專利名稱：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膀胱功能測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種功能實(shí)驗(yàn)方法，具體涉及一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膀胱功能的測定方 法。本方法可以用于測定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膀胱逼尿肌的興奮性、自律性、收縮能力以 及順應(yīng)性。
背景技術(shù)：
膀胱功能為周期性儲(chǔ)尿和排尿。在儲(chǔ)尿期，達(dá)到最大膀胱容量前，膀胱內(nèi)
壓較低并維持相對(duì)穩(wěn)定，無逼尿肌收縮；在排尿期，逼尿肌收縮，尿道內(nèi)、外 括約肌協(xié)調(diào)性松弛，排空膀胱。逼尿肌作為一種存在于膀胱的特殊平滑肌，屬 于單個(gè)單位平滑肌(single-unit smooth muscle)或內(nèi)臟平滑肌(visceral smooth muscle),該類平滑肌的特點(diǎn)是牽張刺激能夠引起肌肉的收縮反應(yīng)，并 且這類平滑肌中還存在少數(shù)具有自主節(jié)律性的細(xì)胞，可以成為起博點(diǎn)，帶動(dòng)整 個(gè)肌肉的電活動(dòng)和機(jī)械活動(dòng)。生理學(xué)把組織受到刺激后產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力稱 為興奮性，刺激量的變化可以反映組織的興奮性。對(duì)于逼尿肌而言，引起逼尿 肌自發(fā)收縮的機(jī)械性張力閾值越小，表明其興奮性越高。反之，張力閾值越大， 其興奮性越低。另外，肌條在閾刺激下誘發(fā)的收縮頻率可以反映出逼尿肌的自 律性。肌肉的收縮能力是指與負(fù)荷無關(guān)的、決定肌肉收縮的內(nèi)在的特性，它的 變化直接影響肌肉收縮產(chǎn)生的張力和(或)肌肉縮短的程度以及縮短速度，最 大和平均收縮力能夠反映逼尿肌收縮能力的變化情況。膀胱的順應(yīng)性是反映膀 胱壁以最小壓力變化換取最大容量的先天能力，順應(yīng)性的高低主要隨著膀胱的 粘彈性和逼尿肌肌張力的改變而改變。膀胱的粘彈性特點(diǎn)可以使膀胱壁伸展所 產(chǎn)生的張力在膀胱充盈速度減慢或者停止時(shí)降低或者停止，產(chǎn)生所謂的壓力釋 放效應(yīng)，而當(dāng)膀胱壁伸展速度超過壓力釋放速度時(shí)，充盈期膀胱內(nèi)壓則有一定' 升高。膀胱平滑肌、膠原纖維、粘膜及粘膜下肌層的彈性也均可影響膀胱的順 應(yīng)性。膀胱功能正常的重要標(biāo)志是在儲(chǔ)尿期保持膀胱內(nèi)低壓狀態(tài),這與膀胱的舒張功能密切相關(guān)。
逼尿肌是一個(gè)平滑肌肌束交叉聚集的整體單位，平滑肌束的自由交叉移動(dòng) 調(diào)整著膀胱腔內(nèi)容積壓力的變化，實(shí)現(xiàn)尿液貯存和排出的功能。不同于血管壁 或胃腸道平滑肌呈環(huán)行或縱行的分層排列，逼尿肌細(xì)胞在膀胱壁的分布是由直 徑較大的平滑肌細(xì)胞交織排列成相對(duì)緊密的肌肉束，各東之間自由交叉，沒有 固定的方向，是不同平面的肌纖維相互交錯(cuò)，呈三維分布。除膀胱頸外，整個(gè)膀 胱壁尤如肌東編織的網(wǎng)狀物，因此，從結(jié)構(gòu)學(xué)觀點(diǎn)來看，從任何一個(gè)切面都難 以得到完整的逼尿肌細(xì)胞，而這種特殊的結(jié)構(gòu)是與膀胱排尿期逼尿肌細(xì)胞能同 步而有效地收縮這一功能相適應(yīng)的。
目前用于評(píng)價(jià)逼尿肌收縮功能的方法主要有
1. 在體膀胱測壓實(shí)驗(yàn)
抓起大鼠使直立位，此時(shí)大鼠可出現(xiàn)自主排尿。用5%水合氯醛腹腔注射麻 醉(300mg/kg)，仰臥固定，消毒下腹部，恥骨上切口顯露膀胱，41/2號(hào)頭皮針穿 刺進(jìn)膀胱作為膀胱測壓管，lmL注射器經(jīng)穿刺針連接導(dǎo)管測定殘余尿后，將測壓 導(dǎo)管經(jīng)三通管分別與尿動(dòng)力儀及微量灌注泵相連，腹腔內(nèi)放置硬膜外導(dǎo)管作為 腹壓測定管并與尿動(dòng)力儀的相應(yīng)連接管相連。以0.2mL/min的速度用生理鹽水 灌注膀胱，進(jìn)行充盈性膀胱測壓，記錄膀胱壓力變化與灌注量之間的關(guān)系。膀 胱的順應(yīng)性以灌注量變化與膀胱壓力變化的比值表示，膀胱最大容量以出現(xiàn)尿 道口連續(xù)漏尿時(shí)的膀胱灌注量表示。在儲(chǔ)尿期出現(xiàn)造成膀胱內(nèi)壓升高超過 15cmH20柱的逼尿肌收縮波即為逼尿肌不穩(wěn)定。
2. 離體膀胱測壓實(shí)驗(yàn)
仰臥位固定大鼠，100mg/kg體重腹腔注射烏拉坦進(jìn)行麻醉，取下腹正中切 口，結(jié)扎雙側(cè)輸尿管，遠(yuǎn)離膀胱頸部離斷尿道，完整取出膀胱，置于37°C, pH -7.4,充氧(95%02, 5%0)2)的Krebs營養(yǎng)液中備用。
取一硬膜外導(dǎo)管， 一端經(jīng)尿道插入離體膀胱并妥善固定，另一端經(jīng)三通管分別連接微量灌注泵和尿動(dòng)力儀，作膀胱灌注和測壓之用。全部實(shí)驗(yàn)過程均在
37°C, pH = 7.4,充氧(95%02, 5%C02)的Krebs營養(yǎng)液中進(jìn)行。首先將離體膀胱 溫育平衡30min,接著以0. 2mL/min的速度用0.9%生理鹽水進(jìn)行膀胱灌注。當(dāng) 膀胱壓力上升達(dá)到前10min壓力的2倍以上時(shí)容量為膀胱最大容量。排空膀胱 后靜置15min，. Krebs營養(yǎng)液中加入lmmol/L Carbachol再次進(jìn)行恒速灌注，當(dāng) 達(dá)到最大膀胱容量時(shí)記錄膀胱壓力的變化情況；以0. 09mL/min灌注達(dá)1/2最大 膀胱容量時(shí)停止灌注，更換肌槽內(nèi)Krebs液，加入lmmolISO作用15min后，觀 察膀胱壓力改變。
3.離體逼尿肌肌條實(shí)驗(yàn)
擊打大鼠致昏，剪開下腹部取出膀胱，稱重后即刻放入4"CKrebs營養(yǎng)液中 備用。解剖鏡下剔除膀胱粘膜，由內(nèi)向外切取8咖長，2鵬寬的膀胱內(nèi)側(cè)壁縱行 肌條，取一根肌條，兩端以4/0絲線結(jié)扎， 一端固定于肌條固定板底部，另一 端與拉力傳感器感應(yīng)頭相連。將肌條置于充滿Krebs液的恒溫器官槽中，無張 力情況下溫浴30min。在實(shí)驗(yàn)過程中器官槽內(nèi)的液體溫度利用恒溫泵保持在 37°C，通以含95%氧氣，5%二氧化碳的混合氣體，釆用恒壓灌流方式保持灌流槽 內(nèi)的液體成分不變。逐漸緩慢牽拉肌條使肌條張力增加，直至出現(xiàn)每分鐘1次~ 7次的自發(fā)收縮，此時(shí)的肌條張力作為自發(fā)收縮的張力閾值。在靜置過程中就出 現(xiàn)自發(fā)收縮者，張力閾值為0。穩(wěn)定'15min,連續(xù)記錄肌條張力變化45min，記 錄單位時(shí)間內(nèi)期相性收縮峰數(shù)目，為自發(fā)性收縮頻率；連續(xù)計(jì)算10個(gè)收縮峰的 收縮幅度，取平均值，為平均收縮力；在該時(shí)間段紀(jì)錄最大收縮幅度，為最大 收縮力。
以上各種實(shí)驗(yàn)中，離體逼尿肌肌條實(shí)驗(yàn)是最常釆用的反應(yīng)膀胱收縮能力的 實(shí)驗(yàn)。對(duì)于逼尿肌肌條的釆集，文獻(xiàn)中大多是釆用膀胱前壁的縱行肌條，國內(nèi) 學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，釆用膀胱側(cè)壁的縱行肌條。眾所周知，膀胱壁是由犬牙 交錯(cuò)的平滑肌纖維組織交織而成的，猶如起自尿道的互相交織的球形囊袋，膀胱的肌層直接地不可分離地延續(xù)到尿道的肌層， 一直到膀胱尿道接合部(通常 稱為膀胱頸)。膀胱的肌層從功能上劃分為體部和底部。膀胱底逼尿肌的近端位 于包繞兩側(cè)近膀胱輸尿管區(qū)的輸尿管外鞘，遠(yuǎn)端位于尿道肌層，通過膀胱尿道 連接部一直延續(xù)。膀胱體逼尿肌的肌肉組織以肌東形式組成，肌束在膀胱壁內(nèi) 不斷發(fā)出分支，又不斷再結(jié)合，同時(shí)改變著深度和方向，彼此交織在一起，最 終膀胱體逼尿肌構(gòu)成了一個(gè)互相交織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使得排尿時(shí)能夠進(jìn)行整體一 致地收縮。膀胱體逼尿肌的肌束在延續(xù)為膀胱底逼尿肌時(shí)進(jìn)行了重新排列，膀 胱底逼尿肌由膀胱壁所有方向的肌肉組織所組成，在膀胱頸區(qū)形成環(huán)形、三角 形等形狀的復(fù)合排列。由于膀胱逼尿肌的這一特殊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使得無論釆集膀 胱前壁還是側(cè)壁的逼尿肌肌條，都不是一個(gè)完整的結(jié)構(gòu)單位，用逼尿肌肌條試 驗(yàn)來觀察膀胱的功能改變，只能夠部分反映出膀胱的功能。更為重要的是，如 果單純用逼尿肌肌條來測定膀胱功能，也不能反映出逼尿肌的順應(yīng)性。
進(jìn)一步的研究表明，膀胱體部的環(huán)形收縮力要大于縱向收縮力，且占主導(dǎo) 地位。逼尿肌肌條試驗(yàn)采用的是縱向切取組織，因此，在反映逼尿肌收縮力方
面也存在著一定的缺陷。
在體和離體膀胱測壓試驗(yàn)雖然可以在一定程度上了解膀胱的順應(yīng)性，但是
對(duì)于膀胱的興奮性、自律性以及收縮能力方面還是存在著缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膀胱功能測定方法，釆用膀胱體部的肌 環(huán)來評(píng)定膀胱功能改變，以更客觀有效地評(píng)價(jià)離體膀胱的收縮功能，全面客觀 地評(píng)估逼尿肌功能的變化。
本發(fā)明的膀胱功能測定方法包括以下步驟 l.配置Krebs營養(yǎng)液
Krebs營養(yǎng)液中的各種成分及其濃度分別為NaCl 118mmol/L， KC1 4. 75mmol/L， MgS04 1. 18mmol/L， KH2P04 1. 18mmol/L， NaHC03 24. 8mmol/L，葡萄糖10. Ommol/L, CaCl2 2. 5mmol/L, pH=7. 35 (HC1溶液緩沖)。
2. 制備逼尿肌肌環(huán)
以25%烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，剪開下腹部取出膀胱，放入4°Ckerbs 營養(yǎng)液中備用。在膀胱體部沿膀胱橫斷面切取環(huán)形肌環(huán)，剔除膀胱粘膜。
3. 肌環(huán)機(jī)械性收縮實(shí)驗(yàn)
恒溫器官槽內(nèi)加入10mLkrebs營養(yǎng)液，通入由95%02和5%0)2組成的混合氣 體，調(diào)定溫度至37°C,啟動(dòng)powerlab系統(tǒng)，將肌環(huán)一端固定于恒溫器官槽底部， 另一端與拉力傳感器感應(yīng)頭相連，并將肌環(huán)全部浸沒于krebs營養(yǎng)液中。保持 肌環(huán)處于無張力的狀態(tài)，將分析系統(tǒng)的每個(gè)通道調(diào)零，以排除肌環(huán)重量。逐漸 緩慢牽拉肌環(huán)使張力增加，直至出現(xiàn)每分鐘1次 7次的自發(fā)收縮，此時(shí)的肌環(huán) 張力作為自發(fā)收縮的張力閾值。在靜置過程中就出現(xiàn)自發(fā)收縮者，張力閾值為0。 使肌環(huán)初始張力保持在0 0.5g之間，再次靜置15 30min，待其基線平穩(wěn)并出 現(xiàn)穩(wěn)定收縮后，連續(xù)記錄肌條張力變化45min,記錄單位時(shí)間內(nèi)期相性收縮峰數(shù) 目，為自發(fā)性收縮頻率；連續(xù)計(jì)算10個(gè)收縮峰的收縮幅度，取平均值，為平均
收縮力；在該時(shí)間段紀(jì)錄最大收縮幅度，為最大收縮力。順次加入不同濃度的M 受體激動(dòng)劑Carbachol 0. lmL (1 x 10-'°、 3xl(T1。、 1 x l(T9、 3xl(T、 1 x l(T8、 3 xl(T8、 lxl0墨7、 3xl0畫7、 lxl0—6、 3xl0習(xí)6、 lxi(r5、 3 x lO—5mol/L)，釆用衡壓 灌流方式保持灌流槽內(nèi)的液體成分不變。每加一藥物濃度后約3~5min出現(xiàn)平 臺(tái)期，此時(shí)標(biāo)記并迅速加下一濃度藥物。加藥后出現(xiàn)的收縮情況可反應(yīng)逼尿肌 的收縮變化能力，便于比較不同動(dòng)物模型的逼尿肌收縮能力的差異。
4. 肌環(huán)機(jī)械性舒張實(shí)驗(yàn)
恒溫器官槽內(nèi)加入10mLkrebs營養(yǎng)液，通入由95%02和5%0)2組成的混合氣 體，調(diào)定溫度至37°C,啟動(dòng)powerlab系統(tǒng)，將肌環(huán)一端固定于恒溫器官槽底部， 另一端與拉力傳感器感應(yīng)頭相連，并將肌環(huán)全部浸沒于krebs營養(yǎng)液中。保持 肌環(huán)處于無張力的狀態(tài)，將分析系統(tǒng)的每個(gè)通道調(diào)零，以排除肌環(huán)重量。加入40mmol/L的KC1,肌環(huán)出現(xiàn)收縮，待其到達(dá)最大收縮，并達(dá)到平臺(tái)期時(shí)，順次 加入不同濃度的異丙腎上腺素(ISO) 0. lmL (lxl(T， 3xl(T， lxl(T, 3xl0一9， lxl(T8， 3xl0—8， lx10-7， 3xl0-7, lx10-6, 3xl(T6， lxl(T5， 3xl(T5mol/L),實(shí)驗(yàn)過 程中釆用衡壓灌流方式保持灌流槽內(nèi)的液體成分不變。每加一藥物濃度后約3~ 5min出現(xiàn)平臺(tái)期，此時(shí)標(biāo)記并迅速加下一濃度藥物。
逼尿肌肌條試驗(yàn)釆用的是縱向切取的組織，在反映逼尿肌收縮力方面存在 著一定的缺陷。在體和離體膀胱測壓試驗(yàn)雖然可以在一定程度上了解膀胱的順 應(yīng)性，但是對(duì)于膀胱的興奮性、自律性以及收縮能力方面還是存在著缺陷。本 發(fā)明的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膀胱功能測定方法對(duì)逼尿肌的取材部位及取材方式進(jìn)行了改 進(jìn)，切取膀胱體部的肌環(huán)進(jìn)行膀胱肌環(huán)實(shí)驗(yàn)，可以全面了解膀胱的順應(yīng)性、興 奮性、自律性和收縮能力，并且由于膀胱肌環(huán)恰好取材于環(huán)狀的膀胱組織，故 能夠很好地了解膀胱的環(huán)狀收縮情況。
本發(fā)明釆用膀胱體部的肌環(huán)來評(píng)定膀胱功能改變，在舒張?jiān)囼?yàn)中通過KC1 來誘發(fā)出逼尿肌的最大收縮，然后利用異丙腎上腺素使逼尿肌舒張，從而通過 用藥后降低的收縮力來間接反應(yīng)逼尿肌的舒張能力；在收縮試驗(yàn)中通過逐漸增 加牽張力來誘發(fā)逼尿肌收縮，通過增加牽張力以了解逼尿肌興奮性的方式。因 此，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膀胱功能測定方法既綜合了在體和離體膀胱測壓試驗(yàn)以 及逼尿肌肌條試驗(yàn)的特點(diǎn)，又考慮到膀胱的收縮是以膀胱體部環(huán)形收縮為主的 因素，從而能夠更客觀有效地來評(píng)價(jià)離體實(shí)驗(yàn)中膀胱的收縮功能和更全面客觀 地評(píng)估逼尿肌功能的變化。


圖1是6周齡正常大鼠膀胱逼尿肌肌環(huán)經(jīng)不同濃度的Carbachol液刺激后 的收縮反應(yīng)曲線；
圖2是6周齡糖尿病大鼠膀胱逼尿肌肌環(huán)經(jīng)不同濃度的Carbachol液刺激 后的收縮反應(yīng)曲線； 圖3是12周齡正常大鼠膀胱逼尿肌肌環(huán)經(jīng)不同濃度的Carbachol液刺激后 的收縮反應(yīng)曲線；
圖4是12周齡糖尿病大鼠膀胱逼尿肌肌環(huán)經(jīng)不同濃度的Carbachol液刺激 后的收縮反應(yīng)曲線；
圖5是6周齡正常大鼠膀胱逼尿肌肌環(huán)經(jīng)不同濃度的ISO液刺激后的收縮
反應(yīng)曲線；
圖6是6周齡糖尿病大鼠膀胱逼尿肌肌環(huán)經(jīng)不同濃度的ISO液刺激后的收 縮反應(yīng)曲線；
圖7是12周齡正常大鼠膀胱逼尿肌肌環(huán)經(jīng)不同濃度的ISO液刺激后的收縮 反應(yīng)曲線；
圖8是12周齡糖尿病大鼠膀胱逼尿肌肌環(huán)經(jīng)不同濃度的ISO液刺激后的收 縮反應(yīng)曲線；
圖9是正常對(duì)照組大鼠逼尿肌肌條牽張?jiān)囼?yàn)記錄(1); 圖IO是正常對(duì)照組大鼠逼尿肌肌條牽張?jiān)囼?yàn)記錄(2); 圖ll是糖尿病大鼠逼尿肌肌條牽張?jiān)囼?yàn)記錄(自發(fā)收縮)； 圖12是糖尿病大鼠逼尿肌肌條牽張?jiān)囼?yàn)記錄(收縮力增強(qiáng))； 圖13是糖尿病大鼠逼尿肌肌條牽張?jiān)囼?yàn)記錄(張力閾值顯著增高/收縮力 降低)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
分別取6周齡正常大鼠、6周齡糖尿病大鼠、12周齡正常大鼠和12周齡糖 尿病大鼠，以25%烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉，剪開下腹部取出膀胱，放入4'Ckerbs 營養(yǎng)液中備用。在膀胱體部沿膀胱橫斷面切取環(huán)形肌環(huán)，剔除膀胱粘膜，制成 膀胱逼尿肌肌環(huán)，以下述方法進(jìn)行測定。
恒溫器官槽內(nèi)加入10mLkrebs營養(yǎng)液，通入由95%02和5%0)2組成的混合氣
體，調(diào)定溫度至37°C，啟動(dòng)powerlab系統(tǒng)，將肌環(huán)一端固定于恒溫器官槽底部， 另一端與拉力傳感器感應(yīng)頭相連，并將肌環(huán)全部浸沒于krebs營養(yǎng)液中。保持 肌環(huán)處于無張力的狀態(tài)，將分析系統(tǒng)的每個(gè)通道調(diào)零，以排除肌環(huán)重量。逐漸 緩慢牽拉肌環(huán)使張力增加，直至出現(xiàn)每分鐘l次-7次的自發(fā)收縮，此時(shí)的肌環(huán) 張力作為自發(fā)收縮的張力閾值。在靜置過程中就出現(xiàn)自發(fā)收縮者，張力閾值為0。 使肌環(huán)初始張力保持在0~0. 5g之間，再次靜置15 30min，待其基線平穩(wěn)并出 現(xiàn)穩(wěn)定收縮后，連續(xù)記錄肌條張力變化45min，記錄單位時(shí)間內(nèi)期相性收縮峰數(shù) 目，為自發(fā)性收縮頻率；連續(xù)計(jì)算10個(gè)收縮峰的收縮幅度，取平均值，為平均 收縮力；在該時(shí)間段紀(jì)錄最大收縮幅度，為最大收縮力。順次加入濃度為1 x l(T、 3 x l(T1。、 1 x l(T、 3 x IO匿9、 1 x l(T8、 3 x l(T8、 1 x io墨7、 3 x l(T7、 1 x i(T6、 3 x l(T6、 lxl(T5、 3x 10-5mol/L的M受體激動(dòng)劑Carbachol 0. lmL刺激逼尿肌環(huán)收縮,釆 用衡壓灌流方式保持灌流槽內(nèi)的液體成分不變。每加一藥物濃度后約3~5min 出現(xiàn)平臺(tái)期，此時(shí)標(biāo)記并迅速加下一濃度藥物。根據(jù)收縮幅度的改變，按lmg 逼尿肌組織產(chǎn)生的張力變化值做標(biāo)準(zhǔn)化后得到張力相對(duì)變化值。 具體測定結(jié)果見圖l、圖2、圖3、圖4。
由圖l、圖2顯示試驗(yàn)結(jié)果可知，在給予不同濃度的Carbachol刺激后，逼 尿肌發(fā)生收縮反應(yīng)，且隨著藥物濃度的增加，收縮幅度也在增大。6周齡糖尿病 大鼠的最大收縮力為(1.12±0. 16) g/mg，比正常6周齡大鼠(0.99 ±0.06) g/mg的最大收縮力增高(P<0. 05)。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，6周齡糖尿病大鼠的半數(shù)有 效劑量濃度ECs。比正常6周齡大鼠敏感，分別為(1. 73士0. 36) xl(Tmol/L和 (2.67±0. 32) x10—7mol/L (P<0. 05),有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
由圖3、圖4顯示試驗(yàn)結(jié)果可知，12周齡糖尿病大鼠的最大收縮力為(1.20 ±0. I2) g/mg，與正常U周齡大鼠U.21土0. 08) g/mg的最大收縮力無明顯差 異(P>0. 05); 12周齡糖尿病大鼠半數(shù)有效濃度EC5。 ( 2. 15±0. 41x10—7mol/L ) 與12周齡正常大鼠(2. 29土0.43xl(Tmol/L)無明顯差異(P>0.05)，無顯著統(tǒng)
計(jì)學(xué)差異。
表1不同時(shí)間兩組大鼠膀胱逼尿肌最大收縮力(X+S, g/mg)
組別 _^_ 12周
糖尿病大鼠 1.12±0. 16* 1.20±0. 12
正常大鼠_0. 99 ± 0. 06_1.21±0. 08
注與正常大鼠比較，*有顯著性差異，P<0.05 ^ 表2不同時(shí)間兩組大鼠對(duì)Carbachol刺激的半數(shù)有效濃度EC5。 (X+S, x1(Tmol/L)
組另'』__12周
糖尿病大鼠 1.73±0.36* 2. 15±0.41
正常大鼠_2. 67±0. 32_2. 29±0. 43
注與正常大鼠比較，*有顯著性差異，P<0.05 ^
實(shí)施例2
分別取6周齡正常大鼠、6周齡糖尿病大鼠、12周齡正常大鼠和12周齡糖 尿病大鼠，以25%烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉，剪開下腹部取出膀胱，放入4。Ckerbs 營養(yǎng)液中備用。在膀胱體部沿膀胱橫斷面切取環(huán)形肌環(huán)，剔除膀胱粘膜，制成 膀胱逼尿肌肌環(huán)，以下述方法進(jìn)行測定。
恒溫器官槽內(nèi)加入10mLkrebs營養(yǎng)液，通入由95%02和5%(:02組成的混合氣 體，調(diào)定溫度至37°C,啟動(dòng)powerlab系統(tǒng)，將肌環(huán)一端固定于恒溫器官槽底部， 另一端與拉力傳感器感應(yīng)頭相連，并將肌環(huán)全部浸沒于krebs營養(yǎng)液中。保持 肌環(huán)處于無張力的狀態(tài)，將分析系統(tǒng)的每個(gè)通道調(diào)零,以排除肌環(huán)重量。加入 40mmol/L的KC1，肌環(huán)出現(xiàn)收縮，待其到達(dá)最大收縮，并達(dá)到平臺(tái)期時(shí)，順次 加入濃度為lxl(T1。， 3xl(T1。， lxl(T, 3xl(T， 1x10—8, 3xl(T8， lxl(T， 3xl(T7， lxl0一6, 3xl(T6, lxl(T5, 3xlO—5mol/L的異丙腎上腺素(ISO) 0. lmL,實(shí)驗(yàn)過程中釆用衡 壓灌流方式保持灌流槽內(nèi)的液體成分不變。每加一藥物濃度后約3~5min出現(xiàn) 平臺(tái)期，此時(shí)標(biāo)記并迅速加下一濃度藥物。
具體測定結(jié)果見圖5、圖6、圖7、圖8。
由圖5、圖6顯示試驗(yàn)結(jié)果可知，6周齡組大嚴(yán)在40mmol/L KC1溶液2mL 刺激后會(huì)出現(xiàn)一個(gè)高餘的逼尿肌收縮波，在此基礎(chǔ)上，以不同濃度的異丙腎上腺
素(lx10—1Q~lxlO—5)誘導(dǎo)逼尿肌發(fā)生舒張反應(yīng)，測定其半數(shù)抑制濃度ICs。(達(dá)到最
大舒張一半時(shí)的藥物濃度)，糖尿病大鼠和正常大鼠的ICs。分別為-7， 37±-0. 0830
和-7.45±-0. 0345 (P<0. 05),比較可知，糖尿病大鼠組比正常大鼠組敏感。測
定兩組大鼠的最大舒張力Emax發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠和正常大鼠的Emax分別為
1. 1472±0. 0069g/mg和0. 6879±0. 101g/mg，對(duì)照組最大舒張力Emax比糖尿病組
小，且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 01)。
由圖7、圖8顯示試驗(yàn)結(jié)果可知，12周齡組大鼠在40mmol/L KC1溶液2mL
刺激下也出現(xiàn)了明顯的逼尿肌收縮波，通過不同濃度的異丙腎上腺素(lx10—"~
"10，誘導(dǎo)逼尿肌發(fā)生舒張反應(yīng)后，收縮波隨著藥物濃度的增高出現(xiàn)不斷下降。
此時(shí)糖尿病大鼠組和正常大鼠組的ICs。分別為-7. 08±-0. 0287和-7. 65±-0. 0102
(P<0. 01)，糖尿病大鼠組比正常大鼠組敏感。糖尿病大鼠組和正常大鼠組的最
大舒張力Emax分別為0. 7472±0. 0104g/mg和0. 837±0. 0034g/mg,對(duì)照組最大舒
張力Emax比糖尿病組大(P<0. 05)。
表3兩組大鼠逼尿肌在不同時(shí)間段最大舒張力Emax的比較(X士s,g/mg)
組別 動(dòng)物數(shù) 6周組_12周組
對(duì)照組 7 0.6879±0.101 0.837±0.0034**
糖尿病組_7 1.1472±0.0069 0.7472士0.0104***
注與6周組比較，**P<0.01, ***P< 0.001
表4兩組大鼠不同時(shí)間段半數(shù)抑制濃度的比較loglC50 (X±S)
組別 動(dòng)物數(shù) 6周組_12周組
對(duì)照組7 -7.45±-0.0345 -7.65±-0.0102**
糖尿病組 7 -7.37士-0.0830 -7.08±-0.0287**
注:'與6周組比較，**P<0.01
對(duì)比例1
同時(shí)進(jìn)行逼尿肌肌條機(jī)械性牽張?jiān)囼?yàn)作為對(duì)比，實(shí)驗(yàn)記錄圖(部分)見圖9~ 圖13。
在逼尿肌肌條機(jī)械性牽張?jiān)囼?yàn)中，張力閾值波動(dòng)幅度較大，在0 1.22g之 間。收縮波的頻率介于l 7次/min。按lmg逼尿肌組織產(chǎn)生的張力變化值做標(biāo)
準(zhǔn)化后得到張力的相對(duì)變化值見表5，與表l數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其最大收縮力
的值偏小。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了膀胱體部的環(huán)形收縮力要大于縱向收縮力，且占
主導(dǎo)地位。由于逼尿肌肌條試驗(yàn)采用的是縱向切取組織，因此在反映逼尿肌收
縮力方面也存在著一定的缺陷。
表5兩組大鼠不同時(shí)段逼尿肌最大收縮力的比較(X±s，g/mg)
組別6周C12周(n-8)
糖尿病組0.89 ± 0.260.71 ± 0.25
正常對(duì)照組0.91 ± 0.250.82 ± 0.28
由于直接測定逼尿肌收縮力即發(fā)現(xiàn)差異，因此本試驗(yàn)未進(jìn)一步進(jìn)行加入藥 物后的測定。
權(quán)利要求
1、一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膀胱功能測定方法，其特征是采用膀胱體部沿膀胱橫斷面切取的環(huán)形肌環(huán)進(jìn)行膀胱功能測定試驗(yàn)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膀胱功能測定方法，其特征是包括以下a. 配置Krebs營養(yǎng)液以下列成分和濃度配制Krebs營養(yǎng)液NaCl 118鵬ol/L， KC1 4. 75腿ol/L， MgS04 1. 18mmol/L, KH2P041. 18mmol/L, NaHC03 24. 8mmol/L，葡萄糖10. Ommol/L, CaCl2 2. 5mmol/L,并調(diào)節(jié)pH=7. 35;b. 制備逼尿肌肌環(huán)以25%烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，剪開下腹部取出膀胱，放入4。Ckerbs 營養(yǎng)液中備用。在膀胱體部沿膀胱橫斷面切取環(huán)形肌環(huán)，剔除膀胱粘膜；c. 肌環(huán)機(jī)械性收縮實(shí)驗(yàn)恒溫器官槽內(nèi)加入10mLkrebs營養(yǎng)液，通入由95%02和5% )2組成的混合氣 體，調(diào)定溫度至37°C,啟動(dòng)powerlab系統(tǒng)，將肌環(huán)一端固定于恒溫器官槽底部， 另一端與拉力傳感器感應(yīng)頭相連，并將肌環(huán)全部浸沒于krebs營養(yǎng)液中；保持肌環(huán)處于無張力的狀態(tài)，將分析系統(tǒng)的每個(gè)通道調(diào)零，以排除肌環(huán)重逐漸緩慢牽拉肌環(huán)使張力增加，直至出現(xiàn)每分鐘1次~7次的自發(fā)收縮，此 時(shí)的肌環(huán)張力作為自發(fā)收縮的張力閾值；使肌環(huán)初始張力保持在0 0. 5g之間，再次靜置15 30min，待其基線平穩(wěn) 并出現(xiàn)穩(wěn)定收縮后，連續(xù)記錄肌條張力變化45min,記錄單位時(shí)間內(nèi)期相性收縮 峰數(shù)目，為自發(fā)性收縮頻率；連續(xù)計(jì)算10個(gè)收縮峰的收縮幅度，取平均值，為平均收縮力；在該時(shí)間段紀(jì)錄最大收縮幅度，為最大收縮力；順次加入濃度分別為1 x 10—1。、 3 x l(T1。、 1 x io-9、 3 x 10—9、 1 x l(T8、 3 x 10—8、 lxl(T、 3xl(T7、 lxl0—6、 3 x 10—6、 lxio-5、 3xlO—5mol/L的M受體激動(dòng)劑Carbachol 0. lmL，采用衡壓灌流方式保持灌流槽內(nèi)的液體成分不變，每加一藥 物濃度后約3~5min出現(xiàn)平臺(tái)期，此時(shí)標(biāo)記并迅速加下一濃度藥物； d.肌環(huán)機(jī)械性舒張實(shí)驗(yàn)恒溫器官槽內(nèi)加入10mLkrebs營養(yǎng)液，通入由95%02和5%0)2組成的混合氣 體，調(diào)定溫度至37X:,啟動(dòng)powerlab系統(tǒng)，將肌環(huán)一端固定于恒溫器官槽底部， 另一端與拉力傳感器感應(yīng)頭相連，并將肌環(huán)全部浸沒于ki:ebs營養(yǎng)液中；保持肌環(huán)處于無張力的狀態(tài)，將分析系統(tǒng)的每個(gè)通道調(diào)零，以排除肌環(huán)重量；加入40mmol/L的KC1,肌環(huán)出現(xiàn)收縮，待其到達(dá)最大收縮，并達(dá)到平臺(tái)期 時(shí)，順次加入濃度分別為lxl(T, 3xl0—1。， 1x10—9, 3x10—， lxl(T8, 3xl0-8， lxl(T7， 3xl(T, lxl(T6， 3xl(T6, lxl(T5， 3xl(T5mol/L的異丙腎上腺素0. lmL,實(shí)驗(yàn)過程中采用衡壓灌流方式保持灌流槽內(nèi)的液體成分不變；每加一藥物濃度后約3~5min出現(xiàn)平臺(tái)期，此時(shí)標(biāo)記并迅速加下一濃度藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膀胱功能的測定方法，是采用膀胱體部沿膀胱橫斷面切取的環(huán)形肌環(huán)進(jìn)行膀胱功能測定試驗(yàn)。本方法既綜合了在體和離體膀胱測壓試驗(yàn)以及逼尿肌肌條試驗(yàn)的特點(diǎn)，又考慮到膀胱的收縮是以膀胱體部環(huán)形收縮為主的因素，可以用于測定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膀胱逼尿肌的興奮性、自律性、收縮能力以及順應(yīng)性，以更客觀有效地評(píng)價(jià)離體膀胱的收縮功能，全面客觀地評(píng)估逼尿肌功能的變化。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101183101SQ20071013935
公開日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月5日
發(fā)明者雙衛(wèi)兵, 利 張, 王東文, 胡操陽, 韓賓林, 高宏飛 申請(qǐng)人:山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院