專利名稱：莪術(shù)油的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及莪術(shù)油及其制劑的分析方法，具體的涉及莪術(shù)油及其制劑的HPLC分析方法。
技術(shù)背景莪術(shù)油及其注射液為中國藥典收載品種，是一種經(jīng)臨床證明療效確切的抗病毒、抗癌藥。 莪術(shù)油的分離分析方法一直是采用氣相色譜法(GC)或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)，但 由于莪術(shù)油的有效組分為多種倍半萜類化合物，而GC或GC-MS進樣室和色譜柱的溫度高， 使得某些倍半萜類化合物在高熱條件下發(fā)生轉(zhuǎn)化，影響了莪術(shù)油的臨床療效和其制劑穩(wěn)定性。 例如溫莪術(shù)油抗癌主成分-呋喃二烯(Furanodiene，又名蓬莪術(shù)環(huán)二烯，分子式C15H20O) 在10(TC或10(TC以上加熱過程中易發(fā)生周環(huán)化發(fā)應(yīng)，生成莪術(shù)烯(6-甲二叉甲基-4， 5， 6， 7-四氫-3， 6-二甲基-5異丙烯基-反式-苯并呋喃)。莪術(shù)烯經(jīng)家兔肌肉剌激性實驗證實會產(chǎn)生明 顯刺激性作用。藥典收載的莪術(shù)油注射液和莪術(shù)油葡萄糖注射液含量測定均是采用香草醛硫酸顯色，于 520nm波長處測定吸光度值檢測莪術(shù)醇含量的可見分光光度法。由于香草醛硫酸顯色劑是通 用型顯色劑，專屬性差，經(jīng)試驗證明不含有莪術(shù)醇的莪術(shù)油注射液采用此方法測定會呈假陽 性反應(yīng)，且含量往往高于68%，說明該方法不適合作為莪術(shù)油注射液的含量測定方法。因此 找到一種適合作為莪術(shù)油及其注射液含量的測定方法是藥學(xué)人員長期以來都想解決的難題。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了莪術(shù)油的HPLC分析方法。本發(fā)明提供的方法中固定相為C2、 C4、 C8、 Cn)或d8的反相柱，流動相為有機溶劑和水的混合物，洗脫方式分為等度洗脫和梯度洗脫，等度洗脫流動相為乙腈水=60: 40 90: IO或甲醇水=70: 30 98: 2;梯度洗脫方式的流動相中乙腈的起始濃度為100 80%，最 終濃度為80 60%。本發(fā)明方法中的梯度洗脫方式中，有機溶劑的濃度是連續(xù)性遞減或者間歇性遞減。本發(fā)明提供的方法可應(yīng)用于各種制備工藝(超臨界C02流體萃取、水蒸氣蒸餾、有機溶劑提取等)提取的莪術(shù)油成分分離分析測定，可應(yīng)用于由莪術(shù)油制備的各種制劑中莪術(shù)油成分分離分析測定，也可應(yīng)用于莪術(shù)油制備過程中的監(jiān)測和莪術(shù)油制劑的中間樣品的監(jiān)測；還 可應(yīng)用于莪術(shù)油中有關(guān)物質(zhì)的檢查及進行莪術(shù)油和制劑的指紋圖譜研究。本發(fā)明提供的高效液相色譜法(HPLC)作為莪術(shù)油及其制劑的檢測方法，由HPLC法代 替氣相色譜法(GC)或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)分離分析莪術(shù)油的倍半萜類成分， 避免了 GC或GC-MS進樣室和色譜柱的高溫對莪術(shù)油及其制劑中有效成分的破壞，并且代替 可見分光光度法分離分析莪術(shù)油制劑中的多種倍半萜類化合物。該方法能真實的反應(yīng)莪術(shù)油 及其制劑的成分，且可以同時分離分析多種倍半萜類化合物，可以為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。本發(fā)明的有益效果在于將莪術(shù)油的有效組分多種倍半萜類化合物同時進行分離分析， 各成分間的分離度提高，分析莪術(shù)油及其制劑的準(zhǔn)確性提高。以下以具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但并不限于此。
具體實施例方式實施例1:選用反相HPLC法定性定量分析6種倍半萜類化合物對照品，儀器美國Agilent 1100高效液相色譜配備DE23922775型四元泵；DE2392205 series自動進樣系統(tǒng)；JP24020624型紫外檢測器；JP13208646型在線脫氣機；Agilent Rev.A.09.03[1417]化學(xué)工作站。色譜條件Discovery C18 HPLC色譜柱25cmx4.6mmx5um;流動相甲醇-水(90:10); 檢測波長215nrn;柱溫室溫；流速lml/min;進樣量20nl。對照品吉馬酮(維牛兒酮)由黑龍江省藥品檢驗所提供；莪術(shù)醇由中國藥品生物制品檢定所提供；(3-欖香烯由大連醫(yī)藥科學(xué)研究所提供；莪術(shù)二酮、呋喃二烯、莪術(shù)烯自提，純度均大于98% (孫秀燕；鄭艷萍等，溫莪術(shù)環(huán)狀 含氧倍半萜類化學(xué)成分的研究，分析測試學(xué)報，2006年，第25巻，第6期，第27-30頁) 結(jié)果顯示6個倍半萜類化合物對照品在上述色譜條件下所得色譜圖中的色譜峰從左到右分 別為莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、莪術(shù)烯、呋喃二烯和p-欖香烯(見附圖l)，且6個成分可 達到完全分離，分離度均大于1.5。實施例2:選用反相HPLC法定性定量分析超臨界C02流體萃取法制備的莪術(shù)油儀器同實例h
色譜條件Discovery CisHPLC色譜柱25cmx4.6mmx5um;流動相甲醇-水(90:10); 檢測波長215nm;柱溫室溫；流速lml/min;進樣量20pl。供試品超臨界C02流體萃取工藝制備(莪術(shù)藥材購自瑞安市陶山鎮(zhèn)沙洲村溫莪術(shù)專業(yè)合作社，由沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院包文芳教授鑒定為溫郁金O^ww" hw^w力'"Y. H. Chen et C. Ling 的干燥根莖。提取工藝萃取壓力18 Mpa，萃取溫度為55°C;分離釜I壓力12Mpa，溫度 為55。C，分離釜II壓力為7Mpa，溫度為45'C; (302流量為100 kg/h，萃取時間2h)的溫莪 術(shù)油，用甲醇溶解，制成濃度為11.2pg/ml的溶液。檢測結(jié)果顯示該莪術(shù)油中含有呋喃二烯為31.3%，吉馬酮(櫳牛兒酮)為15.5%，莪術(shù)二 酮為11.7% (見附圖2)。實施例3:選用反相HPLC法定性定量分析水蒸氣蒸餾法制備的莪術(shù)油-1 儀器同實例l;色譜條件Discovery d8HPLC色譜柱25cmx4.6mmx5um;流動相甲醇-水(90:10); 檢測波長215nm;柱溫室溫；流速lml/min;進樣量20pl。供試品水蒸氣蒸餾得到的莪術(shù)油-1 (莪術(shù)藥材來源同實例2，依據(jù)《中國藥典》2005版1 部莪術(shù)油項下提取工藝制得)，用甲醇溶解，制成濃度為35.6嗎/ml的溶液。檢測結(jié)果顯示 該莪術(shù)油中含有呋喃二烯為18.6%，莪術(shù)烯為15.3%，吉馬酮為10.4%，莪術(shù)二酮含量為6.7 % (見附圖3)。實施例4:選用反相HPLC法定性定量分析有機溶劑提取的莪術(shù)油 儀器同實例l;色譜條件DiscoverydsHPLC色譜柱25cmx4.6mmx5um;流動相甲醇-水(95:5); 檢測波長215nm;柱溫室溫；流速lml/min;進樣量20^1。供試品有機溶劑乙酸乙酯提取(莪術(shù)藥材來源同實例2，采用乙酸乙酯20ml浸泡2g溫莪 術(shù)藥材粉末(過24目篩)24h，室溫下?lián)]干溶劑)得到的莪術(shù)油，用甲醇溶解，制成濃度為 120.6昭/ml的溶液。檢測結(jié)果顯示該莪術(shù)油中含有呋喃二烯為35.8%,吉馬酮為12.5%,莪術(shù)二酮含量為7.6 % (見附圖4)。實施例5:選用反相HPLC法定性定量分析呋喃二烯和莪術(shù)烯
儀器同實例1;色譜條件Discovery Ci8 HPLC色譜柱25cmx4.6mmx5um;流動相乙腈-水(75: 25); 檢測波長215nm;柱溫35°C;流速lml/min;進樣量20nl。對照品呋喃二烯、莪術(shù)烯(來源如檢測方法l所述)。結(jié)果顯示在上述色譜條件下，呋喃二烯和莪術(shù)烯的分離度均大于1.5。該方法可用于 定性和定量分析溫莪術(shù)油中的呋喃二烯和莪術(shù)烯，并可作為莪術(shù)油中的相關(guān)物質(zhì)-莪術(shù)烯的檢 測方法。色譜圖見附圖5。實施例6:選用反相HPLC法定性定量分析水蒸氣蒸餾法制備的莪術(shù)油-2儀器同實例l;色譜條件Discovery Cg硅膠柱25cmx4.6mmx5um;流動相乙腈-水的體積比=92: 8，乙 腈的比例是連續(xù)性遞減，洗脫10分鐘后，流動相中乙腈-水的體積比-70:30;檢測波長:215nm;柱溫室溫；流速lml/min;進樣量20nl。供試品水蒸氣蒸餾得到的莪術(shù)油-2 (莪術(shù)藥材來源同實例2，自提，依據(jù)《中國藥典》2005 版l部莪術(shù)油項下提取工藝制得)，用甲醇溶解，制成濃度為152.8ng/ml的溶液。 檢測結(jié)果顯示梯度洗脫分析莪術(shù)油中極性大的多個組分的分離效果明顯優(yōu)于等度洗脫，說 明在分離分析結(jié)構(gòu)性質(zhì)相近的多個組分中更適合采用梯度洗脫方式。色譜圖見附圖6。


圖1是6個倍半萜類化合物對照品的HPLC色譜圖。圖2是超臨界C02流體萃取法制備的莪術(shù)油的HPLC色譜圖。圖3是水蒸氣蒸餾法制備的莪術(shù)油-1的HPLC色譜圖。圖4是有機溶劑(乙酸乙酯)提取得到的莪術(shù)油的HPLC色譜圖。圖5是呋喃二烯和莪術(shù)烯的HPLC色譜圖。圖6是水蒸氣蒸餾法制備的莪術(shù)油-2的HPLC色譜圖。
權(quán)利要求
1、 一種莪術(shù)油及其制劑的HPLC分析方法，在該方法中固定相為C2、 C4、 C8、 do或 Cw的反相柱，流動相為有機溶劑和水的混合物，洗脫方式分為等度洗脫和梯度洗脫， 等度洗脫流動相為乙腈水=60: 40 90: 10或甲醇水=70: 30 98: 2，梯度洗 脫方式中流動相中乙腈的起始濃度為100 80%，最終濃度為80 60%。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在該梯度洗脫的方式中，有機溶劑的濃度是連續(xù)性遞減或者間歇性遞減。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于等度洗脫流動相為乙腈水=70: 30 85:15或甲醇水=80: 20 95: 5，梯度洗脫流動相中乙腈的起始濃度為95 85%，最終 濃度為75 65%。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3所述的方法，本發(fā)明提供的方法可應(yīng)用于各種制備工藝(超臨 界C(V流體萃取、水蒸氣蒸餾、有機溶劑提取等)提取的莪術(shù)油成分分離分析測定。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，該方法可應(yīng)用于由莪術(shù)油制備的各種制劑中的成分分離 分析測定，也可應(yīng)用于莪術(shù)油制備過程中的監(jiān)測和莪術(shù)油制劑的中間樣品的監(jiān)測；還 可應(yīng)用于莪術(shù)油中有關(guān)物質(zhì)的檢査及進行莪術(shù)油和制劑的指紋圖譜研究。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種莪術(shù)油及其制劑的HPLC分析方法。本發(fā)明的HPLC分析方法應(yīng)用于各種制備工藝(超臨界CO₂流體萃取、水蒸氣蒸餾、有機溶劑提取等)提取的莪術(shù)油成分分離分析測定，應(yīng)用于由莪術(shù)油制備的各種制劑中莪術(shù)油成分分離分析測定，應(yīng)用于莪術(shù)油制備過程中的監(jiān)測和莪術(shù)油制劑的中間樣品的監(jiān)測；應(yīng)用于莪術(shù)油中有關(guān)物質(zhì)的檢查及進行莪術(shù)油和制劑指紋圖譜的研究。本發(fā)明的HPLC分析方法簡便快速，靈敏度高，重復(fù)性好，并且能準(zhǔn)確、真實的反映莪術(shù)油的主要成分。
文檔編號G01N30/89GK101144802SQ20071014150
公開日2008年3月19日 申請日期2007年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月1日
發(fā)明者孫秀燕 申請人:煙臺大學(xué)