專(zhuān)利名稱(chēng)：定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量的試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種定量檢測(cè)食品中恩諾 沙星含量的試劑盒及其檢測(cè)方法。
技術(shù)背景恩諾沙星(Enrofloxacin)又明乙基環(huán)丙沙星，化學(xué)結(jié)構(gòu)為 (C19H22FN303)，分子量為359.1646。恩諾沙星可引起神經(jīng)中毒、腎功 能損傷、過(guò)敏反應(yīng)、幼畜關(guān)節(jié)炎等毒副作用，其在動(dòng)物性食品中的殘 留直接威脅到人類(lèi)身體健康。其殘留除了其毒副作用對(duì)人類(lèi)的直接危 害外，更為嚴(yán)重的是動(dòng)物性食品中殘留較低濃度的藥物容易誘導(dǎo)人類(lèi) 致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而不利于該類(lèi)藥物對(duì)人類(lèi)疾病的治療，因此必 須十分重視恩諾沙星在動(dòng)物性食品中的殘留問(wèn)題。近年來(lái)恩諾沙星及 其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在獸醫(yī)和人醫(yī)臨床上應(yīng)用時(shí)所產(chǎn)生的不良反應(yīng) 和耐藥性報(bào)道越來(lái)越多。由于恩諾沙星的耐藥性和潛在的致癌性，國(guó) 外及我國(guó)均制定了在組織中的最高殘留限量為100Pg/kg。美國(guó)FDA 規(guī)定恩諾沙星禁用于食品動(dòng)物；歐盟(E C )規(guī)定恩諾沙星在牛、豬、 家禽的肝、腎、肌肉中最高殘留限量(MRL)為30ug/kg;世界衛(wèi)生 組織(WHO)推薦的恩諾沙星MRL為40 y g/kg;香港地區(qū)規(guī)定恩諾沙星 MRL為100 u g/kg;我國(guó)規(guī)定恩諾沙星在蛋、奶中的MRL為100 u g/kg。目前對(duì)恩諾沙星的檢測(cè)方法主要包括作為初篩方法的微生物抑 制實(shí)驗(yàn)和免疫方法，薄層色譜(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣質(zhì) 聯(lián)用法(GC/MS)、熒光分光光度法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)。其中，國(guó) 內(nèi)外研究與應(yīng)用較多的是HPLC法，但是這種方法前處理過(guò)程繁瑣， 操作復(fù)雜，而且通常需要專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行操作，儀器設(shè)備昂貴，檢測(cè)過(guò) 程耗時(shí)且費(fèi)用較高，不適于大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。酶聯(lián)免疫測(cè)定 法ELISA由于其特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，操作簡(jiǎn)便，適于大 批量樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到人們的青睞。由于ELISA的技術(shù)條 件要求低、操作簡(jiǎn)便、易商品化、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，是食品中獸藥殘留首選 的快速檢測(cè)方法。本課題擬研究建立恩諾沙星酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，這 對(duì)完善我國(guó)食品檢測(cè)體系，保障食品安全具有重要意義。酶聯(lián)免疫吸附齊U測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,
ELISA)的基本原理是將酶與抗原或抗體用交聯(lián)劑結(jié)合起來(lái)，此種 酶標(biāo)記抗原或抗體與待測(cè)樣品中相應(yīng)抗體或抗原發(fā)生特異反應(yīng)，并牢 固結(jié)合，在加入相應(yīng)的酶的底物時(shí)，底物被酶催化生成呈色產(chǎn)物，可 根據(jù)呈色物的有無(wú)和呈色深淺作定性或定量觀察。由于此技術(shù)是建立 在抗原抗體反應(yīng)和酶的高效催化作用的基礎(chǔ)上，故而該技術(shù)具有檢測(cè) 靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡(jiǎn)單、檢 測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好、檢測(cè)成本低的定量檢測(cè)食品中恩 諾沙星含量的試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量的試劑盒，試劑盒由試劑組 和包被板構(gòu)成，其中(1) .試劑組① .緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH 7.4，使用時(shí)用二次水按1 : 5 稀釋?zhuān)虎?.底物A:為含過(guò)氧化氫脲的醋酸鈉緩沖液；③ .底物B:為含3,3',5，5'-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯TMB的二甲基亞 砜溶液；④ .洗滌液為含2.5%吐溫的磷酸鹽緩沖液；使用時(shí)用二次水按 照l(shuí): 5稀釋?zhuān)虎?,終止液為1. 25mol/L硫酸；⑥ .恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液其恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為100|ig/L，使 用時(shí)用緩沖液稀釋后，再按l: 4稀釋六個(gè)梯度；⑦ .酶標(biāo)記恩諾沙星抗原溶液為恩諾沙星-辣根過(guò)氧化物酶連接物ENF-HRP，使用時(shí)用緩沖液按照l(shuí): 20萬(wàn)倍稀釋?zhuān)?2) .包被板包被板的微孔中包被有多克隆恩諾沙星抗體，并采用Na2C03 —NaHC03的緩沖液將該多克隆恩諾沙星抗體稀釋作為包被液，向 包被板中微孔的每個(gè)孔加入包被液，在室溫放置過(guò)夜或者35 4(TC恒溫溫育2 3小時(shí)，洗滌液洗滌三次除去包被液，加入凍干 液封閉0.8 1.2小時(shí)，洗滌液洗滌四次后，凍干，3 5"C保存。而且，所述的包被板為96孔或48孔微孔板，所述的緩沖液 Na2C03_NaHC03的pH值為9.6。
而且，所述的包被板微孔中的多克隆恩諾沙星抗體是選用雌性大白兔進(jìn)行人工合成抗原ENF-KLH的五次免疫，三次免疫后10天由 兔子的耳緣靜脈采集血液離心獲得抗血清進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，末次免疫后 采用頸動(dòng)脈采血法對(duì)動(dòng)物采全血，經(jīng)離心處理后收集全部血清，采取 免疫親合層析法進(jìn)行抗體純化，所得抗體添加0.1% (W/V)的疊氮 鈉后于4"C儲(chǔ)存?zhèn)溆?。而且，所述的人工合成抗原ENF-KLH為將恩諾沙星，N-羥 基琥珀酰亞胺和N,N-二環(huán)已基碳二亞胺溶于N，N-二甲基甲酰胺 中，鋁膜包裹360。室溫?fù)u動(dòng)4 6小時(shí)，離心除去沉淀，在冰浴 條件下將上層活化酯溶液緩慢加入到溶有KLH的碳酸氫鈉溶液 中，4"C下將反應(yīng)液360°搖勻反應(yīng)過(guò)夜，然后將反應(yīng)液裝入透析 袋，4"C下磷酸鹽緩沖液中透析，然后精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液 的體積，測(cè)定濃度加入疊氮鈉，分裝，-2(TC保存。而且，所述的包被板中的凍干液為含脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液。而且，所述的連接物ENF-HRP為將恩諾沙星、N-羥基琥珀酰亞 胺、N， N' —二環(huán)己基碳二亞胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，鋁膜 包裹360°室溫?fù)u動(dòng)4 6小時(shí)，離心取上清夜；將辣根過(guò)氧化物 酶HRP溶解于碳酸氫鈉溶液中，將恩諾沙星半抗原反應(yīng)液在冰浴 下滴加入HRP溶液中，滴加完全后4。C下將反應(yīng)液360。搖勻反應(yīng) 過(guò)夜，最后將所有反應(yīng)液放入透析袋中用0.01 mol/L的磷酸鹽緩 沖液透析72 h。一種定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量的試劑盒的檢測(cè)方法，其檢測(cè)方法包括以下步驟(1) .在溫度為10 3(TC時(shí)進(jìn)行樣品前處理，得到樣品提取液；(2) .打開(kāi)試劑盒取出包被板，分別將各種濃度的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液 和樣品提取液加入到包被板各自的微孔中，并且雙孔平行加樣，然后 再在各種濃度恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液和樣品提取液各自的微孔中加入酶標(biāo) 抗原溶液，震蕩混勻2 8min，室溫反應(yīng)0.8 1.5小時(shí)；(3) .用洗滌液洗包被板3 4次，將孔內(nèi)液體甩掉，用吸水紙扣干， 加入底物A和底物B的混合液，室溫下反應(yīng)0.4 0.6小時(shí)；(4) .向各微孔中加入終止液，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取吸光度值， 根據(jù)各種濃度恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值繪制恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲
線(xiàn)圖，對(duì)照恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖得到樣品提取液中恩諾沙星的而且，所述的底物A和底物B的混合液的配比為14.6:0.45。 而且，取樣品加入萃取液，振蕩器混勻2min，離心，取部分 上清液用磷酸鹽緩沖液稀釋。而且，所述的萃取液為乙腈O.IM氫氧化鈉按體積比為4: 1的混合溶液。本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)是1. 本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好、 檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，而且適用范圍較廣。主要適用于食品和肉類(lèi)中的 恩諾沙星含量的定量檢測(cè)。其抗體具有良好的廣譜性和靈敏度，所得 抗體和酶標(biāo)抗原穩(wěn)定，具有常溫保藏時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。2. 本發(fā)明提供的快速檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、快速，完成全部檢測(cè)操 作過(guò)程只需幾小時(shí)，而且檢測(cè)的精確度可達(dá)90%以上，檢測(cè)靈敏度 可以達(dá)到Wg/kg級(jí)非常適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。由于抗體和酶標(biāo)抗原， 在常溫下可以保藏1周、酶標(biāo)抗原包備的酶標(biāo)板在4'C下可以保藏6 個(gè)月以上，從而為進(jìn)行大規(guī)模樣品的集中檢測(cè)，提供了極大的方便。3. 本發(fā)明成本低廉、檢測(cè)效率高、操作簡(jiǎn)便，既有經(jīng)濟(jì)效益又有 社會(huì)效益，是一種創(chuàng)新性較高的具有良好的應(yīng)用前景的定量檢測(cè)食品 中恩諾沙星含量試劑盒及其檢測(cè)方法。


圖1本發(fā)明恩諾沙星-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步詳述，下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不 是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明為定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量的試劑盒，由包被板和 試劑組構(gòu)成，其中該試劑組的組成為(1) 緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH 7.4，使用時(shí)用二次水按1 : 5 稀釋?zhuān)?2) 底物A:為含過(guò)氧化氫脲的醋酸鈉緩沖液；(3) 底物B:為含3，3',5，5'-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯TMB的二甲基亞 砜溶液；(4) 洗滌液為含2.5%吐溫的磷酸鹽緩沖液；使用時(shí)用二次水按 照l(shuí): 5稀釋?zhuān)?(5) 終止液為1.25mol/L硫酸；(6) 恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液其恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為100Mg/L,使 用時(shí)緩沖液稀釋至10)Llg/L后，再按l: 4稀釋六個(gè)梯度；(7) 酶標(biāo)記恩諾沙星抗原溶液為恩諾沙星-辣根過(guò)氧化物酶連接物(ENF-HRP)，使用時(shí)用緩沖液按照l(shuí): 20萬(wàn)倍稀釋。一種定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量的試劑盒的檢測(cè)方法包括 以下步驟(1) .在溫度為10 3(TC時(shí)進(jìn)行樣品前處理，得到樣品提取液；(2) .打開(kāi)試劑盒取出包被板，分別將各種不同濃度的恩諾沙星標(biāo) 準(zhǔn)液和樣品提取液加入到包被板各自的微孔中，并且雙孔平行加樣， 然后再在各種不同濃度恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液和樣品提取液各自的微孔中 加入酶標(biāo)抗原溶液，震蕩混勻5min，室溫反應(yīng)0.8 1.5小時(shí)；(3) .用洗滌液洗包被板3 4次，將孔內(nèi)液體甩掉，用吸水紙扣干， 加入底物A和底物B的混合液，室溫下反應(yīng)0.4 0.6小時(shí)；(4) .向各微孔中加入終止液，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取吸光度值， 根據(jù)各種不同濃度恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值繪制恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn) 曲線(xiàn)圖，對(duì)照恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖得到樣品提取液中恩諾沙星 的含量。下面通過(guò)一具體實(shí)例，對(duì)本發(fā)明的效果進(jìn)行敘述。 檢測(cè)雞肉樣品中恩諾沙星的含量(1) .樣品前處理分別取雞肉樣品各4g，加入10mL萃取液(乙 腈0.1M氫氧化鈉按體積4: 1)，振蕩器混勻2分鐘，提取后經(jīng)過(guò)離心(15°C， 3500g， IO分鐘)，取部分上清液用磷酸鹽緩沖液20倍稀 釋?zhuān)?2) .打開(kāi)試劑盒取出包被板，分別將100)iL恩諾沙星梯度稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液和100 pL樣品提取液雙孔平行加樣加入到包被板各自的微孔 中，然后再在恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液和樣品提取液各自的微孔中各加入100 )iLl: 20萬(wàn)倍稀釋的酶標(biāo)抗原溶液，震蕩均勻5分鐘，室溫反應(yīng)lh;(3) .用洗滌液洗板3次；將孔中液體甩掉，用吸水紙扣干，在每 孔中加入150 pL底物A和底物B的混合液，室溫下反應(yīng)0.5小時(shí)；(4) .向樣品提取液和恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液各自的微孔中加入50 pL終 止液，進(jìn)行終止反應(yīng)，在雙波長(zhǎng)方式(450-650 nm)下用酶標(biāo)儀讀取吸 光度值，繪制恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，對(duì)照恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖得 到樣品提取液中恩諾沙星的含量。
(5)結(jié)果的計(jì)算 1)計(jì)算抑制率值按公式(A)計(jì)算不同濃度恩諾沙星對(duì)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制IC%=、/(樣品-/f空白^對(duì)照-j空白x畫(huà) ....................................(A)式中IC%——恩諾沙星對(duì)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率；A——450nm吸光值與650nm吸光值的差值；A樣品——恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液或樣液的平均吸光度值；A空白——不加入酶標(biāo)及恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液的平均吸光度值。2) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以抑制率為縱坐標(biāo)，恩諾沙星濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制校正曲線(xiàn)。 每次試驗(yàn)均應(yīng)重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖l。3) 結(jié)果計(jì)算從圖1繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀取樣液抑制率所對(duì)應(yīng)的恩諾沙星濃 度(C)，按公式(B)計(jì)算試樣中的恩諾沙星殘留量X=CxR .................................... (B)式中X——試樣中恩諾沙星殘留量，單位為微克每千克(pg/kg); C——根據(jù)樣品孔的抑制率査得試樣中恩諾沙星濃度，單位為 微克每升^g/L);R——換算系數(shù)，例如雞肉為50。 加標(biāo)試驗(yàn)在加標(biāo)試驗(yàn)中，分別向樣品中添加不同濃度的恩諾沙星，將加標(biāo) 樣品充分混勻，室溫靜置過(guò)夜。其余處理過(guò)程同上。在對(duì)雞肉樣品的檢測(cè)中，分別在IO、 20和40Pg/kg水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，其回收 率為82%和72. 5%和79. 25%。人工合成恩諾沙星抗原溶液制備分別精確稱(chēng)取恩諾沙星0.02 0.03mmol， 0.02 0.04mmol N-羥基琥珀酰亞胺和0.05 0.07mmol N,N-二環(huán)已基碳二亞胺溶于 150nLN,N-二甲基甲酰胺中，鋁膜包裹360。室溫?fù)u動(dòng)4-6小時(shí)， 離心(5°C， lOOOOg， 5分鐘)除去沉淀，在冰浴條件下將上層活
化酯溶液緩慢加入到3mL溶有10mgKLH的碳酸氫鈉(130 mmol/L， pH=8.1)溶液中，4。C下將反應(yīng)液360。搖勻反應(yīng)過(guò)夜，然 后將反應(yīng)液裝入透析袋，4。C下、pH=7.4的0.01 mol/mL的磷酸鹽 緩沖液中透析，然后精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積，測(cè)定濃度 加入0.1% (W/V)疊氮鈉，分裝，-2(TC保存。酶標(biāo)記恩諾沙星抗原溶液制備分別精確稱(chēng)取恩諾沙星半抗原0.02 0.03mmo1溶于150pLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.02 0.04mmol N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)和0.05 0.07mmo1 N，N-二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)，鋁膜包 裹360°室溫?fù)u動(dòng)4-6小時(shí)，有混濁物產(chǎn)生、離心(5°C， 10000g， 5 分鐘)除去沉淀，在冰浴條件下將上層活化酯溶液緩慢加入到3mL 溶有10mgHRP的碳酸氫鈉(130mmol/L， pH=8.1)溶液中，放于4 匸下攪拌反應(yīng)過(guò)夜，然后將反應(yīng)液裝入透析袋，4°CT、pH=7.4的0.01 mol/mL的磷酸鹽緩沖液中透析，然后精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的 體積，測(cè)定濃度加入硫柳汞，4"保存包被板的制備多克隆恩諾沙星抗體包被于微孔板中，用pH9.6 Na2C03^NaHC03的緩沖液將多克隆恩諾沙星抗體稀釋為lpg/100(aL 作為包被液，96孔微孔板每孔各加入100pL，室溫放置過(guò)夜或者37°C 恒溫溫育2 3小時(shí)，洗漆液洗滌三次除去包被液，加入200pL凍干 液封閉1小時(shí)，洗滌液洗滌四次后，凍千，4'C保存。恩諾沙星是一種小分子半抗原，分子量為359.16，只有反應(yīng)原性 而無(wú)免疫原性，需要與載體蛋白偶聯(lián)后才能使動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本 試驗(yàn)以合成的恩諾沙星-kLH作為免疫原進(jìn)行動(dòng)物免疫。多克隆恩諾沙星抗體的制備1、 免疫動(dòng)物選擇日本大耳白兔3只，月齡3個(gè)月，體重1.5公 斤左右，分別編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)。免疫采取皮下和肌肉注射法 共同進(jìn)行。2、 免疫程序初次免疫為提高抗原的免疫性，采用由弗氏完 全佐劑乳化的免疫原，劑量為lmg (溶于1 mL 0.9%的NaCl和1 mL 的弗氏完全佐劑)。加強(qiáng)免疫初次免疫后第14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，劑 量為0.5 mg (溶于1 mL 0.9%的NaCi及1 mL的弗氏不完全佐劑)。 以后每隔30天加強(qiáng)免疫一次，共免疫6次。從第2次加強(qiáng)免疫開(kāi)始， 每次免疫IO天后對(duì)動(dòng)物試采血進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定和親和力測(cè)定。末
次免疫后采用頸動(dòng)脈采血法對(duì)動(dòng)物采全血，經(jīng)離心處理后收集全部血 清，采取免疫親合層析法進(jìn)行抗體純化，所得抗體添加0.1% (W/V) 的疊氮鈉后于4"C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1.一種定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量的試劑盒，試劑盒由試劑組和包被板構(gòu)成，其特征在于(1).試劑組①.緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH 7.4，使用時(shí)用二次水按1∶5稀釋?zhuān)虎?底物A為含過(guò)氧化氫脲的醋酸鈉緩沖液；③.底物B為含3，3′，5，5′-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯TMB的二甲基亞砜溶液；④.洗滌液為含2.5％吐溫的磷酸鹽緩沖液；使用時(shí)用二次水按照1∶5稀釋?zhuān)虎?終止液為1.25mol/L硫酸；⑥.恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液其恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為100μg/L，使用時(shí)用緩沖液稀釋后，再按1∶4稀釋六個(gè)梯度；⑦.酶標(biāo)記恩諾沙星抗原溶液為恩諾沙星-辣根過(guò)氧化物酶連接物ENF-HRP，使用時(shí)用緩沖液按照1∶20萬(wàn)倍稀釋?zhuān)?2).包被板包被板的微孔中包被有多克隆恩諾沙星抗體，并采用Na2CO3-NaHCO3的緩沖液將該多克隆恩諾沙星抗體稀釋作為包被液，向包被板中微孔的每個(gè)孔加入包被液，在室溫放置過(guò)夜或者35～40℃恒溫溫育2～3小時(shí)，洗滌液洗滌三次除去包被液，加入凍干液封閉0.8～1.2小時(shí)，洗滌液洗滌四次后，凍干，3～5℃保存。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量的試劑 盒，其特征在于所述的包被板為96孔或48孔微孔板，所述的緩沖 液Na2C03—NaHC03的pH值為9.6。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量的試劑 盒，其特征在于所述的包被板微孔中的多克隆恩諾沙星抗體是選 用雌性大白兔進(jìn)行人工合成抗原ENF-KLH的五次免疫，三次免疫后 10天由兔子的耳緣靜脈采集血液離心獲得抗血清進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，末 次免疫后采用頸動(dòng)脈采血法對(duì)動(dòng)物采全血，經(jīng)離心處理后收集全部血 清，采取免疫親合層析法進(jìn)行抗體純化，所得抗體添加0.1% (W/V) 的疊氮鈉后于4X:儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量的試劑 盒，其特征在于所述的人工合成抗原ENF-KLH為將恩諾沙星，N-羥基琥珀酰亞胺和N,N-二環(huán)已基碳二亞胺溶于N,N-二甲基甲酰胺 中，鋁膜包裹360°室溫?fù)u動(dòng)4 6小時(shí)，離心除去沉淀，在冰浴 條件下將上層活化酯溶液緩慢加入到溶有KLH的碳酸氫鈉溶液 中，4。C下將反應(yīng)液360。搖勻反應(yīng)過(guò)夜，然后將反應(yīng)液裝入透析袋， 4t:下磷酸鹽緩沖液中透析，然后精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體 積，測(cè)定濃度加入疊氮鈉，分裝，-20°0保存。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量試劑 盒，其特征在于所述的包被板中的凍干液為含脫脂奶粉的磷酸 鹽緩沖液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量試劑 盒，其特征在于所述的連接物ENF-HRP為將恩諾沙星、N-羥基 琥珀酰亞胺、N， N， 一二環(huán)己基碳二亞胺溶于N，N-二甲基甲酰胺 中，鋁膜包裹360°室溫?fù)u動(dòng)4 6小時(shí)，離心取上清夜；將辣根 過(guò)氧化物酶HRP溶解于碳酸氫鈉溶液中，將恩諾沙星半抗原反應(yīng) 液在冰浴下滴加入HRP溶液中，滴加完全后4。C下將反應(yīng)液360° 搖勻反應(yīng)過(guò)夜，最后將所有反應(yīng)液放入透析袋中用0. 01 mol/L的 磷酸鹽緩沖液透析72 h。
7. —種如權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量的試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于檢測(cè)方法包括以下步驟(1) .在溫度為10 30。C時(shí)進(jìn)行樣品前處理，得到樣品提取液；(2) .打開(kāi)試劑盒取出包被板，分別將各種濃度的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液 和樣品提取液加入到包被板各自的微孔中，并且雙孔平行加樣，然后 再在各種濃度恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液和樣品提取液各自的微孔中加入酶標(biāo) 抗原溶液，震蕩混勻2 8min，室溫反應(yīng)0.8 1.5小時(shí)；(3) .用洗滌液洗包被板3 4次，將孔內(nèi)液體甩掉，用吸水紙扣干， 加入底物A和底物B的混合液，室溫下反應(yīng)0.4 0.6小時(shí)；(4) .向各微孔中加入終止液，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取吸光度值， 根據(jù)各種濃度恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值繪制恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲 線(xiàn)圖，對(duì)照恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖得至U樣品提取液中恩諾沙星的
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量試劑盒 的檢測(cè)方法，其特征在于所述的底物A和底物B的混合液的配比 為14.6:0.45。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于取樣品加入萃取液，振蕩器混勻2min， 離心，取部分上清液用磷酸鹽緩沖液稀釋。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述的萃取液為乙腈O.IM氫氧化 鈉按體積比為4: l的混合溶液。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域的一種定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量的試劑盒，該試劑盒由包被板和試劑組構(gòu)成，其中該試劑組的組成為(1)緩沖液；(2)底物A；(3)底物B；(4)洗滌液；(5)終止液；(6)恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液；(7)酶標(biāo)記恩諾沙星抗原溶液；包被板的微孔中包被有多克隆恩諾沙星抗體。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好、檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，而且適用范圍較廣，既有經(jīng)濟(jì)效益又有社會(huì)效益，是一種創(chuàng)新性較高且具有良好的應(yīng)用前景的定量檢測(cè)食品中恩諾沙星含量試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101162230SQ20071015028
公開(kāi)日2008年4月16日 申請(qǐng)日期2007年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月22日
發(fā)明者燕 張, 碩 王, 王忠斌 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)