專利名稱：一種白細(xì)胞分類試劑和其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白細(xì)胞分類試劑和其使用方法，具體地說涉及通過適宜的電子儀器自動(dòng)區(qū)分血液中白細(xì)胞各亞群的試劑和方法。

背景技術(shù)：
正常外周血中的白細(xì)胞通?？煞譃槲孱?，即淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。由血液樣本分析白細(xì)胞群體可為眾多疾病的臨床診斷提供許多有用的信息。例如，在出現(xiàn)疾病時(shí)血液中的各類白細(xì)胞的比例和數(shù)量可能發(fā)生變化，同時(shí)還可能出現(xiàn)異常淋巴細(xì)胞和幼稚粒細(xì)胞等異常白細(xì)胞。因此，分類并測(cè)定不同類型的正常和異常白細(xì)胞可獲得有關(guān)疾病潛伏、起始和發(fā)展階段等方面的信息。
傳統(tǒng)血液樣本分析主要是將血液樣本涂片，用特異染料進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的著色，并于顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)白細(xì)胞各亞群的種類和數(shù)目。這種方法費(fèi)時(shí)，而且操作人員的個(gè)體識(shí)別差異產(chǎn)生不同的結(jié)果，因此發(fā)展了利用流式技術(shù)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)來自動(dòng)分析白細(xì)胞亞群的方法。
目前的對(duì)血液樣本中白細(xì)胞進(jìn)行分類的方法有很多，包括采用射頻、高角散射、低角散射、阻抗、側(cè)向散射等分別組合的方法，或采用幾步的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)白細(xì)胞的分類。目前儀器分析主要采用溶血?jiǎng)⒀簶颖局械募t細(xì)胞系溶解，使白細(xì)胞產(chǎn)生不同的皺縮而形成大小或散射光強(qiáng)度的差異。
美國(guó)專利4751179公開了一種試劑體系和自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置，其可確定白細(xì)胞的四種亞群，即淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞。但該體系需要將樣本混合物在60-75℃下加熱，由此增加了設(shè)備的復(fù)雜性和成本，并且不能識(shí)別異常淋巴細(xì)胞和幼稚粒細(xì)胞。
中國(guó)專利CN1084473C、CN1113241C公開了白細(xì)胞4分類試劑和嗜堿粒細(xì)胞的測(cè)量試劑，以及使用它們將白細(xì)胞5分類的方法。該專利的方法采用狹角散射光測(cè)定細(xì)胞大小信息，并通過廣角散射光測(cè)定細(xì)胞形態(tài)信息而實(shí)現(xiàn)白細(xì)胞的4分類，而由嗜堿試劑單測(cè)嗜堿細(xì)胞，從而組成白細(xì)胞5分類識(shí)別，其獨(dú)特之處是采用有機(jī)酸類化合物調(diào)整白細(xì)胞的形態(tài)信息。然而該方法無法檢測(cè)異常白細(xì)胞。
美國(guó)專利US6004816公開了采用熒光染料標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)RNA的方法，從而通過側(cè)向散射光和熒光強(qiáng)度來分類和計(jì)數(shù)白細(xì)胞，同時(shí)識(shí)別和計(jì)數(shù)異常淋巴細(xì)胞、未成熟粒細(xì)胞等。但是，該專利中使用的熒光染料光穩(wěn)定性不足，容易造成實(shí)驗(yàn)誤差。
因此，需要新的試劑和方法來區(qū)分和計(jì)數(shù)血液中的正常白細(xì)胞，同時(shí)識(shí)別血液中的異常白細(xì)胞，該方法應(yīng)具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，并且成本低廉。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供能夠區(qū)分和計(jì)數(shù)血液中的正常白細(xì)胞，同時(shí)識(shí)別血液中的異常白細(xì)胞(如異常淋巴細(xì)胞和未成熟粒細(xì)胞)的試劑，所述試劑包含具有以下結(jié)構(gòu)的熒光染料
其中R1、R2、R3、R4獨(dú)立選自氫、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n為1-3的整數(shù)，Y-為負(fù)離子。
優(yōu)選所述熒光染料具有如式II所示的分子結(jié)構(gòu)
優(yōu)選所述試劑還包含紅細(xì)胞溶解劑，所述紅細(xì)胞溶解劑可包含陽(yáng)離子表面活性劑、非離子表面活性劑、緩沖劑或它們的任何組合，還可任選包含醇。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含本文中所述的白細(xì)胞分類試劑。
在再另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種將血液中白細(xì)胞分類的方法，所述方法包括 1)將血液樣品與適量的紅細(xì)胞溶解劑溶液混合； 2)將式I的熒光染料溶液加入步驟1)的混合物中
其中R1、R2、R3、R4獨(dú)立選自氫、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n為1-3的整數(shù)，Y-為負(fù)離子； 3)測(cè)定步驟2)中所得混合物的至少一種散射光特性和至少一種熒光特性； 4)根據(jù)散射光特性和熒光特性將白細(xì)胞分類和/或計(jì)數(shù)。
或者，本發(fā)明提供一種將血液中白細(xì)胞分類的替代方法，其中將紅細(xì)胞溶解劑溶液和熒光染料溶液同時(shí)加入樣品中。
本發(fā)明的這些特征和優(yōu)點(diǎn)以及其他特征和優(yōu)點(diǎn)在參考以下附圖和本發(fā)明的具體實(shí)施方式
之后將變得顯而易見。



圖1為使用實(shí)施例1的組合物對(duì)正常血液樣本(1號(hào)血液樣本)的分析結(jié)果二維示意圖。
圖2為使用實(shí)施例1的組合物對(duì)異常血液樣本(2號(hào)血液樣本)的分析結(jié)果二維示意圖。
圖3為使用實(shí)施例1的組合物對(duì)異常血液樣本(3號(hào)血液樣本)的分析結(jié)果二維示意圖。

具體實(shí)施例方式 除另有說明外，本文中使用的術(shù)語具有以下含義。
本文中使用的術(shù)語“血液”或“血液樣品”是指包含血細(xì)胞的體液樣品，例如外周血、骨髓液等。
本文中使用的術(shù)語“異常細(xì)胞”是指通常不出現(xiàn)在血液中的細(xì)胞，包括不成熟細(xì)胞和異常成熟細(xì)胞，例如不成熟淋巴細(xì)胞、不成熟髓細(xì)胞(在本文中也稱為Blast)、異常成熟淋巴細(xì)胞、異常成熟髓細(xì)胞、有核紅細(xì)胞等。
本文使用的術(shù)語“烷基”指有1-20個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴基；所述烷基可任選帶有一個(gè)或多個(gè)取代基，例如鹵素、羥基、氰基、硝基、氨基、巰基、烷氧基、芳基、芳烷基、雜環(huán)基、鹵代烷基、鹵代芳基、鹵代芳烷基等，只要所述取代可形成化學(xué)上穩(wěn)定的化合物，并且不影響本發(fā)明熒光染料的熒光性質(zhì)。
本文使用的術(shù)語“烯基”指有2-20個(gè)碳原子并具有至少一個(gè)碳碳雙鍵的直鏈或支鏈烴基；所述烯基可任選帶有一個(gè)或多個(gè)取代基，例如鹵素、羥基、氰基、硝基、氨基、巰基、烷氧基、芳基、芳烷基、雜環(huán)基、鹵代烷基、鹵代芳基、鹵代芳烷基等，只要所述取代可形成化學(xué)上穩(wěn)定的化合物，并且不影響本發(fā)明熒光染料的熒光性質(zhì)。
本文使用的術(shù)語“炔基”指有2-20個(gè)碳原子并具有至少一個(gè)碳碳三鍵的直鏈或支鏈烴基；所述炔基可任選帶有一個(gè)或多個(gè)取代基，例如鹵素、羥基、氰基、硝基、氨基、巰基、烷氧基、芳基、芳烷基、雜環(huán)基、鹵代烷基、鹵代芳基、鹵代芳烷基等，只要所述取代可形成化學(xué)上穩(wěn)定的化合物，并且不影響本發(fā)明熒光染料的熒光性質(zhì)。
熒光染料 本發(fā)明的熒光染料能夠特異性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)核酸(RNA、DNA)。優(yōu)選所述染料為紅色激發(fā)熒光染料，能夠被紅色半導(dǎo)體激光器等提供紅色區(qū)域激光的器件發(fā)出的紅色激光所激發(fā)，這樣本發(fā)明試劑可用于采用半導(dǎo)體激光器等廉價(jià)設(shè)備作為光源的血液分析儀或流式細(xì)胞儀等。在一個(gè)實(shí)施方案中，熒光染料具有式I所示的結(jié)構(gòu)
其中R1、R2、R3、R4獨(dú)立選自氫、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n為1-3的整數(shù)，Y-為負(fù)離子。
優(yōu)選本發(fā)明的熒光染料具有下式II的結(jié)構(gòu)
本發(fā)明的熒光染料可以溶解在乙醇、二甲亞砜、乙二醇中并作為儲(chǔ)存液保存，也可以溶解在其它非水溶劑中。本發(fā)明優(yōu)選使用乙二醇作為溶劑，并任選含有5-10％的甲醇作為稀釋液的成分。此外，為了防止熒光染料聚集，本發(fā)明還可任選包含非離子表面活性劑作為分散劑，使熒光染料保持一定的溶解度，不產(chǎn)生聚集。這種非離子表面活性劑例如為聚氧乙烯乙二醇(POE)、聚丙烯乙二醇(POP)、聚氧乙烯乙二醇-聚丙烯乙二醇(POE-POP)、Brij系列非離子表面活性劑。本發(fā)明優(yōu)選使用Brij 35、Brij56等作為熒光染料的分散劑，濃度為0.02-2％。
或者，本發(fā)明的熒光染料可與紅細(xì)胞溶解劑配制在一起，形成單組分試劑。
紅細(xì)胞溶解劑 本發(fā)明使用的紅細(xì)胞溶解劑可包含陽(yáng)離子表面活性劑、非離子表面活性劑、緩沖劑或它們的任何組合。
本發(fā)明采用陽(yáng)離子表面活性劑和非離子表面活性劑作為溶解紅細(xì)胞的試劑，它們的組合可溶解血液樣本中紅細(xì)胞，并且適當(dāng)破壞各亞群白細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使血液中白細(xì)胞的各亞群收縮成適當(dāng)?shù)拇笮?，促進(jìn)白細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同的凝聚，造成散射光特性的差別。陽(yáng)離子表面活性劑可以為溴化辛基三甲基銨(OTAB)、溴化癸基三甲基銨(DTAB)、氯化十二烷基三甲基銨(LTAC)、十四烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十四烷基三甲基氯化銨(CTAC)等，優(yōu)選為L(zhǎng)TAC，使用濃度為300-800mg/L。非離子表面活性劑可采用聚氧乙烯型非離子表面活性劑，如長(zhǎng)鏈脂肪醇聚氧乙烯、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、脂肪胺聚氧乙烯醚等，本發(fā)明優(yōu)選非離子表面活性劑為聚氧乙烯-2，3-十二烷基醚(Brij35)，使用濃度為1-5g/L。
本發(fā)明的試劑中可含有保持pH并對(duì)血液樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋的緩沖液。緩沖液使pH保持在恒定范圍內(nèi)，由此可穩(wěn)定各亞群白細(xì)胞的染色效果，緩沖劑的使用濃度在0.01-200mM范圍內(nèi)。對(duì)緩沖液的種類并沒有特別限定，只要它們可適用于本發(fā)明的目的，例如適當(dāng)濃度的羧酸鹽類、磷酸鹽類、檸檬酸鹽類、Tris-HCl、MOPS以及其它有機(jī)緩沖劑等。本發(fā)明試劑中的合適pH因所選擇的具體熒光染料不同而有所不同，一般在pH 7.0-8.0范圍內(nèi)，優(yōu)選的pH是7.0。本發(fā)明優(yōu)選Tris-HCl或MOPS緩沖體系。
本發(fā)明的紅細(xì)胞溶解劑中還可任選包含適當(dāng)比例的醇，如甲醇，以促進(jìn)白細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的凝聚。
檢測(cè)試劑盒 在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供用于能夠區(qū)分和計(jì)數(shù)血液中的正常白細(xì)胞，同時(shí)識(shí)別血液中的異常白細(xì)胞如異常淋巴細(xì)胞和未成熟粒細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含白細(xì)胞分類試劑，所述白細(xì)胞分類試劑包含具有以下結(jié)構(gòu)的熒光染料
其中R1、R2、R3、R4獨(dú)立選自氫、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n為1-3的整數(shù)，Y-為負(fù)離子。
優(yōu)選所述熒光染料具有以下結(jié)構(gòu)
優(yōu)選所述白細(xì)胞分類試劑還包含本文上述的紅細(xì)胞溶解劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述熒光染料作為儲(chǔ)存液形式存在，保存在單獨(dú)的容器中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述熒光染料與上述紅細(xì)胞溶解劑一起配制為單成分溶液。
此試劑盒優(yōu)選包含適于密封保持在至少一個(gè)容器中的分區(qū)存放的熒光染料。所述試劑盒還可包含將血液中白細(xì)胞分類所需的其它白細(xì)胞分類試劑以及測(cè)定白細(xì)胞的方法的說明。所述試劑盒還可包含可測(cè)定并與測(cè)試樣品對(duì)比的對(duì)照樣品或一系列對(duì)照樣品。試劑盒的各組分可封裝在單個(gè)容器中，不同容器連同說明一起全部在單獨(dú)包裝中，所述試劑盒用于分類和/或計(jì)數(shù)血液中的各類白細(xì)胞。
使用方法 在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供分類和/或計(jì)數(shù)血液中白細(xì)胞的方法。簡(jiǎn)單地說，在本發(fā)明的方法中，通過將血液樣本與本發(fā)明的試劑混合，隨后測(cè)定樣品的至少一種散射光特性和至少一種熒光特性，并根據(jù)散射光特性和熒光特性將樣品分類和/或計(jì)數(shù)。
本發(fā)明方法中使用的血液樣本可以是全血，也可以是成分血?？墒寡簶悠肥紫扰c紅細(xì)胞溶解劑和緩沖劑混合，使得紅細(xì)胞被溶解，各亞群的白細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的皺縮。該步驟同時(shí)在待測(cè)定白細(xì)胞的細(xì)胞膜上形成小孔，這種小孔足以允許熒光染料分子通過細(xì)胞膜。
隨后加入熒光染料儲(chǔ)存液，使得白細(xì)胞被熒光標(biāo)記。在血液樣本與試劑混合時(shí)，血液樣本與本發(fā)明試劑的總體積應(yīng)保證足夠的細(xì)胞濃度通過儀器的測(cè)量池。本發(fā)明的試劑組合物將血液樣本稀釋至1∶10、1∶50或1∶100或以上任何范圍中的任何值，只要該稀釋符合實(shí)際使用的要求。這種調(diào)整在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍內(nèi)。
樣品混合物可在孵育池中進(jìn)行溫育，溫育時(shí)間不超過40秒，優(yōu)選24秒；溫育溫度可為任何合適的溫度，例如42℃。隨后稀釋并染色的血液樣品導(dǎo)入流動(dòng)室中，通過血液分析儀或類似的流式細(xì)胞儀的檢測(cè)通道，檢測(cè)和分析白細(xì)胞的至少一種散射光特性和至少一種熒光特性。
本發(fā)明中的散射光是指可由市售血液分析儀或類似的流式細(xì)胞儀檢測(cè)的散射光。這種散射光包括但不限于側(cè)向散射光、正向低角度散射光(接受光角度為約0-5度)和正向高角度散射光(接受光角度為約5-20度)。具有這種角度的散射光反映了白細(xì)胞大小或內(nèi)部結(jié)構(gòu)的信息，因此用作本發(fā)明的散射光。優(yōu)選側(cè)向散射光。
與細(xì)胞中核酸如DNA和RNA結(jié)合的熒光染料發(fā)射熒光。熒光特性是反映血液樣本中細(xì)胞內(nèi)熒光染料量的參數(shù)。由于不同亞群的細(xì)胞內(nèi)代謝活動(dòng)不同，而造成核酸含量的差異，因此不同亞群的白細(xì)胞的熒光特性在某些方面具有差異。取決于所使用的具體染料選擇合適的激發(fā)光波長(zhǎng)，并監(jiān)測(cè)相應(yīng)波長(zhǎng)的發(fā)射光。本發(fā)明優(yōu)選采用紅色半導(dǎo)體激光器發(fā)射的紅色波長(zhǎng)區(qū)域激光為檢測(cè)的光源。對(duì)所述紅色波長(zhǎng)的光源沒有特殊的限制，只要能夠發(fā)出所選擇熒光染料的激發(fā)波長(zhǎng)附近的紅色光，例如約波長(zhǎng)600-680nm的光。例如可以使用He-Ne激光器、紅色區(qū)域的半導(dǎo)體激光器等。優(yōu)選使用半導(dǎo)體激光器，因?yàn)樗鄬?duì)于其它激光器成本較低，并且體積較小，這樣可降低設(shè)備的成本和體積。
利用散射光特性和熒光特性識(shí)別各亞群白細(xì)胞，以及可能的異淋、幼稚粒細(xì)胞等異常信息，并對(duì)各聚類散點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)的分類計(jì)數(shù)，計(jì)算各亞群白細(xì)胞的百分比。散射光反映細(xì)胞內(nèi)部顆粒程度，細(xì)胞內(nèi)部的顆粒程度大致為嗜酸細(xì)胞內(nèi)部有兩分葉核并且內(nèi)部有很多酸性染料染色的脆質(zhì)微粒；中性粒細(xì)胞核(分葉或桿狀)且內(nèi)部顆粒較多；單核細(xì)胞為單大核內(nèi)部顆粒較少；LYM細(xì)胞單大核基本沒有顆粒。所以相同條件下各類白細(xì)胞的散射光強(qiáng)度特性順序?yàn)镋O(嗜酸細(xì)胞)＞NEUT(中性粒細(xì)胞)＞MONO(單核細(xì)胞)＞LYM(淋巴細(xì)胞)。
實(shí)施例1 染料的合成 示例性的熒光染料通過以下方式合成，其中所述染料具有以下結(jié)構(gòu)
將20mmol 2-甲基苯并噻唑和22mmol溴化芐加入到50ml含20ml甲苯的圓底燒瓶中，氬氣保護(hù)。反應(yīng)加熱回流持續(xù)反應(yīng)24小時(shí)后停止?；旌衔锢鋮s后過濾沉淀并用乙醚洗滌濾餅。干燥后得到淡粉色的固體粉末，為中間體1-芐基-2-甲基苯并噻唑季銨鹽，收率58％。
將10mmol1-芐基-2-甲基苯并噻唑季銨鹽與30mmol N，N’-二苯基甲脒在60ml醋酸中，于90℃油浴上加熱攪拌1.5小時(shí)。將反應(yīng)得到的紅色油狀物用石油醚懸濁洗滌3次，除去醋酸。然后加入一定量的乙醚析出橙色固體粉末，過濾，干燥。將此粗產(chǎn)品通過硅膠柱分離，用洗脫液二氯甲烷∶甲醇＝100∶3，收集黃色組分，收率42％。向其中加入4mmol 1-芐基-4-甲基喹啉季銨鹽及10ml吡啶，90℃油浴上加熱攪拌1.5小時(shí)。將反應(yīng)液倒入乙醚中，析出暗紫色小顆粒，過濾，干燥。染料通過硅膠柱分離，用二氯甲烷∶甲醇＝100∶5洗脫液洗脫，收集藍(lán)色組分，收率70％。
1H-NMRδ(400MHz，CD3OD，TMS)5.49(s，2H)，5.71(s，2H)，6.44(d，1H)，6.98(d，1H)，7.18-7.80(m，18H)，8.23(t，1H)，8.31(d，1H)，8.36(d，1H)。MS(EI)C33H27BrN2S m/z483.2[M-Br]+。
實(shí)施例2 試劑的配制 配制如下組成的試劑體系。
A熒光染料儲(chǔ)存液 熒光染料30mg 乙二醇 900ml 甲醇100ml B紅細(xì)胞溶解劑溶液 LTAC 550mg Brij351.5g 三羥甲基氨基甲烷(Tris)13g HCl(13N) 5.8ml 精制水1L 最后將溶液調(diào)整pH為7。
實(shí)施例3 各種血液樣品的測(cè)定和結(jié)果 將1ml紅細(xì)胞溶解劑與經(jīng)過抗凝劑處理的20微升血液混勻，并立即加入20微升熒光染料儲(chǔ)存液，在42℃下的孵育池中混勻孵育24秒，形成測(cè)定用試樣。測(cè)定測(cè)定用試樣的側(cè)向散射光強(qiáng)度和側(cè)向熒光強(qiáng)度。對(duì)正常血液樣本1號(hào)樣本的測(cè)試結(jié)果如圖1所示，表明本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)白細(xì)胞五個(gè)亞群的分類識(shí)別。對(duì)異常血液樣本2號(hào)樣本(如圖2所示)的測(cè)試表明，本發(fā)明可有效的區(qū)分嗜酸細(xì)胞，而且能夠有效的識(shí)別異常白細(xì)胞，包括幼稚粒細(xì)胞、異常淋巴細(xì)胞等。對(duì)異常血液樣本3號(hào)樣本(如圖3所示)的測(cè)試表明，本發(fā)明不僅能夠?qū)崿F(xiàn)白細(xì)胞各亞群的有效分類，而且能夠有效的識(shí)別異常淋巴類細(xì)胞。
本文中的所有數(shù)據(jù)、圖像、儀器、試劑和步驟應(yīng)理解為說明性而非限制性的。雖然已結(jié)合上述具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，許多修改和其它變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。所有這種修改和其它變化也落入本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種白細(xì)胞分類試劑，所述試劑包含具有式I的熒光染料
其中R1、R2、R3、R4獨(dú)立選自氫、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n為1-3的整數(shù)，Y-為負(fù)離子。
2.權(quán)利要求1的白細(xì)胞分類試劑，其中所述熒光染料為具有下式的化合物
3.權(quán)利要求1或2的白細(xì)胞分類試劑，其中所述熒光染料的濃度為1-1000mg/L，優(yōu)選2-100mg/L，更優(yōu)選5-50mg/L，最優(yōu)選10-20mg/L。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的白細(xì)胞分類試劑，所述試劑還包含紅細(xì)胞溶解劑。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的白細(xì)胞分類試劑，其中所述熒光染料為單獨(dú)的熒光染料儲(chǔ)存液。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的白細(xì)胞分類試劑，其中所述紅細(xì)胞溶解劑可包含陽(yáng)離子表面活性劑、非離子表面活性劑、緩沖劑或它們的任何組合，所述陽(yáng)離子表面活性劑選自溴化辛基三甲基銨(OTAB)、溴化癸基三甲基銨(DTAB)、氯化十二烷基三甲基銨(LTAC)、十四烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十四烷基三甲基氯化銨(CTAC)和它們的混合物，優(yōu)選LTAC，濃度范圍為300-800mg/L；所述非離子表面活性劑選自長(zhǎng)鏈脂肪醇聚氧乙烯、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、脂肪胺聚氧乙烯醚和它們的混合物，優(yōu)選聚氧乙烯-2，3-十二烷基醚(Brij35)，濃度范圍為1-5g/L；所述緩沖劑選自羧酸鹽類、磷酸鹽類、檸檬酸鹽類、Tris-HCl、MOPS和它們的混合物，優(yōu)選Tris-HCl或MOPS，它們將測(cè)定體系的pH保持在7.0-8.0；任選其中還包含適當(dāng)比例的醇，例如甲醇。
7.一種檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的白細(xì)胞分類試劑。
8.一種將血液中白細(xì)胞分類的方法，所述方法包括
1)將血液樣品與適量的紅細(xì)胞溶解劑溶液混合；
2)將式I的熒光染料溶液加入步驟1)的混合物中
其中R1、R2、R3、R4、Y-和n如權(quán)利要求1中定義；
3)測(cè)定步驟2)中所得混合物的至少一種散射光特性和至少一種熒光特性；
4)根據(jù)散射光特性和熒光特性將白細(xì)胞分類和/或計(jì)數(shù)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述式I的熒光染料為
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中將紅細(xì)胞溶解劑溶液和熒光染料溶液同時(shí)加入樣品中。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含式I熒光染料的白細(xì)胞分類試劑，其中R1、R2、R3、R4、Y-和n如說明書中定義。本發(fā)明還提供了包含該白細(xì)胞分類試劑的試劑盒，以及使用該白細(xì)胞分類試劑將白細(xì)胞分類的方法。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101349644SQ20071013917
公開日2009年1月21日 申請(qǐng)日期2007年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日
發(fā)明者兵 徐, 張寶華, 匡玉吉 申請(qǐng)人:深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司