專利名稱：一種分離鑒定血液中有核紅細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及血液分離鑒定檢測技術領域，特別涉及一種分離鑒定血液中 有核紅細胞的方法。
背景技術：
血樣品分離成為各種細胞組分，就需要相應地調節(jié)血樣的處理/加工技 術。將全血樣品分離成為其各種細胞組分的常規(guī)方法是用離心的方法。雖然 此種方法是有效的，但是需要花很大的勞動、效率相當?shù)投倚枰萌斯?控制血樣中的細胞部分。有核紅細胞的分離，是基因分析的開端，也是較為困難的步驟之一?，F(xiàn) 如今各國學者們己經(jīng)嘗試了各種不同的方法來分離有核紅細胞，但仍未找到直接、可靠、高效率的分離途徑。在試圖用化學藥劑來進行血樣中的細胞部分的此種分離時，由于種種原 因，結果始終是不能令人完全滿意的。更準確地說，細胞種群在活體內或體 外的生活強度和生存性，均取決于保持一種與保存實際細胞結構和細胞中的 化學平衡一致的準確生理環(huán)境。細胞膜的滲透性和運送特性可控制細胞中的 化學平衡。生理環(huán)境的改變又可以誘發(fā)細胞膜的應答或改變。細胞膜應答在性質上是"防御性的"；也就是說，細胞膜的生理應答是適合于保持細胞中 的化學平衡，因此是延續(xù)和不間斷細胞的生存性現(xiàn)在已充分認識到，細胞只 能在一定的限度范圍內耐受此種理想生理環(huán)境的改變;而且，還認識到如果 超過此種限度，細胞就會遭到永久性的損傷。在本技術領域中還進一步認識 到，此種生理環(huán)境的改變(即，稀釋介質的毒性-即使是用蒸餾水)可影響 細胞的溶血作用。目前獲取有核紅細胞的途徑主要有兩條:①直接獲取。利用有核紅細胞 表面抗原如CD71, GPA, CD36等作為標記，通過磁激活細胞分選法(magneticactivated sorting, MACS)或焚光激活細胞分選法(fluorescenceactivated cell sorting, FACS)技術獲取有核紅細胞，或利用血液中Y珠蛋白鏈作為標記， 通過免疫組織化學等方法直接識別后，顯微操作獲取。②間接獲取。以顯微 操作法最具代表性，先染色，從形態(tài)上識別，借助高倍顯微操作捕獲單個有 核紅細胞，再應用于基因分析。直接獲取法成本高，或特異性不強，易受污 染，或操作繁瑣，技術要求高，其可靠性、實用性受到置疑，難以推廣應用。 間接獲取法可有效避免污染，隨著單細胞PCR技術的發(fā)展，該法被視為獲 取有核紅細胞較理想的途徑。發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是建立一種快速有效的分離鑒定血液中有 核紅細胞的方法，便于顯微操作，能夠高效、準確地獲取有核紅細胞進行后 續(xù)的細胞鑒定及基因分析。為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種分離鑒定血液中有核紅細胞的 方法，包括以下步驟(一) 配制試劑(1 )多聚賴氨酸工作液多聚賴氨酸儲備液與雙蒸水1: 10充分混合， 氣泡消失后備用；(2 ) PH 7,4含0.5%BSA的O.Olmol/L PBS:氯化鈉6.5gNa2HP04.12H20 4gNaH2P04.2H20 0.35g加雙蒸水800ml,調節(jié)PH值至7.4,雙蒸水補至1000ml, 0.01 mol/LPBS,高壓滅菌后，加入5gBSA，40。C保存；(3 )含KOH 200 mmol/L, DTT 50 mmol/L的堿性細胞裂解液 400 mmol/L KOH1 ml lmol/LDTT 100 ul 滅菌注射用水850ul，充分混合，0.22(im微孔過濾器過濾后分裝, -2(TC保存?zhèn)溆茫?二) 制備防脫膠玻片(1)載玻片的預處理將普通載玻片用熱肥皂水洗刷，自來水清潔干凈，烘干，置于硫酸清潔液中浸泡24小時以上，自來水沖洗過夜，雙蒸水沖洗3遍，烘干，95°/0乙 醇浸泡24小時，雙蒸水沖洗3遍，烤干，15磅高壓滅菌20min ; (2)多聚賴氨酸包被載玻片 將預處理后的玻片在多聚賴氨酸工作液中上下浸蘸10 20秒，分散架于 玻片架上，60 。C以下烘干，4。C保存?zhèn)溆茫?三) 選擇有核紅細胞染色方法；(四) 顯微操作法獲取血液中有核紅細胞。 所述步驟(三)可以進一步包括以下步驟 單密度梯度離心法收集有核血細胞① 血液與等量含0.5 %BSA的0.01 mmol/L PBS混勻，輕輕疊加于淋巴 細胞分離液上，使兩者形成一個清晰的界面，1800r/min水平離心20min, 吸取白膜狀的單個核細胞層，移至預先用PBS濕潤的潔凈玻璃離心管中；② 加入2倍以上0.5 %BSA的O.01mmol/L PBS洗滌細胞，1500r/min水 平離心10min，棄上清，重復三次；③ 用0.01 mmol/L PBS稀釋細胞至適合濃度后涂片，自然干燥。 所述步驟(三)可以進一步包括以下步驟 采用瑞氏-吉姆薩染色法對有核血細胞染色① 玻片置于染片架上，滴加3 5滴瑞氏-吉姆薩復合染色液，使其 迅速覆蓋標本1 min ;② 滴加緩沖液5-10滴，吸耳球對準玻片吹氣，使緩沖液與染液充 分混合，染色5-10min;③ 雙蒸水沖洗，晾干。所述步驟(三)可以進一步包括以下步驟 采用聯(lián)苯胺染色法對有核血細胞染色① 玻片置于1。/o聯(lián)苯胺曱醇溶液中浸泡2min ;② 往溶液中滴加10~20滴30%H2O2，使其與1%聯(lián)苯胺曱醇溶液 之容積比為1:50，混勻，玻片繼續(xù)浸泡l-2min;③ 雙蒸水充分沖洗，晾干； (D蘇木素復染。
所述步驟(四)可以進一步包括以下步驟① 制備好的玻片放置于倒置相差顯微鏡下，400倍光鏡下觀察識別有 核紅細胞并進行計數(shù)；② 在有核紅細胞周圍滴加10~20ul的0.25Q/。蛋白酶K,使之從玻片-上松懈，用顯微操作器單個吸??；③ 將吸取到的細胞移至盛有2.5ul堿性細胞裂解液的PCR專用薄壁反 應管中，離心后于-2(TC低溫冰箱保存?zhèn)錄_企。所述方法可以進一步包括以下從外周血中分離出單個核細胞的步驟(1) 血樣2000r/min離心10min,用吸管吸出每管中80 %的血漿；(2) 而后加入PBS進行稀釋，此液含有一整個白細胞群，包括粒細胞、 淋巴細胞、單核細胞和部分紅細胞；(3) 取2ml淋巴細胞分層液于離心管內，同時用毛細吸管吸取約2ml的 細胞懸液輕輕加入分層液上；以水平轉子離心機2000r/min，離心20min后， 可見分成多層，最下層是紅細胞，中間層是分層液，最上層是血漿；在血漿 層與分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個核細胞層；(4) 用毛細吸管插入到單個核細胞層，吸取該層，放入另一試管中；以 Hanks液洗滌、離心。所述方法可以進一步包括以下有核紅細胞的分離純化步驟(1) 尼龍毛柱的制備① 取尼龍毛用0.2mol/LHCl浸泡處理過夜；② 用雙蒸水洗凈HC1，置37。C烘干備用；③ 稱取90 120mg尼龍毛，均勻分散，置Hanks液中浸泡；④ 取lml注射器，出口接塑料管，夾?。?(D將尼龍毛均勻填塞入注射器中，排凈空氣，柱高7 8cm; ⑥將制各好的柱高壓滅菌各用；(2) 尼龍毛分離有核紅細胞① 取分離的單個核細胞，用細胞培養(yǎng)液將細胞配成400個/ml ;② 融化尼龍毛柱，以每分鐘18 ~ 20滴的速度放出Hanks液，預溫至37 °C的細胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱；③ 將細胞懸液加入尼龍毛柱中，待細胞懸液全部進入尼龍毛柱后，立即
加0.2ml細胞培養(yǎng)液，夾住塑料管；在37。C的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中 靜置l小時；④ 用5ml預溫至37。C的細胞培養(yǎng)液洗脫細胞，再用5ml預溫至37 。C的 細胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱，洗凈粘附的細胞；⑤ 加入2ml細胞培養(yǎng)液，夾住塑料管，將尼龍毛柱置冰箱中冷卻；用4 。C預冷的細胞培養(yǎng)液分3~4次洗脫尼龍毛柱，每次2ml;先夾住塑料管， 用玻璃棒或金屬絲反復擠壓尼龍毛以利于粘附細胞脫落，然后再洗脫； 離心，1000rpm, IO分鐘，去上清液，用細胞培養(yǎng)液洗滌細胞1次； 計數(shù)細胞，用細胞培養(yǎng)液將細胞重懸。所述方法可以進一 步包括以下有核紅細胞的分離純化步驟1) 抗凝血劑以等體積的生理鹽水稀釋；2) 緩漫地加于Ficoll液面上，血液與Ficoll的界面保持清晰；3) 2000rpm,離心20min;4) 吸取云霧狀的單個核細胞層；5) 1000rpm,離心15min;6) 棄去上清，洗滌沉淀；7) 1000rpm,離心15min;8) 重復三次第6)、 7)步；9) 棄上清，沉淀。所述方法中使用的儀器設備可以為以下設備 RPM工1640培養(yǎng)基美國Gibc公司； 細胞分離液上海華精生物高乖日支有限公司； 血凝素PHA:廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所； P-III型倒置顯微鏡日本Nikon公司； 24孔細胞培養(yǎng)板美國Corning公司； C02培養(yǎng)箱美國Forma scientific公司；DL-CJ-2N高性能無菌實驗臺哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公 司北京分公司；0412-1型微量低速離心機上海手術器械廠。 所述方法中PBS溶液的配置方法可以為NaCL18.8g, KC10.2g， Na2HP04 3.488g，加雙蒸水至1000ml,調PH值 為7.4， 15磅高壓滅菌，4。C保存。本發(fā)明分離鑒定血液中有核紅細胞的方法能有效識別有核紅細胞，40 例樣本均能檢出有核紅細胞，檢出率100%，每例發(fā)現(xiàn)有核紅細胞2x 106~ 6xl(^個/ml。本發(fā)明聯(lián)苯胺染色后有核紅細胞易于識別，熟練的顯微操作 能迅速獲取單個有核紅細胞，為應用單個有核紅細胞進行基因分析打下良好 的前期基礎。有核紅細胞可應用于某些基因分析和篩查。實現(xiàn)顯微操作法獲 取單個有核紅細胞進行基因分析，首先必須從血液中識別分離有核紅細胞。本發(fā)明采用聯(lián)苯胺染色法識別有核紅細胞，借助顯微操作將其從血液中分 離，為基因分析和篩查打下基礎。


圖1為本發(fā)明實施例所述有核紅細胞瑞氏-吉姆薩染色圖； 圖2為本發(fā)明實施例所述有核紅細胞聯(lián)苯胺染色圖。具體實施務式(一) 主要試劑配制1. 多聚賴氨酸工作液多聚賴氨酸儲備液與雙蒸水1: IO充分混合， 待氣泡消失后備用；2. 含0.5%BSA的0.01mol/L PBS(PH 7,4 )氯化鈉6.5g Na2HP04.12H20 4g NaH2P04.2H20 0.35g加雙蒸水800ml,調節(jié)PH值至7.4,雙蒸水補至1000ml即配 成。0.01 mol/LPBS，高壓滅菌后，加入5gBSA， 40。C保存。3. 堿性細胞裂解液(含KOH 200 mmol/L, DTT 50 mmol/L )400 mmol/L KOH 1 ml lmol/LDTT 100 ul滅菌注射用水850~900ul,充分混合，0.22pm微孔過濾器過 濾后分裝，-2(TC保存?zhèn)溆谩?二) 防脫膠玻片制備
l.載玻片的預處理將普通載玻片用熱肥皂水洗刷，自來水清潔千凈，烘干，置于疏酸清潔液中浸泡24小時以上，自來水沖洗過夜，雙蒸水沖洗3遍，烘干，95% 乙醇浸泡24小時，雙蒸水沖洗3遍，烤干，15磅高壓滅菌20min. 2.多聚賴氨酸包被載玻片將預處理后的玻片在多聚賴氨酸工作液中上下浸蘸10~20秒，分散 架于玻片架上，60 。C以下烘干，4。C保存?zhèn)溆谩?(三)有核紅細胞染色方法的選擇 從外周血中分離出單個核細胞(1) 血樣2000r/min離心10min,用吸管吸出每管中絕大部分血漿；(2) 而后加入PBS進行稀釋，此液含有一整個白細胞群，包括粒細 胞、淋巴細胞、單核細胞和部分紅細胞；(3) 取2ml淋巴細胞分層液于離心管內，同時用毛細吸管吸取約2ml 的細胞懸液輕輕加入分層液上。以水平轉子離心機2000r/min,離心20min 后，可見分成多層，最下層是紅細胞，中間層是分層液，最上層是血漿。在 血漿層與分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個核細胞層；(4) 用毛細吸管插入到單個核細胞層，吸取該層，放入另一試管中； 以Hanks液洗滌、離心，最后配制成適當?shù)募氃掳鼭舛?。有核紅細胞分離純化 l)尼龍毛柱的制各① 取尼龍毛用0.2mol/LHCl浸泡處理過夜；② 用雙蒸水洗凈HC1，置37。C烘干各用；③ 稱取90 120mg尼龍毛，均勻分散，置Hanks液中浸泡；④ 取lml注射器，出口接塑料管，夾住；⑤ 將尼龍毛均勻填塞入注射器中，排凈空氣，柱高約7 8cm;⑥ 將制各好的柱高壓滅菌各用； (2)尼龍毛分離有核紅細胞① 取分離的單個核細胞，用細胞培養(yǎng)液將細胞配成400個/ml ;② 融化尼龍毛柱，以每分鐘18~20滴的速度放出Hanks液，預溫至37
°c的細胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱。③ 將細胞懸液加入尼龍毛柱中，待細胞懸液全部進入尼龍毛柱后，立即加0.2ml細胞培養(yǎng)液，夾住塑料管；在37。C的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中 靜置1小時；④ 用5ml預溫至37t:的細胞培養(yǎng)液洗脫細胞，再用5ml預溫至37。C的 細胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱，洗凈粘附的細胞。⑤ 加入2ml細胞培養(yǎng)液，夾住塑料管，將尼龍毛柱置水箱中冷卻；用4 。C預冷的細胞培養(yǎng)液分3~4次洗脫尼龍毛柱，每次2ml。先夾住塑料管， 用玻璃棒或金屬絲反復擠壓尼龍毛以利于粘附細胞脫落，然后再洗脫； 離心，1000rpm， IO分鐘，去上清液，用細胞培養(yǎng)液洗滌細胞1次； 計數(shù)細月包，用細月包培養(yǎng)液將細月包重懸； 儀器1. RPM工1640培養(yǎng)基(干粉):美國Gibc公司2. 細胞分離液((Ficoll):上海華精生物高乖日支有限公司3. 血凝素PHA ( 1 0mg/支):廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所4. P-III型倒置顯微鏡日本Nikon公司5. 24孔細胞培養(yǎng)板:美國Corning公司6. C02培養(yǎng)箱美國Forma scientific 7>司7. DL-CJ-2N高性能無菌實驗臺:哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公 司北京分公司8. 0412-1型微量低速離心機:上海手術器械廠PBS溶液:NaCL 18.8g， KCl 0.2g， Na2HP04 3.488g,加雙蒸水至1000ml, 調PH值為7.4, 15磅高壓滅菌，4'C保存。用Ficoll密度梯度離心法分離血樣中的有核紅細胞，具體步驟如下 1 )抗凝血劑以等體積的生理鹽水稀釋；2) 緩漫地加于Ficoll液面上，血液與Ficoll的界面保持清晰；3) 2000rpm，離心20min;4) 吸取云霧狀的單個核細胞層；5) 1000rpm,離心15min;6) 棄去上清，洗滌沉淀； 7) 1000rpm,離心15min;8) 重復一次第6)、 7)步； 9)棄上清，沉淀。單密度梯度離心法收集有核血細胞① 血液與等量含0.5 %BSA的0.01 mmol/L PBS混勻，輕輕疊加于淋巴 細胞分離液上，1吏兩者形成一個清晰的界面，1800r/min水平離心20min, 吸取白膜狀的單個核細胞層，移至預先用PBS濕潤的潔凈玻璃離心管中。② 加入2倍以上0.5 % BSA的0.01mmol/L PBS洗滌細胞，1500r/min水 平離心10min,棄上清。重復一次。③ 用0.01 mmol/L PBS稀釋細胞至適合濃度后涂片，自然干燥。 有核血細月包染色方法(1) 瑞氏-吉姆薩染色法① 玻片置于染片架上，滴加3~5滴瑞氏-吉姆薩復合染色液，使其 迅速覆蓋標本，約1 min 。② 滴加緩沖液5 10滴，吸耳球對準玻片吹氣，使緩沖液與染液充 分混合，染色5 10min。③ 雙蒸水沖洗，晾干。(2) 聯(lián)苯胺染色法① 玻片置于P/。聯(lián)苯胺曱醇溶液中浸泡2min 。② 往溶液中滴加10~20滴30%H2O2,使其與1%聯(lián)苯胺甲醇溶液 之容積比為1:50,混勾，玻片繼續(xù)浸泡l~2min.③ 雙蒸水充分沖洗，晾干。④ 蘇木素復染。(四)顯微操作法獲耳又血液中有核紅細胞①制備好的玻片放置于倒置相差顯微鏡下，400倍光鏡下觀察識別 有核紅細胞并進行計數(shù)。② 在有核紅細胞周圍滴加10~20ul的0.25。/。蛋白酶K，使之從玻片 上松懈，用顯微操作器單個吸取。③ 將吸取到的細胞移至盛有2.5 ul堿性細胞裂解液的PCR專用薄壁反 應管中，離心后于-2(TC低溫冰箱保存?zhèn)錂z。
結果一、 有核紅細胞的富集單密度梯度離心分離出的細胞含有90%以上的淋巴細胞，少量單核 細胞和有核紅細胞等等。二、 有核紅細胞染色如圖l所示，為本發(fā)明實施例所述有核紅細胞瑞氏-吉姆薩染色圖。 其中，瑞氏-吉姆薩染色為IOOO倍光鏡下有核紅細胞胞質呈紫藍色，胞核呈 深藍色，400倍光鏡下有時難以與其它細胞尤其是淋巴細胞區(qū)分開。如圖2所示，為本發(fā)明實施例所述有核紅細胞聯(lián)苯胺染色圖。其中， 有核紅細胞聯(lián)苯胺染色光學顯微鏡下可見有核紅細胞細胞質呈棕黃色，蘇 木素復染后胞核呈藍色，明顯區(qū)分于其它細胞，識別效果優(yōu)于瑞氏-吉姆薩 染色。有核紅細胞4企出率40例樣本均能檢出有核紅細胞，檢出率100 % ,每例發(fā)現(xiàn)有核紅細胞2 ~ 6個/ml，共獲取157個。外周血中單個核細胞主要包括淋巴細胞、有核紅細胞和單核細胞，其體 積、形態(tài)和密度與其他細胞不同。紅細胞和多核粒細胞密度較大，為1.090 左右，而單個核細胞密度為1.075 - 1.090,血小板為1.030~ 1.035。如果利 用一種密度介于1.075 ~ 1.092之間而近于等滲的溶液(分層液)做密度梯度離 心，就能將各種不同密度的血細胞進行分離。本發(fā)明的分離介質是密度為 1.077的淋巴細胞分離液，水平式離心后，離心管中會出現(xiàn)幾個不同層次的 液體和細胞帶，與分層液密度相當?shù)膯蝹€核細胞密集在血漿層和分層液的界 面中，呈白膜狀。用本發(fā)明方法分離的細胞，單個核細胞純度可達95%，細 胞獲得率達80%以上。用顯微操作法分離有核紅細胞時，識別是一個關鍵步驟?，F(xiàn)有技術中常 用瑞氏-吉姆薩染色識別有核紅細胞，然而，使用現(xiàn)有技術的方法，有核紅 細胞在富集過程中，經(jīng)過了多次洗滌、離心，制片后細胞均有不同程度的變 形、皺縮，用上述染色在400倍光鏡下不易辨認有核紅細胞，分離難度大。 紅細胞中的血紅蛋白或正鐵血紅素具有過氧化物酶樣的活性，能使過氧化氬
釋放出新生態(tài)氧，將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。因 此，本發(fā)明采用聯(lián)苯胺染色，將有核紅細胞胞質染成棕黃色，再進行蘇木素復染，使胞核著色成藍色，400倍光鏡下能清楚識別，結合熟練的顯微操作 技術，即能迅速、準確地捕獲單個有核紅細胞。本發(fā)明檢驗方法檢出率100%， 40例樣本均能檢出有核紅細胞，檢出率 100%,每例發(fā)現(xiàn)有核紅細胞2x l06~6x 106個/ml，出現(xiàn)頻率高。使用本發(fā)明方法分離鑒定血液中的有核紅細胞，檢測費用低，操作簡單， 聯(lián)苯胺染色一蘇木素復染后有核紅細胞在400倍光鏡下識別效果優(yōu)于瑞氏-吉姆薩染色，鏡下能更快速搜捕到目的細胞，更便于后期顯微操作法捕獲有 核紅細月包。使用本發(fā)明鑒定方法，聯(lián)苯胺染色后顯微操作法能高效、準確地識別并 獲取單個有核紅細胞，結合全基因組擴增技術，可應用于基因分析技術。
權利要求
1、 一種分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟(一) 配制試劑(1 )多聚賴氨酸工作液多聚賴氨酸儲備液與雙蒸水1: 10充分混合， 氣泡消失后備用；(2 ) PH 7.4含0.5%BSA的0.01mol/L PBS:氯化鈉6.5gNa2HP04'12H20 4gNaH2P04.2H200.3 5g加雙蒸水800ml,調節(jié)PH值至7.4，雙蒸水補至1000ml ， 0.01 mol/LPBS,高壓滅菌后，加入5gBSA, 40。C保存；(3 )含KOH 200 mmol/L, DTT 50 mmol/L的堿性細胞裂解液 400 mmol/L KOH1 ml lmol/LDTT100 ul 滅菌注射用水850ul，充分混合，0.22lim微孔過濾器過濾后分裝， -20匸保存?zhèn)溆茫?二) 制備防脫膠玻片(1) 載玻片的預處理將普通載玻片用熱肥皂水洗刷，自來水清潔干凈，烘干，置于硫酸清潔 液中浸泡24小時以上，自來水沖洗過夜，雙蒸水沖洗3遍，烘干，95%乙 醇浸泡24小時，雙蒸水沖洗3遍，烤千，15磅高壓滅菌20min ;(2) 多聚賴氨酸包被載玻片 將預處理后的玻片在多聚賴氨酸工作液中上下浸蘸10-20秒，分散架于玻片架上，60 。C以下烘干，4。C保存?zhèn)溆茫?三) 選擇有核紅細胞染色方法；(四) 顯微操作法獲取血液中有核紅細胞。
2、 根據(jù)權利要求1所述的分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征 在于，所述步驟(三)進一步包括以下步驟單密度梯度離心法收集有核血細胞 ① 血液與等量含0.5 %BSA的0.01 mmol/L PBS混勻，輕輕疊加于淋巴 細胞分離液上，4吏兩者形成一個清晰的界面，1800r/min水平離心20min， 吸取白膜狀的單個核細胞層，移至預先用PBS濕潤的潔凈玻璃離心管中；② 加入2倍以上0.5 %BSA的0.01mmol/L PBS洗滌細胞，1500r/min水 平離心10min,棄上清，重復三次；③ 用0.01 mmol/L PB S稀釋細胞至適合濃度后涂片，自然干燥。
3、 根據(jù)權利要求2所述的分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征 在于，所述步驟(三)進一步包括以下步驟采用瑞氏-吉姆薩染色法對有核血細胞染色① 玻片置于染片架上，滴加3~5滴瑞氏-吉姆薩復合染色液，使其 迅速覆蓋標本1 min ;② 滴加緩沖液5-10滴，吸耳球對準玻片吹氣，使緩沖液與染液充 分混合，染色5 10min;③ 雙蒸水沖洗，晾千。
4、 根據(jù)權利要求2所述的分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征 在于，所述步驟(三)進一步包括以下步驟釆用聯(lián)苯胺染色法對有核血細胞染色① 玻片置于1。/。聯(lián)苯胺曱醇溶液中浸泡2min ;② 往溶液中滴加10~20滴30%H2O2，使其與1%聯(lián)苯胺曱醇溶液 之容積比為1:50,混勻，玻片繼續(xù)浸泡1 2min;③ 雙蒸水充分沖洗，晾干；④ 蘇木素復染。
5、 根據(jù)權利要求1 - 4中任意一項所述的分離鑒定血液中有核紅細胞的 方法，其特征在于，所述步驟(四)進一步包括以下步驟① 制備好的玻片放置于倒置相差顯微鏡下，400倍光鏡下觀察識別有 核紅細胞并進行計數(shù)；② 在有核紅細胞周圍滴加10~20 ul的0.25。/o蛋白酶K，使之從玻片 上松懈，用顯微操作器單個吸??；③ 將吸取到的細胞移至盛有2.5 ul堿性細胞裂解液的PCR專用薄壁反 應管中，離心后于-2(TC低溫冰箱保存?zhèn)錂z。
6、 根據(jù)權利要求5所述的分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征 在于，所述方法中進一 步包括以下從外周血中分離出單個核細胞的步驟(1) 血樣2000r/min離心10min，用吸管吸出每管中80%的血漿；(2) 而后加入PBS進行稀釋，此液含有一整個白細胞群，包括粒細胞、 淋巴細胞、單核細胞和部分紅細胞；(3) 取2ml淋巴細胞分層液于離心管內，同時用毛細吸管吸取約2ml的 細胞懸液輕輕加入分層液上；以水平轉子離心機2000r/min,離心20min后， 可見分成多層，最下層是紅細胞，中間層是分層液，最上層是血漿；在血漿 層與分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個核細胞層；(4) 用毛細吸管插入到單個核細胞層，吸取該層，；故入另一試管中；以 Hanks液洗滌、離心。
7、 根據(jù)權利要求6所述的分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征 在于，所述方法中進一步包括以下有核紅細胞的分離純化步驟(1) 尼龍毛柱的制備① 取尼龍毛用0.2mol/L HC1浸泡處理過夜；② 用雙蒸水洗凈HC1，置37。C烘干備用；③ 稱取90- 120mg尼龍毛，均勻分散，置Hanks液中浸泡；④ 取lml注射器，出口接塑料管，夾??；⑤ 將尼龍毛均勻填塞入注射器中，排凈空氣，柱高7 8cm;⑥ 將制各好的柱高壓滅菌各用；(2) 尼龍毛分離有核紅細胞① 取分離的單個核細胞，用細胞培養(yǎng)液將細胞配成400個/ml ;② 融化尼龍毛柱，以每分鐘18 ~ 20滴的速度放出Hanks液，預溫至37 °C的細胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱；③ 將細胞懸液加入尼龍毛柱中，待細胞懸液全部進入尼龍毛柱后，立即 力口 0.2ml細胞培養(yǎng)液，夾住塑料管；在37匸的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中 靜置1小時；@用5ml預溫至37。C的細胞培養(yǎng)液洗脫細胞，再用5ml預溫至37'C的 細胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱，洗凈粘附的細胞；(D加入2ml細胞培養(yǎng)液，夾住塑料管，將尼龍毛柱置水箱中冷卻；用4。C預冷的細胞培養(yǎng)液分3~4次洗脫尼龍毛柱，每次2ml;先夾住塑料管， 用玻璃棒或金屬絲反復擠壓尼龍毛以利于粘附細胞脫落，然后再洗脫； 離心，1000rpm, IO分鐘，去上清液，用細胞培養(yǎng)液洗滌細胞1次； 計數(shù)細胞，用細胞培養(yǎng)液將細胞重懸。
8、 根據(jù)權利要求6所述的分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征 在于，所述方法中進一步包括以下有核紅細胞的分離純化步驟1) 抗凝血劑以等體積的生理鹽水稀釋；2) 緩漫地加于Ficoll液面上，血液與Ficoll的界面保持清晰；3) 2000rpm,離心20min;4) 吸取云霧狀的單個核細胞層；5) 1000rpm，離心15min;6) 棄去上清，洗滌沉淀；7) 1000rpm,離心15min;8) 重復三次第6)、 7)步；9) 棄上清，沉淀。
9、 根據(jù)權利要求8所述的分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征 在于，所述方法中使用的儀器設備為以下設備RPM工1640培養(yǎng)基美國Gibc公司； 細胞分離液上海華精生物高乖日支有限公司； 血凝素PHA :廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所； P-III型倒置顯微鏡日本Nikon公司； 24孔細胞培養(yǎng)板:美國Coming公司； C02培養(yǎng)箱美國Forma scientific公司；DL-CJ-2N高性能無菌實驗臺哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公 司北京分公司；0412-1型微量低速離心機上海手術器械廠。
10、 根據(jù)權利要求9所述的分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征 在于，所述方法中PBS溶液的配置方法為NaCl 18.8g， KC10.2g， Na2HP04 3.488g，加雙蒸水至1000ml,調PH值 為7.4， 15磅高壓滅菌，4。C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，包括以下步驟(一)配制試劑；(二)制備防脫膠玻片；(三)選擇有核紅細胞染色方法；(四)顯微操作法獲取血液中有核紅細胞。本發(fā)明分離鑒定血液中有核紅細胞的方法能有效識別有核紅細胞，40例樣本均能檢出有核紅細胞，檢出率100％，每例發(fā)現(xiàn)有核紅細胞2×10⁶～6×10⁶個/ml。本發(fā)明聯(lián)苯胺染色后有核紅細胞易于識別，熟練的顯微操作能迅速獲取單個有核紅細胞，為應用單個有核紅細胞進行基因分析打下良好的前期基礎。
文檔編號G01N1/30GK101122601SQ20071015196
公開日2008年2月13日 申請日期2007年9月24日 優(yōu)先權日2007年9月24日
發(fā)明者孫艷萍 申請人:孫艷萍