專利名稱：色譜快速試驗的測定范圍擴大的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及樣品分析定量測定的方法和器具。
技術背景分析物例如藥品、妊娠激素、傳染性疾病或CARDIAC標記物的快 速測定用普遍分析方法利用免疫學試紙。在這一方面，廣泛使用純粹目 牙見法讀數的定性試驗(例如CARDIAC D-dimer、 Trop T sensitive等)以 及借助于讀數器具評估的定量試驗(例如Elecsys proBNP， Roche CARDIAC proBNP等)。這樣的定量免疫學試紙的特征尤其在于其操作簡便。該試紙通?；?于如下事實該試紙含有一種試劑，能通過與該樣品中的分析物反應而 導致一種可檢測信號。該可檢測信號通常在一段規(guī)定時間之后通過反射 度測量來測定。在該分析物與試劑接觸與信號測定之間的這段時間要選 擇得盡可能長。這確保了該試劑與分析物之間的長反應時間，從而確保 此類試紙的最高可能靈敏度。然而，由于反應動力學的原因，在這樣一 個長反應期之后，再也不可能定量測定樣品中以高濃度存在的分析物。因此，這樣的試紙，與慣常實驗室分析系統(tǒng)例如Elecsys (Roche Diagnostics 乂>司)、IM ( Abbott ,>司)、Dimension ( Dade Behring 司)相比，其性能仍有頗大弱點。尤其測量精度和動態(tài)測量范圍，諸如 與溶液中的反應相比，試紙受到頗大損害。當測定需要高靈敏度以及盡 可能大測量范圍時，這限制了其用途。尤其對于患者的緊急護理來說， 若能提供一種一方面因其高靈敏度而能將某些疾病可靠地排除、另一方 面也會提供大測量范圍的試驗或方法，對主治醫(yī)生會是非常有幫助的。 分析物的大測量范圍是風險分級和治療監(jiān)測特別希望的。試驗的測量范 圍擴大，對于那些該病情特有的分析物或標記物的濃度與病情的嚴重性 相關的病情會是特別希望的。在這樣的情況下，標記物濃度提高(例如 NT-proBNP)會指出患者風險狀況增大。發(fā)明內容因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種使樣品中分析物定量測量范圍 擴大的方法。這個目的是通過樣品中分析物的定量測定達到的，該定量測定包含(a) 提供一種當與該分析物接觸時能發(fā)生一種會產生可檢測信號 的反應的分析物特異性物質，(b) 提供至少2幅校正圖，這些圖是通過使每種情況下相同的分 析物特異性物質與不同數量的、每種情況下相同的試驗分析物反應每種 情況下預定的反應時間產生的，(c) 使該分析物特異性物質與一種含有要檢測的分析物的樣品接觸，(d) 在第一預定反應時間測量該信號，為此提供按照(b)的第一 校正圖，(e) 核對按照(d)測量的信號是否能以所希望的精度定量測定該 分析物，(f) (i)若達到所希望的精度，就根據按照(d)測定的信號定量 測定該分析物，或(ii)在第二預定反應時間測量該信號，為此提供按照(b) 的第二校正圖，(g) 核對按照(f) (ii)測量的信號是否能以所希望的精度定量測定該分析物，和(h) (i)若達到所希望的精度，就根據按照(f) (ii)測量的信號定量測定該分析物，或(ii)在至少一個進一步預定反應時間繼續(xù)該測定(對應于 (f) (ii) 、 (g) 、 (h) (i))， 即任選地(i) 在第三預定反應時間測量該信號，為此提供按照(b)的第三 校正圖，(j)核對按照(i)測量的信號是否能以所希望的精度定量測定該 分析物，和(k) (i)若達到所希望的精度，就根椐按照(i)測量的信號定量 測定該分4斤物，或(ii)在至少一個進一步預定反應時間繼續(xù)該測定。 該方法的步驟(f) (ii)、 (g)和(h) (i)可以像所希望的那樣 經常重復。在一種較好的實施方案中，這些步驟重復2次或3次，即產
生或提供2個或3個預定反應時間的2幅或3幅校正圖。本發(fā)明的另 一 方面涉及樣品中分析物的定量測定方法，包含(a) 提供一種當與該分析物接觸時能發(fā)生一種會產生可檢測信號 的反應的分析物特異性物質，(b) 提供至少2幅校正圖，這些圖是通過使每種情況下相同的分 析物特異性物質與不同數量的、每種情況下相同的試驗分析物反應每種 情況下預定的反應時間產生的，(c) 使該分析物特異性物質與一種含有要檢測的分析物的樣品接觸，(d) 在第一預定反應時間測量第一信號，為此提供了按照(b)的 第一校正圖，(e) 在第二預定反應時間測量第二信號，為此提供了按照(b)的 第二校正圖，(f) 任選地測量一個進一步的信號，(g) 核對按照(d) 、 (e)或(f)測量的信號中哪一個能達到該 分析物定量測定的足夠精度，和(h )根據能達到足夠精度的信號定量測定該分析物。


圖1:6 min、 8 min和12 min后CARDIAC-proBNP的反射度動力學。反 射度[%]對由Elecsys-proBNP參考試驗測定的proBNP濃度[pg/ml]作圖。 圖2:使用CARDIAC-proBNP試紙的按照本發(fā)明方法與Elecsys-proBNP試-瞼之間的方法比4交。
具體實施方式
為了核對第一測量信號或第二測量信號能否以更大精度定量測定 該分析物，在一種較好實施方案中根據所提供的至少2幅校正圖界定了 實驗濃度極限。超過這一極限的分析物濃度是按照2個反應時間中較短 的那一個評估的，而落到這一極限以下的分析物濃度是按照2個反應時 間中較長的那一個確定的。如果發(fā)現該分析物濃度超過該短反應時間之 后的極限，即確定高分析物濃度，則該方法可以在此時停止。令人驚訝地發(fā)現，按照本發(fā)明的方法，與先有技術的已知方法相
比，能使測量范圍的上限增大3倍以上。因此，按照本發(fā)明的方法提高 了主治醫(yī)生的診斷能力。按照本發(fā)明的試驗的延展的測量范圍也使得能省去額外的、往往費 力的試驗(例如侵入式診斷方法等)。如同以下詳細描迷的，按照本發(fā)明的方法能比先有技術上已經描述 的方法或試驗更快地測定濃度，對樣品中的高分析物濃度尤其如此。例 如，由于NT-proBNP的血液水平與心臟機能障礙的程度相關，因而按照 本發(fā)明的方法使得能更迅速地評價處于緊急狀況的患者的心臟特有狀 態(tài)。這產生了如下優(yōu)點當急性心臟事件例如急性心肌梗塞發(fā)生時，患 者可以比用當前診斷程序的病例在更早的時間得到確認和充分治療。按 照本發(fā)明的方法和尤其在急性心臟事件的病例中做出更快診斷的能 力，使主治醫(yī)生能更快地啟動適當對策，從而可以減少其它心臟并發(fā)癥 和死亡率。在本發(fā)明的較好實施方案中，使用較好從體液衍生的液體樣品。特 別好地使用血液、血漿、血清、唾液或尿樣品。要定量測定的分析物較好選自核酸、脂類、碳水化合物、蛋白質， 尤其選自DNA、 RNA、抗體、抗原、代謝產物、激素、病毒、微生物、 細胞、心臟特異性標記物、神經激素標記物、局部缺血標記物和肌肉特 異性標記物。脂類的較好實例包括膽固醇、HDL膽固醇和甘油三酯。 一種特別好 的碳水化合物分析物是葡萄糖。要測定的酶的實例包括堿性磷酸酯酶和 淀粉酶。尿酸、膽紅素和尿后膽色素原是代謝產物的較好實例。神經激素標記物的實例包括心房(A型)鈉尿肽(ANP) 、 B型鈉 尿肽(BNP )、或各前肽的N-末端片斷NT-ProANP和NT-ProBNP。局部缺血標記物的實例包括局部缺血改性清蛋白(IMA)、脂肪酸結合蛋白、游離脂肪酸、妊娠關聯(lián)的血漿蛋白A、糖原磷酰酶同工酶BB和鞘氨醇-"磷酸酯。肌紅蛋白和肌酸激酶MB (CK-MB)是月/L肉特異性標記物的較好實例。CD40是血小板活化標記物的較好實例。較好的心臟特異性局部缺血-壞死標記物是肌鈣蛋白T或肌鈣蛋白I。
在一種特別好的實施方案中，測定了至少一種CARDIAC標記物或 心臟特異性標記物，這較好又選自肌鉤蛋白T、肌紅蛋白、D-二聚體和 NT-proBNP。該分析物特異性物質較好選自可以結合到該分析物上的受體、抗 體、抗原、植物凝血素、核酸、和核酸類似物。該分析物特異性物質較 好還偶合到一種檢測試劑上或偶合到一種當它結合到該分析物上時能 產生一種可檢測信號的酶上。在一種較好的實施方案中，該分析物對該 分析物特異性物質的結合，借助于反應直接導致一種可檢測信號。在一 種進一步實施方案中，在該分析物結合到該分析物特異性物質上之后可 以添加一種底質，所述底質要么由該分析物要么由該分析物特異性物質 轉化，同時發(fā)出一種可檢測信號。較好的檢測系統(tǒng)是諸如膠體金屬微粒 尤其金、熒光納米微粒例如膠乳、up-cotwerting磷、量子dots或超順磁 微粒。較好按照本發(fā)明測定的分析物BNP或NT-proBNP的檢測描述于， 例》0 ，Struthers (Eur. Heart J. 20 (1999), 1374-1375)， Hunt et al.， Clin. Endocrinol. 47 (1997， 287-296), Talwar et al, (Eur. Heart J. 20 (1999)， 1736-1744)以及EP-0 648 228和WO 00/45176 。在一種較好的實施方案中，該分析物與分析物特異性物質之間的反 應是一種免疫學反應。在本發(fā)明的意義上， 一幅"校正圖"要理解為一種函數，該函數是 通過將所定義的試驗分析物數量分配給描述該可檢測信號的所定參數 而衍生的。在這種方法中，將所定義的試驗分析物數量分配給一種描述 此方法中所定義的信號的參數。從多個較好獨立測定衍生的平均值也可 以用來產生校正圖。描述該可檢測信號的參數較好是描述作為該分析物與該分析物特 異性物質反應的結果的任何波長的光的吸收或發(fā)射的參數。描述該信號 的參數的較好實例是反射度、發(fā)射值和吸收值。進而，也可以諸如使用 磁性微粒，因而也可以考慮磁場(磁場狀態(tài))作為描述該信號的參數。析物特異性物質與不同數量的、在每種情況下相同的分析物反應在每種 情況下預定的反應時間測量的。為此，讓各數量的、在每種情況下相同 的反應時間之后測量該可檢測信號。這意味著以在每種情況下都不同數l校正圖。5為產生一幅校正圖，要為每個預;定反應;間試i分析物數量向信號描述性參數的分配的相應數目進行5~50個不同數量的試驗分析 物即不同的個體反應、較好10~40個個體反應、最好10~25個個體反應。在產生該校正圖之前，實驗測定值也可以遭遇一個動力學評估過 程，在這種情況下由該評估過程確定的值可以用來產生該校正圖。該試驗分析物和要定量檢測的分析物較好相同。在按照本發(fā)明的方法中，所產生的校正圖用來作為核對從該分析物 特異性物質與樣品中的分析物的反應所產生的測量信號是否足以以所 希望的精度定量測定該分析物的依據。該精度可以用特定領域中已知 的、考慮到信號幅度或準確性的任何評估程序核對。在本發(fā)明的較好實施方案中，將該分析物與分析物特異性物質之間 的預定反應時間之后測定的信號與為相應預定反應時間提供的校正圖 加以比較。當所觀察的校正圖有所有預定校正曲線中相應數量試驗分析 物的最大斜率時，達到要測定的分析物數量的所希望精度。用于確定校正圖的至少2個預定反應時間是這樣選擇的使得能檢 測樣品中分析物的較高濃度，而且也達到所需要的試驗靈敏度。為了達 到所需要的試驗靈敏度，有盡可能長的反應時間是必要的。用較短的反 應時間，在分析物特異性物質與分析物之間就生成較少的絡合物、較好 免疫絡合物。從而檢測到相應較低的信號強度。反之，在低分析物濃度 的情況下，生成太少的絡合物、較好免疫絡合物，而且該試驗的靈敏度 也喪失。然而，在高濃度的情況下，實質上可得到更多的絡合物，因而 即使用短的反應時間也能檢測到清晰的信號和高信號強度。通過將確保 所需靈敏度的長反應時間與用來檢測較高濃度的短反應時間組合，可觀 地增大了分析物與分析物特異性物質之間的反應的定量測量范圍。由于這個理由，選擇關于分析物與分析物特異性物質的反應的長反 應時間作為其后該分析物與分析物特異性物質之間的反應處于飽和范 圍或處于靜止狀態(tài)的預定反應時間。較好選擇進一步的預定反應時間是 相應較短的，使得在這些預定的短反應時間上該分析物特異性物質與分 析物之間的反應不在飽和范圍內或不處于靜止狀態(tài)。較好選擇一個對應
于長反應時間的大約 一 半的時間作為至少 一 個短反應時間。該分析物特異性物質較好在任何一種載體上、較好試紙或快速試紙 (也簡稱為試劑栽體或器具)上提供。進而， 一種(或多種)分析物當 然也能用液體試驗測定。然而，較好的是在試驗器具(試驗載體、首先 試紙)上的測定，在該器具上用來測定該分析物的分析物特異性物質或 試劑位于一個或多個區(qū)域中呈干的一且在與樣品接觸后可溶的一形 式，其中可檢測信號是在一個檢測區(qū)、較好在該檢測區(qū)的一個獨立區(qū)域 中檢測的。所有商業(yè)上可得的、尤其適合于在預定的固定時間值之后定 量測定分析物的試紙均可用于按照本發(fā)明的方法。按照本發(fā)明的方法可以使所使用的試紙的測量范圍的極限擴大2~5 倍、較好3倍以上。按照本發(fā)明的另 一個方面，在同 一栽體上除要定量測定的分析物外 還能定性和/或定量測定進一步的分析物。在該栽體上，相應地存在多種 分析物特異性物質。在這種情況下，還可以適當使用與分析物特異性物 質偶合的檢測試劑，這使得能借助于一種單一試驗格式例如酶促試驗、 電化學發(fā)光試驗、熒光或吸收試驗、或比濁法試驗來定量或定性測定所 有分析物。當然，在一種單一試紙上可以存在用于不同分析物特異性物 質的不同4全測試劑。在一種特別好的實施方案中，使用的是Roche-CARDIAC-proBNP 試紙。因此，按照本發(fā)明的方法可以使處于60 3000 pg/ml范圍內的 Roche-CARDIAC-proBNP試紙的測量范圍擴大到60-10000 pg/ml的范 圍。因此，本發(fā)明的一種較好實施方案涉及一種分析物濃度的定量測 定，其中該分析物又較好選自肌鈣蛋白T、肌紅蛋白、D-二聚體和NT-proBNP。在NT-proBNP的情況下，測定是例如在3000-10000 pg/ml范 圍內進行的，反應物特異性物質與反應物之間的短反應時間為3~9分 鐘、較好8分鐘。60~3000 pg/ml濃度范圍內的NT-proBNP的測定較好 用10 15分鐘、更好12分鐘的長反應時間進行。分析物與分析物特異性物質之間的反應所產生的可檢測信號較好 用光學方法、尤其用反射光度法或熒光法檢測或電化學發(fā)光法定量測 定。其它較好的定量測定方法包括介電常數變化、電導率變化、磁場變 化、或偏振光旋光角變化等的測量。
在本發(fā)明的一種進一步較好實施方案中，該方法是以自動化形式、 較好以自動化分析儀進行的。本發(fā)明的另 一個方面涉及一種用于實施按照本發(fā)明的方法的器 具。這種器具包含一個用來儲存曾經為一種分析物產生的校正圖的儲存元件。儲存元件的實例包括所有常用數據栽體例如ROM鍵、硬盤、CDs、 軟盤、DVDs、 USB棒等。然后，可以為多種分析物樣品的相繼定量測 定提供所儲存的校正圖。按照本發(fā)明的方法尤其可以用來識別有急性冠狀綜合征的患者，尤 其可以用于改善急性冠狀事件的早期檢測，例如改善急性心肌梗塞的早 期檢測。本發(fā)明進一步用以下實施例i兌明。 實施例使用一種CARDIAC-proBNP試紙產生6、 8和12 min反應時間后的 校正圖。各proBNP數量是用Elecsys-proBNP參考方法(圖1)測定的。 該校正圖顯示斜率隨反應時間減少而減少。結果，在>3000 pg/ml的較 高濃度時信號幅度、因而靈敏度提高。按照本發(fā)明使用的CARDIAC-proBNP試驗與Elecsys-proBNP試驗 (圖2 )之間的方法比較，是通過評估12分鐘后60-2800 pg/ml的濃度 范圍和8分鐘后〉2800 pg/ml的濃度(對應于實驗測定或定義的反射度 值)得到的。用Elecsys-proBNP參考方法的測定的比較顯示，按照本發(fā)明以2個 不同反應時間進行的CARDIAC-proBNP試驗有60 10000 pg/ml的定量 測量范圍。與測量范圍上限為3000pg/ml的12min后慣常評估相比，使 測量范圍的上限提高3倍以上。
權利要求
1. 樣品中分析物的定量測定方法，包含(a )提供一種當與該分析物接觸時能發(fā)生一種會產生可檢測信號 的反應的分析物特異性物質，(b) 提供至少2幅校正圖，這些圖是通過使每種情況下相同的分 析物特異性物質與不同數量的、每種情況下相同的試驗分析物反應每種 情況下預定的反應時間產生的，(c) 使該分析物特異性物質與一種含有要檢測的分析物的樣品接觸，(d) 在第一預定反應時間測量該信號，為此提供按照(b)的第一 校正圖，(e) 核對按照(d)測量的信號是否能以所希望的精度定量測定該 分析物，(f) (i)若達到所希望的精度，就根據按照(d)測定的信號定量 測定it分4斤物，或(ii)在第二預定反應時間測量該信號，為此提供按照(b) 的第二校正圖，(g) 核對按照(f) (ii)測量的信號是否能以所希望的精度定量 測定該分析物，和(h) (i)若達到所希望的精度，就根據按照(f) (ii)測量的信號定量測定該分析物，或(ii)在至少一個進一步預定反應時間繼續(xù)該測定(對應于 (f) (ii) 、 (g) 、 (h) (i))。
2. 樣品中分析物的定量測定方法，包含(a) 提供一種當與該分析物接觸時能發(fā)生一種會產生可檢測信號 的反應的分析物特異性物質，(b) 提供至少2幅校正圖，這些圖是通過使每種情況下相同的分 析物特異性物質與不同數量的、每種情況下相同的試驗分析物反應每種 情況下預定的反應時間產生的，(c) 使該分析物特異性物質與一種含有要檢測的分析物的樣品接觸，(d) 在第一預定反應時間測量第一信號，為此提供了按照(b)的 第一校正圖，(e) 在第二預定反應時間測量第二信號，為此提供了按照(b)的 第二校正圖，(f) 任選地測量一個進一步的信號，(g) 核對按照(d) 、 (e)或(f)測量的信號中哪一個能達到該 分析物定量測定的足夠精度，和(h )根據能達到足夠精度的信號定量測定該分析物。
3. 按照權利要求1或權利要求2的方法，其特征在于該分析物定量 測定的精度是使用校正圖的斜率核對的。
4. 按照權利要求1或3的方法，其特征在于該試驗分析物和要定量 測定的分析物相同。
5. 按照權利要求1 4之一的方法，其特征在于測定2幅或3幅校正圖。
6. 按照權利要求l-5之一的方法，其特征在于使用任何栽體，較好 一種試紙來提供該分析物特異性物質。
7. 按照權利要求1 6之一的方法，其特征在于使要測定的分析物的 測量范圍的極限擴大2 5倍、較好3倍以上。
8. 按照權利要求1 7之一的方法，其特征在于使用從體液，較好血 液、血漿、血清、唾液或尿液樣品衍生的樣品。
9. 按照權利要求l-8之一的方法，其特征在于在與要定量測定的分 析物同時定性和/或定量地測定另外的分析物。
10. 按照權利要求1~9之一的方法，其特征在于該分析物選自核 酸、脂類、碳水化合物、蛋白質尤其DNA、 RNA、抗體、抗原、代謝 產物、激素、病毒、微生物、細胞、心臟特異性標記物、神經激素標記 物、局部缺血標記物和月幾肉特異性標記物。
11. 按照權利要求l-10之一的方法，其特征在于測定至少一種心臟 特異性標記物，該標記物選自肌鈣蛋白T、肌紅蛋白、D-二聚體、和 NT-proBNP。
12. 按照權利要求之一的方法，其特征在于該分析物特異性物 質選自抗體、能與該分析物結合的受體、抗原、外源凝集素、核酸和核 酸類似物，該分析物特異性物質較好能與檢測試劑偶合。
13. 按照權利要求1 12之一的方法，其特征在于分析物與分析物特 異性物質之間的反應較好是一種免疫學反應。
14. 按照權利要求1 13之一的方法，其特征在于該定量測定是用光 學方法、尤其用反射光度法或熒光法檢測或電化學發(fā)光進行的。
15. 按照權利要求1 14之一的方法，其特征在于該方法以自動化方式進4亍。
全文摘要
本發(fā)明涉及樣品中分析物定量測定的方法和器具。
文檔編號G01N33/50GK101144810SQ20071014877
公開日2008年3月19日 申請日期2007年9月11日 優(yōu)先權日2006年9月11日
發(fā)明者A·努弗, J·斯品克, J·沙夫勒, M·蒂勒 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司