專利名稱：自身抗體的互補(bǔ)式親和層析純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種以互補(bǔ)式免疫親和層析為主要創(chuàng)新點(diǎn)的特異性純化自身抗體 的技術(shù)方案，尤其適用于對組織細(xì)胞中因組成成份較多而不適宜于用基因工程表 達(dá)和單克隆抗體親和層析獲得的自身抗原的多克隆抗體純化，屬于抗原抗體制備 和檢測的免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在很多人的體內(nèi)存有自身抗原，它們種類繁多，可以剌激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生 免疫反應(yīng)，產(chǎn)生針對自身抗原的抗體和致敏淋巴細(xì)胞，由此而引起很多的自身免 疫性疾病。如何從機(jī)體的組織細(xì)胞或體液中提取純化這些自身抗原，在技術(shù)上一 直有難度，主要問題是獲得的抗原特異性不高，不易剔除機(jī)體的其他正常組織成 分，因此利用這些自身抗原制作試劑盒檢測特異性自身抗體時普遍存有很高的非 特異性反應(yīng)，即假陽性較多。如何從機(jī)體血清中特異性地純化這些自身抗原的抗 體就更加困難，尤其是針對那些組成成份眾多的自身抗原的抗體。由于難以獲得 特異性和純度很高的自身抗體的標(biāo)準(zhǔn)品，自身抗體的定量檢測就很難進(jìn)行，因此 目前國內(nèi)外絕大多數(shù)自身抗體的定量檢測試劑盒都只能半定量，以相對單位數(shù)作 為機(jī)體體液中自身抗體的相對含量，而且各廠家自行定義各自的相對單位數(shù)，互 不可比。例如，不孕育癥占我國已婚夫婦的8-15%，其中很多夫婦是因?yàn)闄C(jī)體對精子 抗原和子宮內(nèi)膜抗原等發(fā)生了免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的抗精子抗體和抗子宮內(nèi)膜抗體能 破壞精子和子宮內(nèi)膜導(dǎo)致不孕，因此檢測這些自身抗體的有無和含量是不孕癥診 斷和療效觀察的重要指標(biāo)。但是，檢測抗體必須要有特異性的抗原。如何純化精子抗原、子宮內(nèi)膜抗原等自身抗原呢？近年來國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的方法主要有超 聲波粉碎、反復(fù)凍融破碎精子細(xì)胞或子宮內(nèi)膜細(xì)胞等物理方法；化學(xué)試劑如LTS、DTT、 NP-40及Triton X-100等化學(xué)萃取法或膠原酶消化法；基因克隆表達(dá)單種 精子抗原以及利用單克隆抗體制備親和層析柱的純化法等。 后兩種方法純化所得抗原的特異性最高，但是缺點(diǎn)也非常明顯?；蚬こ碳?術(shù)只能克隆表達(dá)單一組分的抗原，而很多自身抗原的組成成份繁多，如精子抗原 多達(dá)100余種，子宮內(nèi)膜抗原也種類眾多，用基因克隆表達(dá)的僅包括極少數(shù)組分 的抗原來檢測機(jī)體內(nèi)的抗精子抗體和抗子宮內(nèi)膜抗體極易導(dǎo)致漏檢，因而離實(shí)際 應(yīng)用尚遠(yuǎn)；另一個缺點(diǎn)是很多自身抗原從基因到蛋白質(zhì)序列都不清楚，不能進(jìn)行 基因克隆表達(dá)。利用單克隆抗體制備親和層析柱進(jìn)行親和層析，同樣也 只能純化單一組分的自身抗原，而且需要制備單克隆抗體。單抗的制備不但技術(shù) 繁雜，很多時候無法用含有目的抗原的機(jī)體組織細(xì)胞或體液作為靶抗原進(jìn)行單克 隆抗體的篩選，從而無法得到單抗，也因此很多自身抗原無法通過單抗的親和層 析法來純化。物理法和化學(xué)法提取的自身抗原純度較差，極難清除與機(jī)體血清中 其他成分的非特異性反應(yīng)。在自身抗體的純化方面，國內(nèi)少有報(bào)道，國外主要是制備針對基因工程表達(dá) 的自身抗原的單克隆抗體。這些單克隆抗體的克隆數(shù)有限，大多用于科研中。象 其他任何抗體的定量檢測一樣，抗精子抗體的定量檢測也需要有抗精子抗體的標(biāo) 準(zhǔn)品。但是人類精子抗原多達(dá)數(shù)百種，而且大多數(shù)未能進(jìn)行基因確定和克隆表達(dá)， 因此無法利用基因重組抗原篩選出如此眾多的單克隆或多克隆抗體。不同抗原成 份誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，其親和力差異很大。即使能獲得少數(shù)幾種基因重組精子抗原， 其對應(yīng)的單克隆抗體或者幾種單抗的混合物只能與精子的極少數(shù)抗原決定簇結(jié) 合，因此它們在與固相載體上包被的成份和決定簇均相當(dāng)復(fù)雜的抗原結(jié)合時，機(jī) 率很小，同時它們的親和力也不足以代表體內(nèi)幾百種精子抗原的對應(yīng)抗體的親和 力。這種親和力差異將直接導(dǎo)致定量檢測結(jié)果的不同。相比之下，從抗血清中提 取純化的人工主動免疫或自然免疫狀態(tài)下產(chǎn)生的多克隆抗體，因其針對的抗原成 份和決定簇的多樣性和隨機(jī)性，更能代表定量檢測中待測標(biāo)本中抗體與抗原的結(jié) 合能力，因此更適合于作為定量檢測自身抗體時的抗體標(biāo)準(zhǔn)品。2001年，我們報(bào)道了利用兩種多克隆抗體制備兩種親和層析柱(A柱和B 柱)，對人精子膜抗原進(jìn)行互補(bǔ)式親和層析純化，獲得了純度很高的精子膜抗原， 制成了抗精子抗體的定性酶標(biāo)檢測試劑盒，經(jīng)過了南京金陵男科醫(yī)院、鄭州博賽 生物工程公司等4家單位的試用，并參加了東南大學(xué)首屆科技成果展。(沈傳來、 張建瓊、賈力敏等。親和層析純化精子膜抗原的方法及精子抗體的檢測，上海免 疫學(xué)雜志，2001; 21: 102-104)。 2002年以后，為了從病人血清或免疫動物血 清中高度特異性地純化抗精子抗體，以進(jìn)一步制備抗精子抗體定量檢測試劑盒， 我們開始改進(jìn)精子抗原的純化方案，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一歩設(shè)計(jì)精子抗體的純化方 案。最終，我們制備了親和層析A、 B、 C柱純化精子抗原，再制備親和層析D、 E、 F柱，進(jìn)一步從抗人精子的兔抗血清中提取純化了抗精子多克隆抗體，用于 精子抗體的定量酶標(biāo)檢測。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)所得的抗精子多克隆抗體不與正常 人全血清、正常人組織細(xì)胞裂解液以及牛血清白蛋白等可能出現(xiàn)在檢測系統(tǒng)中的 成份發(fā)生反應(yīng)，為其成為自身抗體定量分析中的抗體標(biāo)準(zhǔn)品奠定了基礎(chǔ)。目前市 場上尚無基于抗體標(biāo)準(zhǔn)品的精子抗體定量檢測試劑盒，只有從國外進(jìn)口的以 IU/ml為相對計(jì)量單位的半定量檢測試劑盒。迄今為止，未有其他人報(bào)道過利用本發(fā)明方案從人血清或免疫動物血清中提 取純化抗自身抗原的多克隆抗體。發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明目的在于提供一種自身抗體的互補(bǔ)式親和層析純化方法， 應(yīng)用此方法純化的自身抗體不但特異性和純度極高，而且組分眾多，特別適用于 組成成份較多的自身抗原所誘導(dǎo)的自身抗體的純化。技術(shù)方案該方案避免了基因克隆表達(dá)和單克隆抗體制備等繁雜技術(shù)，只需 制備多克隆抗體、血清蛋白、組織細(xì)胞裂解液和親和層析柱，操作簡便，耗費(fèi)低 廉，實(shí)驗(yàn)室條件要求不高，相對省時省力。本方案純化所得的多克隆自身抗體可 以作為抗體標(biāo)準(zhǔn)品，用來制作基于各類免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的自身抗體定量檢測試劑 盒，對自身免疫性疾病的診斷、治療、預(yù)后和療效觀察具有重要價值。為了解決從血清中純化自身抗體的技術(shù)難題，我們利用多克隆抗體、血清蛋白、組織細(xì)胞裂解液等制備6種親和層析柱，建立了以互補(bǔ)式親和層析為主要創(chuàng)新點(diǎn)的純化方法。 該方法為首先用互補(bǔ)式親和層析法純化制備自身抗原11) 收集人的目的組織細(xì)胞，用NP-40萃取細(xì)胞膜抗原，再用超聲波粉碎組 織細(xì)胞，超速離心后取上清液，作為粗制抗原A液，12) 用目的組織細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)動物，取抗血清，經(jīng)鹽析法粗提Y免疫球蛋白，稱免疫血清IgG;同時取未被免疫的該種實(shí)驗(yàn)動物的混合血清，經(jīng)鹽析法粗提Y
免疫球蛋白，稱未免疫血清IgG;用正常人混合全血清免疫實(shí)驗(yàn)動物，取抗血清， 同樣經(jīng)鹽析法粗提Y免疫球蛋白，稱抗人全血清IgG，13) 用S印harose-4B瓊脂糖凝膠分別與上述的免疫血清IgG、未免疫血清 IgG和抗人全血清IgG偶聯(lián)成免疫親和層析A柱、B柱和C柱，14) 取粗制抗原A液過親和層析A柱，收集與A柱上IgG結(jié)合的抗原物質(zhì)， 濃縮后為粗制抗原B液；再取粗制抗原B液過親和層析B柱，收集不與B柱上 IgG結(jié)合的抗原物質(zhì)，濃縮后為粗制抗原C液；最后取粗制抗原C液過親和層析 C柱，收集不與C柱上IgG結(jié)合的抗原物質(zhì)，濃縮后為精制抗原液； 然后用互補(bǔ)式親和層析法純化制備抗自身抗原的多克隆抗體-21) 收集自身抗體陽性的病人血清或者用自身抗原免疫接種的實(shí)驗(yàn)動物的抗 血清；用鹽析法及DEAE52纖維素柱純化IgG型和IgA型免疫球蛋白，并分別稱 為粗制IgG型抗體D液和粗制IgA型抗體D液，22) 收集不含目的自身抗原的健康人的混合血清；收集不含目的抗原的人的 組織細(xì)胞，并制備成組織細(xì)胞裂解液，23) 用S印harose-4B瓊脂糖凝膠分別與上述的精制抗原液、不含目的抗原 的健康人混合血清以及不含目的抗原的人組織細(xì)胞裂解液偶聯(lián)成親和層析D柱、 E柱和F柱，24) 取粗制IgG型或IgA型抗體D液過親和層析D柱，收集與D柱上自身抗 原相結(jié)合的抗體物質(zhì)，濃縮后為粗制IgG型或IgA型抗體E液；后者過親和層析 E柱，收集不與E柱上蛋白相結(jié)合的抗體物質(zhì)，濃縮后為粗制IgG型或IgA型抗 體F液；F液再過親和層析F柱，收集不與F柱上蛋白相結(jié)合的抗體物質(zhì)，濃縮 后為精制自身抗體液IgG型或者IgA型。在歩驟13)和歩驟23)用Sepharose-4B瓊脂糖凝膠制備親和層析A、 B、 C、 D、 E和F柱時，用非Sepharose-4B的瓊脂糖凝膠代替。在步驟24)用親和層析D、 E和F柱聯(lián)合進(jìn)行互補(bǔ)式親和層析時，只用D柱 或者用D柱和E柱聯(lián)合。在步驟ll)時不是收集目的組織細(xì)胞，而是收取含有目的抗原的人的體液， 繼而不用NP-40萃取細(xì)胞膜抗原和超聲波粉碎組織細(xì)胞，直接用含有目的抗原的 人的體液免疫實(shí)驗(yàn)動物。有益效果① 本發(fā)明提供了一種從人血清或免疫動物血清中特異性純化自身抗體的技 術(shù)方案。② 應(yīng)用本方案純化的自身抗體不但特異性和純度極高。③ 本方案特別適用于純化組成成份較多的自身抗原所誘導(dǎo)的多克隆自身抗 體。因?yàn)榻M成成份較多的自身抗原很多從基因到蛋白質(zhì)序列都不清楚，不能進(jìn)行 基因克隆表達(dá)而獲得，也不能通過單克隆抗體的親和層析而全部獲得。這些自身 抗原所誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的自身抗體種類眾多，因抗原很難獲得，也因此很難純化組 份眾多的針對同一種自身抗原的自身抗體。④ 本方案避免了基因克隆表達(dá)和單克隆抗體制備等繁雜技術(shù)，操作簡便，耗 費(fèi)低廉，實(shí)驗(yàn)室條件要求不高，相對省時省力。⑤ 應(yīng)用本方案純化所得的多克隆自身抗體可以作為抗體標(biāo)準(zhǔn)品，用來制作基 于各類免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的自身抗體定量檢測試劑盒，對自身免疫性疾病的診斷、 治療、預(yù)后和療效觀察具有重要價值，因此能創(chuàng)造很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的自身抗體的互補(bǔ)式親和層析純化方法為 首先用互補(bǔ)式親和層析法純化制備自身抗原11) 收集人的目的組織細(xì)胞，用NP-40萃取細(xì)胞膜抗原，再用超聲波粉碎組 織細(xì)胞，超速離心后取上清液，作為粗制抗原A液，12) 用目的組織細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)動物，取抗血清，經(jīng)鹽析法粗提Y免疫球蛋白， 稱免疫血清IgG;同時取未被免疫的該種實(shí)驗(yàn)動物的混合血清，經(jīng)鹽析法粗提Y免疫球蛋白，稱未免疫血清IgG;用正常人混合全血清免疫實(shí)驗(yàn)動物，取抗血清，同樣經(jīng)鹽析法粗提Y免疫球蛋白，稱抗人全血清IgG，13) 用S印harose-4B瓊脂糖凝膠分別與上述的免疫血清IgG、未免疫血清 IgG和抗人全血清IgG偶聯(lián)成免疫親和層析A柱、B柱和C柱，14) 取粗制抗原A液過親和層析A柱，收集與A柱上IgG結(jié)合的抗原物質(zhì)， 濃縮后為粗制抗原B液；再取粗制抗原B液過親和層析B柱，收集不與B柱上 IgG結(jié)合的抗原物質(zhì)，濃縮后為粗制抗原C液；最后取粗制抗原C液過親和層析 C柱，收集不與C柱上IgG結(jié)合的抗原物質(zhì)，濃縮后為精制抗原液；然后用互補(bǔ)式親和層析法純化制備抗自身抗原的多克隆抗體
21) 收集自身抗體陽性的病人血清或者用自身抗原免疫接種的實(shí)驗(yàn)動物的抗 血清；用鹽析法及DEAE52纖維素柱純化IgG型和IgA型免疫球蛋白，并分別稱 為粗制IgG型抗體D液和粗制IgA型抗體D液，22) 收集不含目的自身抗原的健康人的混合血清；收集不含目的抗原的人的 組織細(xì)胞，并制備成組織細(xì)胞裂解液，23) 用S印harose-4B瓊脂糖凝膠分別與上述的精制抗原液、不含目的抗原 的健康人混合血清以及不含目的抗原的人組織細(xì)胞裂解液偶聯(lián)成親和層析D柱、 E柱和F柱，24) 取粗制IgG型或IgA型抗體D液過親和層析D柱，收集與D柱上自身抗 原相結(jié)合的抗體物質(zhì)，濃縮后為粗制IgG型或IgA型抗體E液；后者過親和層析 E柱，收集不與E柱上蛋白相結(jié)合的抗體物質(zhì)，濃縮后為粗制IgG型或IgA型抗 體F液；F液再過親和層析F柱，收集不與F柱上蛋白相結(jié)合的抗體物質(zhì)，濃縮 后為精制自身抗體液IgG型或者IgA型。在步驟13)和歩驟23)用S印harose-4B瓊脂糖凝膠制備親和層析A、 B、 C、 D、 E和F柱時，可用非S印harose-4B的瓊脂糖凝膠代替。以親和層析A、 B、 C、 D柱進(jìn)行互補(bǔ)式親和層析，純化自身抗體；以親和層析 A、 B、 C、 D、 E柱進(jìn)行互補(bǔ)式親和層析，純化自身抗體。取含有目的抗原的人的體液、細(xì)胞裂解液或者組織細(xì)胞懸液，免疫實(shí)驗(yàn)動物 如羊、馬、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、豬等，獲得免疫血清IgG、 IgA或者IgM; 同時從該種實(shí)驗(yàn)動物血清中獲得未免疫血清IgG、 IgA或者IgM;同上制備親和 層析A、 B、 C柱進(jìn)行互補(bǔ)式親和層析，從人體液中、細(xì)胞膜內(nèi)或者細(xì)胞膜表面獲 得精制抗原液；再同上制備親和層析D、 E和F柱進(jìn)行互補(bǔ)式親和層析，獲得精 制的抗人自身抗原的多克隆抗體。下面以抗人精子自身抗體的純化為實(shí)例闡述本發(fā)明方案的
具體實(shí)施例方式① 收集人的目的組織細(xì)胞，用NP-40萃取細(xì)胞膜抗原，再用超聲波粉碎組織 細(xì)胞，超速離心后取上清液，作為粗制抗原A液；② 用目的組織細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)動物，取抗血清，經(jīng)鹽析法粗提Y免疫球蛋白 (IgG)，稱免疫血清IgG;同時取未被免疫的該種實(shí)驗(yàn)動物的混合血清，經(jīng)鹽析法粗提IgG，稱未免疫血清IgG;用正常人全血清免疫實(shí)驗(yàn)動物，取抗血清，同 樣經(jīng)鹽析法粗提IgG，稱抗人全血清IgG;
③ 用S印harose-4B瓊脂糖凝膠分別與上述的免疫血清IgG、未免疫血清 IgG和抗人血清IgG偶聯(lián)成親和層析A柱、B柱和C柱；④ 取粗制抗原A液過親和層析A柱，收集與A柱上IgG結(jié)合的抗原物質(zhì)，濃 縮后為粗制抗原B液；再取粗制抗原B液過親和層析B柱，收集不與B柱上IgG 結(jié)合的抗原物質(zhì)，濃縮后為粗制抗原C液；最后取粗制抗原C液過親和層析C 柱，收集不與C柱上IgG結(jié)合的抗原物質(zhì)，濃縮后為精制抗原液。⑤ 收集自身抗體陽性的病人血清或者用自身抗原免疫接種的實(shí)驗(yàn)動物的抗 血清；用鹽析法及DEAE52纖維素柱純化血清IgG ( Y免疫球蛋白)和血清IgA(a免疫球蛋白)，并分別稱為粗制IgG型抗體D液和粗制IgA型抗體D液；⑥ 收集不含目的自身抗原的健康人的混合血清；收集不含目的抗原的人的組 織細(xì)胞，并制備成組織細(xì)胞裂解液；⑦ 用S印harose-4B瓊脂糖凝膠分別與上述的精制抗原液、不含目的抗原的 健康人混合血清以及不含目的抗原的人組織細(xì)胞裂解液偶聯(lián)成親和層析D柱、E 柱和F柱；⑧ 取粗制IgG型或IgA型抗體D液過親和層析D柱，收集與D柱上自身抗原 相結(jié)合的抗體物質(zhì)，濃縮后為粗制IgG型或IgA型抗體E液；后者過親和層析E 柱，收集不與E柱上蛋白相結(jié)合的抗體物質(zhì)，濃縮后為粗制IgG型或IgA型抗體 F液；F液再過親和層析F柱，收集不與F柱上蛋白相結(jié)合的抗體物質(zhì)，濃縮后 為精制自身抗體液(IgG或者IgA型)。冷凍真空干燥成粉劑后保存?zhèn)溆?。抗精子抗體的互補(bǔ)式親和層析純化方法1.人精子膜抗原的粗提,制備粗制抗原A液收集新鮮正常精液100-500ml，用0. Olmol/L, pH7. 4的Tris-HCl緩沖液反 復(fù)洗滌6次，取精子沉淀加入抗原提取液(Tris 0.061g， EDTA 0. 012g, NaCl 0. 07g, NP-40 50ul，加蒸餾水至100ml,調(diào)pH9. 0)， 4"C磁力攪拌30分鐘，而后另 加4種蛋白酶抑制劑(PMSF，lramol/L; Le叩印tin, 10ug/ml;Aprotinin, 10ug/ml; Iodoacetamide, 1. 8mg/ml),分裝試管，放冰杯中進(jìn)行超聲波粉碎，300uA， lmin/ 次，間隔2min， 12-15次。而后離心1200 rpm/min， 10min，去殘?jiān)槠Ｉ锨?置超速冷凍離心機(jī)，27000g離心50min。上清經(jīng)聚乙二醇濃縮后，PBS溶液透析 48h以上即成粗制抗原A液。BCA法蛋白定量后，分裝置-70't保存?zhèn)溆谩?br> 2. 制備免疫血清IgG、未免疫血清IgG和抗人全血清IgG: 收集多人的新鮮正常精液100ml，用生理鹽水洗滌6次，沉淀用生理鹽水重懸，計(jì)數(shù)精子量，常規(guī)皮下多點(diǎn)注射實(shí)驗(yàn)兔2只，免疫接種3-4次/只，每次間 隔2周，1Xl()6個精子/次。最后一次免疫后第7天取全部兔血清，分裝于-20t 保存?zhèn)溆?；同時取一只未經(jīng)免疫接種的實(shí)驗(yàn)兔，取其全部血清，同上保存?zhèn)溆茫?另外收集數(shù)名未婚少女的全血清數(shù)毫升，與福氏完全佐劑混勻成油包水樣后常規(guī) 皮下多點(diǎn)注射實(shí)驗(yàn)兔2只，3-5次/只，l-2ml/次/只，每次間隔2周。從第二次 免疫開始，混合全血清與福氏不完全佐劑混勻。最后一次免疫后第7天取全部兔 血清，分裝于-20"C保存?zhèn)溆?。取上述用人精子免疫的兔血清、未被免疫的兔血清以及用人全血清免疫的?血清，分別經(jīng)33%硫酸銨鹽析法在4"C常規(guī)提取總IgG型免疫球蛋白，沉淀用PBS 緩沖液溶解后于4t透析過夜，BCA法蛋白定量后置-20"C保存?zhèn)溆茫謩e稱為免 疫血清IgG、未免疫血清IgG和抗人全血清IgG。3. 制備親和層析A柱、B柱和C柱取上述免疫血清IgG、未免疫血清IgG和抗人全血清IgG分別與溴化氰活化 的S印harose-4B偶聯(lián)成親和層析A柱、B柱和C柱。具體方法如下取2-5g溴 化氰活化的S印harose-4B干膠于燒杯中，用lmM HC1溶液溶解，待膨脹后 移至抽濾用的漏斗中，用lmM HC1溶液抽洗15min，接著用100-200ml的HC1溶 液抽洗至液面與瓊脂凝膠面平齊，使凝膠恢復(fù)光澤活性。取上述血清IgG液，融 化后4UC超速離心去除Ig的聚集體，經(jīng)BCA法蛋白定量后用0. lmol/L NaHC03/0. 5mol/L NaCl溶液稀釋IgG液至5mg/L。將等體積的處理后凝膠與等體 積的IgG液混合于燒杯中，置室溫不斷攪拌1-2h。再用5倍于凝膠體積的 0. lmol/L NaHC03/0. 5raol/L NaCl溶液抽洗凝膠，至液面與凝膠面平齊，而后將 凝膠溶解于pH8.0的50mmol/L甘氨酸溶液中，置4°C 16h，以封閉凝膠上剩余的 活性基團(tuán)。于玻璃層析管中裝柱后用5倍于凝膠體積的0. 1M Acetate Buffer(pH4.0)/0.5M NaCl抽洗，再用5倍于凝膠體積的0. 1M Tris-HCl Buffer(pH8.0)/ 0. 5M NaCl抽洗，并重復(fù)二個循環(huán)。最后將偶聯(lián)好的親和層析 柱保存于TSA溶液中，置4"C條件下可保存1-2年。4. 互補(bǔ)式親和層析純化精子膜抗原常規(guī)親和層析的方法見《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(顏?zhàn)臃f、王海林譯，
北京科學(xué)出版社，1998: 382)。本互補(bǔ)式親和層析的主要?dú)i驟為① 取粗制抗原A液過親和層析A柱，收集與A柱上IgG結(jié)合的抗原物質(zhì)取與A柱凝膠等體積的粗制抗原A液(l-10mg/ml)，上柱后室溫作用3h，而后用 以下溶液依次洗滌A柱，流速lml/min，直至流出組分的0D280吸光度<0. 02為 止5倍柱床體積的洗滌緩沖液，pH8.05倍柱床體積的Tris緩沖液，pH8.05倍柱床體積的Tris緩沖液，pH9.0 然后以5倍柱床體積的三乙醇胺溶液洗脫A柱，直至流出組分的0D280吸光度 〈0.02為止，流速lml/min，同時收集洗脫液，并立即用lmol/L Tris-HC1 (Ph6. 7) 緩沖液中和，以免洗脫下來的蛋白質(zhì)在鹼性條件下變性，即將每一個柱床體積 的洗脫液收集于含有0.2體積的lmol/L Tris-HCl(Ph6.7)緩沖液的試管中，聚 乙二醇濃縮后調(diào)pH值至7. 4左右即為粗制抗原B液。② 取粗制抗原B液過親和層析B柱，收集不與B柱上IgG結(jié)合的抗原物質(zhì) 將粗制抗原B液上B柱，室溫作用lh，用5倍柱床體積的洗滌緩沖液(pH8. 0)洗滌B柱，流速lml/min，直至流出組分的0D280吸光度〈0. 02為止；最后用5 倍柱床體積的Tris緩沖液(pH8. 0)洗脫B柱，并同時收集洗脫液，經(jīng)聚乙二醇 濃縮后即為粗制抗原C液。(D最后取粗制抗原C液過親和層析C柱，收集不與C柱上IgG結(jié)合的抗原物 質(zhì)將粗制抗原C液上C柱，室溫作用lh，用5倍柱床體積的洗滌緩沖液(pH8. 0) 洗滌C柱，流速lml/min，直至流出組分的OD280吸光度<0. 02為止；最后用5 倍柱床體積的Tris緩沖液(pH8.0)洗脫C柱，并同時收集洗脫液，經(jīng)聚乙二醇 濃縮為l-5ml，透析24h以上即為精制抗原液。BCA法蛋白定量，SDS-PAGE電泳 鑒定純度及成分，分裝置-70"C保存?zhèn)溆?。TSA保存緩沖液:0.002mol/LTris-Cl; 0. 14mol/LNaCl; 0.025%(W/V) NaN3; lmmol/L EDTA; 20ug/ral慶大霉素，pH8. 0，置40C冰冷洗滌緩沖液0. 01mol/L Tris-CI; 0. 14mol/L NaCl; 0. 025%(W/V) NaN:,; 0. 5%(V/V)Triton X-100; 0. 5%(V/V)脫氧膽酸鈉，pH8. 0，置4"C冰冷Tris緩沖液:50誦ol/LTris-Cl;O. 1%(V/V) TritonX-100: 0. 5mol/L NaCl, pH8. 0或者pH9. 0，置4"C冰冷三乙醇氨緩沖液50謹(jǐn)1/L三乙醇氨；0. l%(V/V)TritonX-100; 0. 15mol/L NaCl， pH11.5，置4('C冰冷5.從抗精子抗體陽性血清中提取總IgG和總IgA:收集抗精子抗體陽性的病人血清或者用人精子免疫接種的兔血清；用鹽析法 結(jié)合DEAE52纖維素柱純化總IgG型和IgA型免疫球蛋白，并分別稱為粗制IgG 型抗體D液和粗制IgA型抗體D液?？侷gG提取取抗精子抗體IgG型陽性患者混合血清或兔抗血清，經(jīng)常規(guī)33%硫酸銨鹽析法粗提IgG型免疫球蛋白，具體步驟見《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(顏?zhàn)臃f、王海林譯，北京科學(xué)出版社，1998: 436)。透析除鹽后分批過DEAE52纖維素層析柱，用0.01MpH7.4PBS緩沖液洗脫，收集洗脫液，經(jīng)聚乙二醇濃縮為2-4mg/ml即為純化的總IgG液，稱為粗制IgG型抗體D液。分裝置-70UC保存?zhèn)溆谩Ｋ宣}析、透析、層析及離心步驟均在4"C進(jìn)行?？侷gA提取取抗精子抗體IgA型陽性患者混合血清或兔抗血清，加等量0. 1M ZnSO，液，調(diào)pH值至7. 0，攪拌lh后離心去沉淀，上清中加等量飽和硫酸銨液，混勻后于4"C過夜，離心去上清后溶沉淀于10% EDTA-Na溶液中，透析除鹽后再分批過DEAE52纖維素層析柱，先用0. 01M pH7. 4 PBS洗脫并棄洗脫液，再換用0. 1M pH6.4 PBS洗脫，所收集的蛋白峰即為IgA。聚乙二醇濃縮后再過S印hadexG200柱，經(jīng)0. 01M pH7. 4 PBS洗脫，第一蛋白峰即為純化的總IgA液，稱為粗制IgA型抗體D液。分裝置-70"C保存?zhèn)溆?。所有鹽析、透析、層析及離 心步驟均在4"C進(jìn)行。6. 制備親和層析D柱、E柱和F柱收集未婚少女混合血清(不含人精子抗原)；收集健康女性的組織細(xì)胞(不 含人精子抗原)，并常規(guī)制成組織細(xì)胞裂解液。取溴化氰活化的S印harose-4B 瓊脂糖凝膠分別與精制精子抗原液、未婚少女混合血清以及健康女性組織細(xì)胞裂 解液等偶聯(lián)成親和層析D柱、E柱和F柱。具體偶聯(lián)步驟與親和層析A、 B、 C柱 制備時的偶聯(lián)步驟相同，只要改換被偶聯(lián)物即可。7. 互補(bǔ)式親和層析純化抗人精子多克隆抗體常規(guī)親和層析的方法見《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(顏?zhàn)臃f、王海林譯， 北京科學(xué)出版社，1998: 382)。本互補(bǔ)式親和層析的主要步驟為①取粗制IgG型(IgA型)抗體D液過親和層析D柱，收集與D柱上精子抗 原結(jié)合的抗體物質(zhì)取與D柱凝膠等體積的抗體D液(1-10mg/ml)，上柱后室溫 200710190243.6說明書第11/11頁作用3h，而后用以下溶液依次洗滌D柱，流速lml/niin，直至流出組分的0D280 吸光度<0. 02為止5倍柱床體積的洗滌緩沖液，pH8. 05倍柱床體積的Tris緩沖液，pH8.05倍柱床體積的Tris緩沖液，pH9. 0 然后以5倍柱床體積的三乙醇胺溶液洗脫D柱，直至流出組分的0D280吸光度 <0. 02為止，流速lml/min，同時收集洗脫液，并立即用lmol/L Tris-HCl (p朋.7) 緩沖液中和，以免洗脫下來的蛋白質(zhì)在鹼性條件下變性，即將每一個柱床體積 的洗脫液收集于含有0.2體積的lmol/L Tris-HCl(pH6.7)緩沖液的試管中，聚 乙二醇濃縮后調(diào)pH值至7. 4左右即為粗制IgG型(IgA型)抗體E液。② 取粗制IgG型(IgA型)抗體E液過親和層析E柱，收集不與E柱上人血清 蛋白結(jié)合的抗體物質(zhì)將抗體E液上E柱，室溫作用lh，用5倍柱床體積的洗 滌緩沖液(pH8. 0)洗滌E柱，流速lml/min，直至流出組分的OD280吸光度 〈0.02為止；最后用5倍柱床體積的Tris緩沖液(pH8.0)洗脫E柱，并同時收 集洗脫液，經(jīng)聚乙二醇濃縮后即為粗制IgG型(IgA型)抗體F液。③ 最后取粗制IgG型(IgA型)抗體F液過親和層析F柱，收集不與F柱上 人組織細(xì)胞蛋白結(jié)合的抗體物質(zhì)將抗體F液上F柱，室溫作用lh，用5倍柱 床體積的洗滌緩沖液(p朋.O)洗滌F柱，流速lml/min，直至流出組分的0D280 吸光度<0. 02為止；最后用5倍柱床體積的Tris緩沖液(pH8. 0)洗脫F柱，并 同時收集洗脫液，經(jīng)聚乙二醇濃縮為1-5ml，透析24h以上即為精制自身抗體液(IgG或者IgA型)。BCA法蛋白定量，SDS-PAGE電泳鑒定純度及成分，冷凍真 空千燥成粉劑后保存?zhèn)溆谩７盅b置-70"C保存?zhèn)溆谩?.精制自身抗體的鑒定和保存取精制抗人精子自身抗體液(IgG或者IgA型)，BCA法進(jìn)行蛋白定量； 10%SDS-PAGE電泳鑒定其抗體的純度；而后做免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測精制抗體與精 子抗原、未婚少女全血清、人組織細(xì)胞裂解液以及牛血清白蛋白等可能在精子抗 體檢測系統(tǒng)中出現(xiàn)的成分的反應(yīng)性，鑒定所純化的自身抗體的特異性；最后冷凍真空干燥成粉劑后保存?zhèn)溆谩?權(quán)利要求
1、一種自身抗體的互補(bǔ)式親和層析純化方法，其特征在于該方法為首先用互補(bǔ)式親和層析法純化制備自身抗原11)收集人的目的組織細(xì)胞，用NP-40萃取細(xì)胞膜抗原，再用超聲波粉碎組織細(xì)胞，超速離心后取上清液，作為粗制抗原A液，12)用目的組織細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)動物，取抗血清，經(jīng)鹽析法粗提γ免疫球蛋白，稱免疫血清IgG；同時取未被免疫的該種實(shí)驗(yàn)動物的混合血清，經(jīng)鹽析法粗提γ免疫球蛋白，稱未免疫血清IgG；用正常人混合全血清免疫實(shí)驗(yàn)動物，取抗血清，同樣經(jīng)鹽析法粗提γ免疫球蛋白，稱抗人全血清IgG，13)用Sepharose-4B瓊脂糖凝膠分別與上述的免疫血清IgG、未免疫血清IgG和抗人全血清IgG偶聯(lián)成免疫親和層析A柱、B柱和C柱，14)取粗制抗原A液過親和層析A柱，收集與A柱上IgG結(jié)合的抗原物質(zhì)，濃縮后為粗制抗原B液；再取粗制抗原B液過親和層析B柱，收集不與B柱上IgG結(jié)合的抗原物質(zhì)，濃縮后為粗制抗原C液；最后取粗制抗原C液過親和層析C柱，收集不與C柱上IgG結(jié)合的抗原物質(zhì)，濃縮后為精制抗原液；然后用互補(bǔ)式親和層析法純化制備抗自身抗原的多克隆抗體21)收集自身抗體陽性的病人血清或者用自身抗原免疫接種的實(shí)驗(yàn)動物的抗血清；用鹽析法及DEAE52纖維素柱純化IgG型和IgA型免疫球蛋白，并分別稱為粗制IgG型抗體D液和粗制IgA型抗體D液，22)收集不含目的自身抗原的健康人的混合血清；收集不含目的抗原的人的組織細(xì)胞，并制備成組織細(xì)胞裂解液，23)用Sepharose-4B瓊脂糖凝膠分別與上述的精制抗原液、不含目的抗原的健康人混合血清以及不含目的抗原的人組織細(xì)胞裂解液偶聯(lián)成親和層析D柱、E柱和F柱，24)取粗制IgG型或IgA型抗體D液過親和層析D柱，收集與D柱上自身抗原相結(jié)合的抗體物質(zhì)，濃縮后為粗制IgG型或IgA型抗體E液；后者過親和層析E柱，收集不與E柱上蛋白相結(jié)合的抗體物質(zhì)，濃縮后為粗制IgG型或IgA型抗體F液；F液再過親和層析F柱，收集不與F柱上蛋白相結(jié)合的抗體物質(zhì)，濃縮后為精制自身抗體液IgG型或者IgA型。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的自身抗體的互補(bǔ)式親和層析純化方法，其特征在 于在步驟13)和步驟23)用S印harose-4B瓊脂糖凝膠制備親和層析A、 B、 C、 D、 E和F柱時，用非S印harose-4B的瓊脂糖凝膠代替。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的自身抗體的互補(bǔ)式親和層析純化方法，其特征在 于在步驟24)用親和層析D、 E和F柱聯(lián)合進(jìn)行互補(bǔ)式親和層析時，只用D柱 或者用D柱和E柱聯(lián)合。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的自身抗體的互補(bǔ)式親和層析純化方法，其特征在 于在步驟ll)時不是收集目的組織細(xì)胞，而是收取含有目的抗原的人的體液， 繼而不用NP-40萃取細(xì)胞膜抗原和超聲波粉碎組織細(xì)胞，直接用含有目的抗原的 人的體液免疫實(shí)驗(yàn)動物。
全文摘要
自身抗體的互補(bǔ)式親和層析純化方法，能高度特異性地從人血清或免疫動物血清中提取純化抗組織細(xì)胞自身抗原的多克隆抗體。對于組織細(xì)胞中因組成成分較多而不適宜于用基因工程表達(dá)和單克隆抗體親和層析獲得的自身抗原，其對應(yīng)的自身抗體也種類眾多，適合于用本方案進(jìn)行多克隆抗體的純化。所獲得的高度特異性自身抗體可以作為抗體標(biāo)準(zhǔn)品，用來制作基于各類免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的自身抗體定量檢測試劑盒，對自身免疫性疾病的診斷、治療、預(yù)后和療效觀察具有重要價值。在純化抗人精子抗體的實(shí)踐中，該方法科學(xué)可行，耗費(fèi)低廉，所得免源性抗人精子多克隆抗體具有極高的純度和特異性。
文檔編號G01N33/531GK101158681SQ20071019024
公開日2008年4月9日 申請日期2007年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月23日
發(fā)明者張建瓊, 沈傳來, 維 謝 申請人:東南大學(xué)