu)選為8。手性選擇劑為a-環(huán)糊精、p-環(huán)糊精、磺化(3-環(huán)糊精、羥丙基-P-環(huán)糊精、l環(huán)糊精或者羧甲基-卩-環(huán)糊精。手性選擇劑在緩沖液中的濃度范圍為2 20mM,手性選擇劑優(yōu)選為羧 甲基-P-環(huán)糊精，其濃度為8mM。電泳條件參數(shù)為毛細(xì)管長(zhǎng)度總長(zhǎng)48.5cm ， 有效長(zhǎng)度40cm，毛細(xì)管內(nèi)徑為501im，運(yùn)行電壓為15 30kV，毛細(xì)管溫度為20~30 °C，流體力學(xué)進(jìn)樣50mbar 5秒。優(yōu)選運(yùn)行電壓20kv,毛細(xì)管的溫度25°C。電極 由'+，到，，檢測(cè)波長(zhǎng)為228nm;在緩沖溶液中加入十二烷基基硫酸鈉的 濃度為0.01 0.1M，優(yōu)選濃度是30mM。用甲醇水=1: 1 (體積比)溶液配制 雷替曲塞手性物分析樣品，供試品濃度在50 200^ig/ml之間,對(duì)映異構(gòu)體的濃度 1pg/ml 10(^g/ml。雷替曲塞對(duì)映異體的計(jì)算方法是配制雷替曲塞供試品溶液 及含1%雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品的雷替曲塞的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，雷 替曲塞供試品溶液中對(duì)映構(gòu)體的相應(yīng)的峰面積不得大于對(duì)照溶液中對(duì)映異構(gòu)體 的峰面積。為了保證檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性，毛細(xì)管第一次使用時(shí)，要對(duì)其進(jìn)行沖洗活化， 沖洗的程序是先用O.lmol/的NaOH沖洗15分鐘，然后用高純水沖洗10分鐘， 緩沖液沖洗5分鐘。此后每次運(yùn)行前用運(yùn)行緩沖液沖洗3分鐘。毛細(xì)管電泳法用于手性藥物異構(gòu)體的檢査有高效、快速、操作簡(jiǎn)便、環(huán)境 友好、樣品用量少，成本低，雷替曲塞及其對(duì)映異構(gòu)體能夠基線分離等優(yōu)點(diǎn)， 其較高的分離效率使分離選擇系數(shù)較小的對(duì)映異構(gòu)體可以得到滿意的分離效 果。用于毛細(xì)管電泳手性拆分的選擇劑的種類較多，其中以環(huán)糊精應(yīng)用得最廣， 而且容易得到，在手性拆分中具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)在美國(guó)Agilent Technologies公司Agilent 3D CE型毛細(xì)管電泳儀上行，流體力學(xué)進(jìn)樣，毛細(xì)管有效長(zhǎng)度40cm，內(nèi)徑50 u m的熔融石英毛細(xì)管柱。 樣品的配制過(guò)程如下配制75mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液，用濃度為0.1M的磷酸 調(diào)節(jié)pH至8.0作為緩沖液，加入8mmol/L羧甲基-e-環(huán)糊精(CM-P-CD)和 30mmol/L的十二^m,。用甲醇水=1: 1 (^f只比)溶液分別配制雷替曲 塞(s-raltitrexed)溶液及雷替曲塞和其對(duì)映異構(gòu)體(r-and s- mltitrexed)混合 溶液，雷替曲塞濃度為50ug/ml。進(jìn)樣前依次用緩沖溶液沖洗3min。實(shí)驗(yàn)溫度 25°C，檢測(cè)波長(zhǎng)228nm，流體力學(xué)進(jìn)樣50mbar5秒；結(jié)果見(jiàn)

圖1。 實(shí)施例2電泳條件同實(shí)施例l。用甲醇水=1: 1 (體積比)溶液配制，分別配制系 列雷替曲塞(s-raltitrexed)及雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體(r-raltitrexed)溶液，進(jìn)樣， 記錄響應(yīng)值為基線噪音3倍的電泳圖，即為雷替曲塞及其對(duì)映異構(gòu)體的檢測(cè)限， 其檢測(cè)限為1 P m/ml。結(jié)果見(jiàn)圖2 實(shí)施例3用50mmol/L 200mol/L的Tris-磷酸溶液為緩沖液，用濃度為0.1M的磷酸調(diào) 節(jié)pH至8.0，加入8mmol/L羧甲基-P -環(huán)糊精(CM- P -CD)和30mmol/L的十二 烷基硫酸鈉；其他同實(shí)施例l，結(jié)果見(jiàn)圖3。1、 一種用于手性藥物雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體的檢查方法。2、 其方法為高效毛細(xì)管電泳法本發(fā)明用于檢査雷替曲塞的單一對(duì)映異構(gòu)體，方法簡(jiǎn)單，分離效率高，分 離速度快，進(jìn)樣量少，分析成本低。 一般只需一些常用的試劑，所有試劑用量 均較少，與高效液相方法比分析成本低很多。其有益的效果主要表現(xiàn)在(1) 樣品用量少每次進(jìn)樣所需樣品只有幾IlL;(2) 環(huán)境友好所用的緩沖液均為水溶液，無(wú)需使用有機(jī)溶劑，比HPLC 方法更環(huán)保；(3) 分析成本低所需的毛細(xì)管柱及試劑相對(duì)于HPLC手性柱成本低很多。圖1為實(shí)施例一的檢測(cè)結(jié)果2為實(shí)施例二的檢測(cè)結(jié)果圖 圖3為實(shí)施例三的檢測(cè)結(jié)果圖1、 一種用于手性藥物雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體的檢查方法。2、 其方法為高效毛細(xì)管電泳法本發(fā)明用于檢查雷替曲塞的單一對(duì)映異構(gòu)體，方法簡(jiǎn)單，分離效率高，分 離速度快，進(jìn)樣量少，分析成本低。 一般只需一些常用的試劑，所有試劑用量均較少，與高效液相方法比分析成本低很多。其有益的效果主要表現(xiàn)在(1) 樣品用量少每次進(jìn)樣所需樣品只有幾nL;(2) 環(huán)境友好所用的緩沖液均為水溶液，無(wú)需使用有機(jī)溶劑，比HPLC 方法更環(huán)保；(3) 分析成本低所需的毛細(xì)管柱及試劑相對(duì)于HPLC手性柱成本低很多。
權(quán)利要求
1. 一種毛細(xì)管電泳法檢測(cè)雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體的方法，主要包括樣品的制備，毛細(xì)管電泳條件及分析方法；它通過(guò)毛細(xì)管電泳將雷替曲塞及其對(duì)映異構(gòu)體分離，按主成份自身對(duì)照法計(jì)算雷替曲塞中其對(duì)映異構(gòu)體的限度；用甲醇∶水＝1∶1(體積比)溶液配制備供試品溶液，毛細(xì)管電泳的電泳緩沖液為Tris-H3PO4，該緩沖液pH值為6.0～10，在該緩沖液中加入手性選擇劑和十二烷基硫酸鈉。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種毛細(xì)管電泳法檢測(cè)雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體的方法， 其特征是緩沖液Tris-H3P04的配制是以0.05~0.1M的三羥甲基氨基甲烷(Tris) 溶液，用濃度為0.1M的磷酸調(diào)節(jié)pH值。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種毛細(xì)管電泳法檢測(cè)雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體的方法， 其特征是手性選擇劑在緩沖液中的濃度范圍為2~20mM，其中手性選擇劑為a -環(huán)糊精、P-環(huán)糊精、磺化(3-環(huán)糊精、羥丙基-P-環(huán)糊精、Y-環(huán)糊精或者羧甲基-卩-環(huán)糊精。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種毛細(xì)管電泳法檢測(cè)雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體的方法， 其特征是電泳條件參數(shù)為毛細(xì)管長(zhǎng)度總長(zhǎng)48.5cm ，有效長(zhǎng)度40cm，毛細(xì) 管內(nèi)徑為50pm，運(yùn)行電壓為15 30kV,毛細(xì)管溫度為20~30°C，流體力學(xué)進(jìn)樣 50mbar5秒，電極由'+ ，至U '_，，檢測(cè)波長(zhǎng)為228nm;在緩沖溶液中加入十 二烷基基硫酸鈉的濃度為O.Ol-O.lM。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種毛細(xì)管電泳法檢測(cè)雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體的方法，其特征是用甲醇水=1: 1 (體積比)溶液配制雷替曲塞手性物分析樣品，供試品濃度在50 200嗎/ml之間，對(duì)映異構(gòu)體的濃度lpg/ml 100^ig/ml。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種毛細(xì)管電泳法檢測(cè)雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體的方法， 其特征是所述運(yùn)行電壓20kV;毛細(xì)管的溫度25'C，十二烷基硫酸鈉的濃度是 30mM.，緩沖液的pH值是8，手性選擇劑為羧甲基-P-環(huán)糊精，其濃度為8mM。 7、根據(jù)權(quán)利要求所述的一種毛細(xì)管電泳法檢測(cè)雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體的方法，其 特征是雷替曲塞對(duì)映異體的計(jì)算方法是配制雷替曲塞供試品溶液及含1%雷 替曲塞對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品的雷替曲塞的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，雷替曲塞供試 品溶液中對(duì)映構(gòu)體的相應(yīng)的峰面積不得大于對(duì)照溶液中對(duì)映異構(gòu)體的峰面積。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種毛細(xì)管電泳法檢測(cè)雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體的方法。它通過(guò)毛細(xì)管電泳將雷替曲塞及其對(duì)映異構(gòu)體分離，按主成份自身對(duì)照法計(jì)算雷替曲塞中其對(duì)映異構(gòu)體的限度；用甲醇∶水＝1∶1(體積比)溶液配制備供試品溶液，毛細(xì)管電泳的電泳緩沖液為Tris-H₃PO₄，該緩沖液pH值為6.0～10，在該緩沖液中加入手性選擇劑和十二烷基硫酸鈉。它克服了由于雷替曲塞分子結(jié)構(gòu)中即含有羧基又含有氨基，用手性流動(dòng)相及手性柱分離對(duì)映異構(gòu)體困難且成本較高的缺點(diǎn)，本法分離效果好，無(wú)污染，成本低，適合雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體的檢查。
文檔編號(hào)G01N27/447GK101221147SQ20071013197
公開(kāi)日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2007年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月25日
發(fā)明者付曉芳, 一 劉, 劉虎威, 孫海勝, 朱玲玲, 鐘加勝, 陸小平, 娟 陳, 超 馬 申請(qǐng)人:揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司