專利名稱：酒類中氨基甲酸乙酯的高靈敏時間分辨熒光免疫分析方法
酒類中氨基甲酸乙酯的高靈敏時間分辨熒光免疫分析方法技術領域酒類中氨基甲酸乙酯的高靈敏時間分辨熒光免疫分析方法，屬于時間分辨 熒光免疫分析技術領域。
技術背景氨基甲酸乙酉旨(英文名稱為ethyl carbamate, carbarnic acid ethyl ester， ethyl urethane，以下簡稱EC)或稱為尿烷(urethane)，是一種多位點強致癌物質。經 研究表明，氨基甲酸乙酯進入人類身體以后能夠誘導C^+調控的DNA損傷，可 導致肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等疾病。1976年Ough用實驗證明葡萄酒 及其它發(fā)酵飲料中含有氨基甲酸乙酯，引起釀酒界高度重視。釀造酒中的氨基 甲酸乙酯主要由乙醇與酒中由微生物代謝而產生的尿素胺解而形成。由于氨基甲酸乙酯在酒類中的普遍性和致癌性，各國學者先后建立了多種 檢驗方法，涉及氣相色譜質譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass sepectrum， GC-MS)， 高效液相色譜-質譜聯(lián)用法(high performance liquid chromatogmphy-mass sepectrum HPLC-MS)，但在食品痕量物質檢出中較為常見 的免疫學方法卻一直沒有人涉及，本發(fā)明是第一次使用免疫學檢測方法檢測氨 基甲酸乙酯，采用時間分辨熒光免疫分析法(以下簡稱TRFIA)建立一種操作簡 便，成本較低的新型檢測方法。TRFIA是超微量檢測領域中一項新興的檢測技 術，它是利用免疫反應的高度特異性和標記示蹤物的高度靈敏性相結合而建立 的一類微量物質檢測技術，以三價稀土離子，如Ei^+、 Tb3+、 SmS+等為熒光標志 物，其熒光不僅強度高，而且熒光衰變時間長，利用延緩測量時間，等待測樣 品中短壽命的自然熒光衰變后再測稀土離子的熒光，可消除自然熒光的干擾， 再利用具有雙功能基團結構的螯合劑,其一端和鑭系元素結合,另一端和抗體分 子上的自由氨基聯(lián)接制成標記抗體，它與待測樣品中的抗原結合成免疫復合物。 檢測時，加入可使原來熒光增強100萬倍的增強液，用時間分辨熒光儀測定其 熒光強度，根據氨基甲酸乙酯的TRFIA標準抑制曲線即可確定樣品中氨基甲酸 乙酯的量，實現(xiàn)氨基甲酸乙酯的低成本檢測。 發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種酒類中氨基甲酸乙酯的高靈敏時間分辨熒光免疫 分析方法，建立一種操作簡便，成本較低的新型檢測方法。本發(fā)明的技術方案酒類中氨基甲酸乙酯的時間分辨熒光免疫分析方法， 以氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，獲取氨基甲酸乙酯多
克隆抗體，以氨基甲酸乙酯-卵清蛋白人工抗原包被96孔板為固相抗原，與氨基 甲酸乙酯標準或樣品中的氨基甲酸乙酯共同競爭多抗；用Ei^+標記的羊抗兔抗 體進行示蹤；(1) 氨基甲酸乙酯標準的配制從氨基甲酸乙酯純品中稀釋，氨基甲酸乙酯 濃度分別為0、 0.01、 0.05、 0.2、 1.0、 5和20 pg/mL，稀釋液為pH7.4、 10mmol/L的PBS;(2) El^-羊抗兔抗體標準的配制El^-羊抗兔抗體用分析緩沖液稀釋為10jxg/mL;(3) 分析緩沖液含8 mmol/L NaCl、 0.1%牛血清蛋白、50limol/L二乙烯 三胺五乙酸、0.1 ml/LTween-80和0.1%NaN3的pH 7.8 Tris-HCl緩沖液；(4) 封閉液含0.2。/。明膠的pH7.2Tris-HCl緩沖液；(5) 洗漆液0.1 ml/L Tween-20的pH 7.8 Tris-HCl緩沖液；(6) 增強液含15 limol/LP-二酮體、50 pmol/L三辛基氧化磷、0.1% TritonX-lOO、 pH3. 2的醋酸和鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液；(7) 半抗原的制備以尿素和乙二醇為起始原料，胺解得到中間產物氨基甲 ?；掖?，然后對其進行氧化，得到氨基甲?；宜幔礊榘被姿嵋阴グ肟?原；以含10 mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸的甲醇為流動相進行分析純化，使用 LC-MS定性分析；(8) 人工抗原的合成采用碳二亞胺偶合法分別制備免疫所用的氨基甲酸乙 酯-牛血清蛋白人工抗原，固相篩選所用的氨基甲酸乙酯-卵清蛋白人工抗原，制 備方法如下；將干燥后的2.5mg氨基甲酸乙酯半抗原振蕩溶解于O.lmL的ddH20，調節(jié) pH4.7-7.2，振蕩混合0.2mL10mg/mL牛血清蛋白或卵清蛋白，加入10mg/mL 碳二亞胺溶液0.1mL ,偶聯(lián)2h; Superdex G-25凝膠柱，以生理鹽水為流動相分 離，收集在280nm處有吸收峰的組分，即氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白或氨基甲酸 乙酯-卵清蛋白，凍干保藏；氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白用作免疫抗原，氨基甲酸 乙酯-卵清蛋白用作包被抗原；(9) 微孔板的包被將氨基甲酸乙酯-卵清蛋白用pH 9.6 100 mmol/L Na2C03-NaHC03緩沖液稀釋至5 pg/mL的包被液，96孔微孔板各孔加100 ^L， 4'C過夜，棄去包被液，用ddH20沖洗兩次，力Q 200 pL封閉液封閉，靜置2 h， 棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-2(TC冷凍保存；(10) 檢測步驟間接競爭氨基甲酸乙酯的時間分辨熒光免疫檢測步驟取 氨基甲酸乙酯-卵清蛋白板條，加入50 )Lil/孔的氨基甲酸乙酯標準或處理好的樣品 到各自的微孔中，加用分析緩沖液以l: 5000稀釋的抗氨基甲酸乙酯多抗50p1/ 孔，37。C振蕩l小時，用洗滌液洗三次，再加用分析緩沖液稀釋的10^1§/11^5113+-
羊抗兔抗體100pl/孔，37'C振蕩0.5小時，用洗滌液洗六次，力B200 pl/孔的增強 液振蕩5分鐘后，用時間分辨熒光免疫儀測定CPS值，繪制出抑制百分率對氨基 甲酸乙酯濃度pg/mL的標準曲線，從標準曲線計算樣品中的氨基甲酸乙酯含量。本發(fā)明的有益效果高特異性抗體的制備是利用免疫學方法進行分析的最 關鍵因素。氨基甲酸乙酯是小分子，本身沒有免疫活性，也沒有與載體蛋白偶 聯(lián)的活性基團。本研究合成的氨基甲酸乙酯的結構類似物具有不同長度碳鏈的 羧基，并且使酰胺基團充分暴露，具備了氨基甲酸乙酯抗原的特點。但半抗原 沒有特征光譜吸收峰，且經樹脂柱純化后在HPLC-MS質譜圖中顯示除目標產物 外沒有m/z〉 100，但在核磁共振檢測后發(fā)現(xiàn)仍含有大量雜質無法對其進行結構 測定，僅能通過經HPLC-MS確證目標產物的存在，但不影響下一步的分析制備。通過碳二亞胺法將半抗原與載體蛋白(牛血清蛋白、卵清蛋白)偶聯(lián)制備 了兩種氨基甲酸乙酯的人工抗原免疫抗原氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白和包被抗 原氨基甲酸乙酯-卵清蛋白。通過TRFIA鑒定比較牛血清蛋白，氨基甲酸乙酯-牛 血清蛋白與兔抗牛IgG結合率發(fā)現(xiàn)，氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白較牛血清蛋白熒光 計數(shù)低17.2%，說明表面位點由于偶聯(lián)而產生差異，在得到氨基甲酸乙酯抗體后， 對抗原偶聯(lián)再次進行確定，說明偶連效果較好。免疫抗原經免疫兔子后獲得了氨基甲酸乙酯抗體。抗血清對4種結構相似物 的交叉反應率均小于0.1%，但對黃酒中多種蛋白質特異性及酒精耐受性不佳， 筆者通過添加甲醇處理除去蛋白質和多糖等物質，取得較好的效果。根據氨基甲酸乙酯的TRFIA標準抑制曲線，比較計數(shù)為0濃度點計數(shù)的50% 時的效應點對應的濃度值為5.47士0.319 pg/mL，能夠滿足測定處理后樣品酒中氨 基甲酸乙酯殘留的需要。


圖l氨基甲酸乙酯半抗原的合成路線圖 圖2抗體稀釋度曲線圖3間接競爭抑制標準曲線(B， Bo分別為樣品、空白的熒光測定值) 圖4檢測特異性曲線圖 圖5稀釋倍數(shù)與測定值相關圖具體實施方式
實施例l 藥品氨基甲酸乙酯、卵清蛋白、牛血清蛋白為Sigma產品；超純水由本室采用 Bamstead公司的超純水器(D7033)制備；親和層析純化的羊抗兔IgG為洛陽華 美生物工程公司產品；96孔微孔板為Nunc公司產品；Eu3+羊抗兔IgG、洗滌液和 增強液為江蘇省原子醫(yī)學研究所產品；其他試劑均為國產分析純。
主要試劑的配制氨基甲酸乙酯標準的配制從氨基甲酸乙酯純品中稀釋氨基甲酸乙酯，濃 度分別為0、 0.01、 0.05、 0.2 、 1 .0、 5和20 pg/mL，稀釋液為pH7.4, 10mmol/L 的PBS。分析緩沖液含8mmoI/LNaCl、 0.1%牛血清蛋白、50 pmol/L 二乙烯三胺 五乙酸、0.1 ml/L Tween-80和0.1% NaN3的pH7.8 Tris-HCl緩沖液。 封閉液含0.2%明膠的pH 7.2的Tris-HCl緩沖液。 洗滌液0.1 ml/L Tween-20 pH 7.8 Tris-HCl緩沖液。增強液含15 pmol/LP-二酮體、50 |nmol/L三辛基氧化磷、0.1% TritonX-100、 pH 3. 2的醋酸和鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液。 儀器全自動TRFIA檢測儀(AutoDELFIA-1235)為EG&G-Wallac產品。方法1、 半抗原的制備氨基甲酸乙酯是小分子本身沒有免疫原性，也沒有與載 體偶聯(lián)的活性基團。本發(fā)明以尿素和乙二醇為起始原料，胺解得到中間產物， 然后對其進行氧化，得到氨基甲酸乙酯半抗原，合成路線如圖l所示。以含io mmol/L乙酸銨、0. 1%甲酸的甲醇為流動相進行分析純化，使用LC-MS定性分析。首先使用HPLC-MS對胺解以及氧化后的產物分別進行純化分析，結果胺解 后有兩個產物，分子量分別為105.5和87.1，前者與理論值105.1相符為目標產物， 后者可能是脫水產生的副產物，氧化后的產物分子量119.8與理論值105.1， 119.1 基本相符，轉化率50.6%，洗脫液無副產物峰。2、 人工抗原的合成氨基甲酸乙酯是典型的半抗原，需與大分子物質結合 形成人工抗原后才有免疫原性，采用碳二亞胺偶合法制備免疫時采用的氨基甲 酸乙酯-牛血清蛋白人工抗原，產生的抗體要通過固相抗原篩選，由于氨基甲酸 乙酯是小分子化合物，難以直接吸附到酶標板上，因此篩選時還需制備另一種 人工抗原氨基甲酸乙酯-卵清蛋白作為固相篩選抗原。將干燥后的2.5mg氨基甲酸乙酯半抗原振蕩溶解于0.1mL的ddH20，調節(jié) pH在4.7到7.2之間，振蕩混合0.2mL10mg/mL牛血清蛋白(卵清蛋白)；加 入10mg/mL碳二亞胺溶液0.1mL，偶聯(lián)2h; Superdex G-25凝膠柱，以生理鹽 水為流動相分離；收集在280nm處有吸收峰組分，即氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白 (氨基甲酸乙酯-卵清蛋白)，凍干保藏。3、 固相抗原制備將氨基甲酸乙酯-卵清蛋白用100 mmol/LNa2COrNaHC03 pH 9.6緩沖液稀釋至5 mg/L的包被液，96孔微孔板各孔加100 (0.5 pg氨基 甲酸乙酯-牛血清蛋白)，4"過夜。棄去包被液，沖洗兩次，加200nL封閉液封 閉，靜置2h。棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20'C冷凍保存。
4、 人工抗原的鑒定取氨基甲酸乙酯-卵清蛋白(卵清蛋白)包被96孔板， 加入50 pl/孔的氨基甲酸乙酯標準或緩沖液到各自的微孔中，加用分析緩沖液以 1: 5000稀釋的抗氨基甲酸乙酯多抗50^1/孔，37'C振蕩1小時，用洗滌液洗三次。 再加用分析緩沖液稀釋的10^^/11^￡113+-羊抗兔抗體100 |nl/ L， 37'C振蕩0.5小時， 用洗滌液洗六次，力n200pl/孔的增強液振蕩5分鐘后，用TRFIA測定，抑制率為 84.3%。從而定性地確定氨基甲酸乙酯已與載體蛋白偶聯(lián)。5、 抗體的制備抗體血清的制備參照文獻以氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白為免 疫源。選取4周齡、體重約2kg的健康的雄性新西蘭大白兔,以200ng/kg的劑量 分4次免疫動物，基礎免疫用含弗氏完全佐劑的人工抗原皮下或皮內多點注射， 此后每間隔1周,用含弗氏不完全佐劑的人工抗原加強免疫，前后共4次，每次加強 免疫后采血鑒定抗體效價情況，末次免疫后10天，從兔子心臟采血，分離血清稀釋 后分裝、凍干備用。6、 樣品處理在25mL模擬酒樣(氨基甲酸乙酯含量50ppb，尿素含量lg/mL， 酒精含量10%)中添力卩100mL的甲醇，離心(1400rpm)后取上清，旋轉蒸發(fā)致含 有少量水，定容致5mL，添加乙酸乙酯萃取，取有機層再次旋蒸，力卩5mLdH20 復溶后冷凍干燥，再次使用lmLdH20復溶。7、 抗體特性鑒定抗氨基甲酸乙酯兔抗體的稀釋實驗在氨基甲酸乙酯-卵清蛋白板條加分析 緩沖液稀釋的不同濃度的抗氨基甲酸乙酯兔抗體，結果見圖3,抑制率為最高濃 度(l : IOO倍稀釋)血清結合率的30%-50%時對應的稀釋度約為i: 4000—1:8000倍，因此合適的工作濃度應在此范圍內，我們選擇選擇 i : 5000倍。標準曲線的建立間接競爭氨基甲酸乙酯-TRFIA的結果經log-logit函數(shù)數(shù) 據處理所得的標準曲線見圖3。 一—靈敏度計算8組標準曲線零濃度點計數(shù)的平均值(^)和標準差(SD)， 以^-2SD，從標準曲線中找到對應濃度。氨基甲酸乙酯-TRFIA的考核(1) 穩(wěn)定性比較計數(shù)為0濃度點計數(shù)的20%、 50%、 80%時的效應點對應 的濃度(ED20、 ED50、 ED80)，根據長期多次測定判斷劑量反應曲線的位置漂 移來考核方法的穩(wěn)定性。以零劑量點發(fā)光值均值減2SD后的發(fā)光值在標準曲線 上得到的相應值為檢測的靈敏度，間接競爭氨基甲酸乙酯-TRFIA的靈敏度為 3.26pg/mL。氨基甲酸乙酯-TRFIA的效應點值ED20、 ED50、 ED80分別為 18.6±1.63嗎/L、 5.47士0.319iig/L和1.071±0.083 pg/L。方法的穩(wěn)定性好。(2) 特異性將氨基甲酸乙酯的結構類似物甲氨，刀豆氨酸分別配成不同濃度的溶液作為被測樣品，檢測抗體與被測物質的交叉反應程度。采用間接競爭
氨基甲酸乙酯-TRFIA檢測如圖4， 50。/。抑制率時甲胺等的濃度是均在150^ig/mL 以上說明抗體的特異性良好。(3) 方法的健全性樣品檢測和方法確證，分別用TRFIA方法和HPLC方 法檢測發(fā)處理后的酒液樣品，比較檢測結果。將從樣品中提取的溶液對半稀釋三次，用氨基甲酸乙酯-TRFIA檢測，與標 準曲線比較，見圖5。圖示測定結果呈線性關系，表示此方法具有良好的健全性。(4) 回收率對每克樣品分別加入l 、 2 、 4、 8和16pg不同量的氨基甲酸 乙酯，然后按檢測步驟測量，計算實測值與理論值比值。間接氨基甲酸乙酯-TRFIA在0-20pg/L之間的批內和批間變異(CV)分別為 7.2%和14.6%，都符合批內CV〈10n/。和批間CV〈20。/。的要求，5個添加樣品的平均 回收率為92.4%,見表l。表l.間接TRFIA測定樣品中氨基甲酸乙酯的回收率樣品測定氨基甲酸乙酯間接氨基甲酸乙酯間接氨基甲酸乙酯-TRFIA次數(shù)添加量Og/g)-TRFIA測定值Oig/g)測定的回收率(％)1506.8-217.7494.328.84102.145410.1683.955814.85雨.6651216.8483.78、檢測步驟間接競爭氨基甲酸乙酯-TRFIA檢測步驟取氨基甲酸乙酯-卵清蛋白板條，加入50 pl/孔的氨基甲酸乙酯標準或處理好的樣品到各自的微孔 中，參照人工抗原的鑒定步驟用TRFIA測定，并繪制出抑制百分率對氨基甲酸 乙酯濃度(pg/mL)的標準曲線，再從標準曲線計算樣品中的氨基甲酸乙酯含量。 全部過程可在AutoDELFIA-1235上自動完成，軟件設置由江蘇省原子醫(yī)學 研究所編制。
權利要求
1、酒類中氨基甲酸乙酯的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征是以氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，獲取氨基甲酸乙酯多克隆抗體，以氨基甲酸乙酯-卵清蛋白人工抗原包被96孔板為固相抗原，與氨基甲酸乙酯標準或樣品中的氨基甲酸乙酯共同競爭多抗；用Eu3+標記的羊抗兔抗體進行示蹤；(1)氨基甲酸乙酯標準的配制從氨基甲酸乙酯純品中稀釋，氨基甲酸乙酯濃度分別為0、0.01、0.05、0.2、1.0、5和20μg/mL，稀釋液為pH7.4、10mmol/L的PBS；(2)Eu3+-羊抗兔抗體標準的配制Eu3+-羊抗兔抗體用分析緩沖液稀釋為10μg/mL；(3)分析緩沖液含8mmol/L NaCl、0.1％牛血清蛋白、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3的pH7.8Tris-HCl緩沖液；(4)封閉液含0.2％明膠的pH7.2Tris-HCl緩沖液；(5)洗滌液0.1ml/L Tween-20的pH7.8Tris-HCl緩沖液；(6)增強液含15μmol/Lβ-二酮體、50μmol/L三辛基氧化磷、0.1％TritonX-100、pH3.2的醋酸和鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液；(7)半抗原的制備以尿素和乙二醇為起始原料，胺解得到中間產物氨基甲?；掖迹缓髮ζ溥M行氧化，得到氨基甲酰基乙酸，即為氨基甲酸乙酯半抗原；以含10mmol/L乙酸銨、0.1％甲酸的甲醇為流動相進行分析純化，使用LC-MS定性分析；(8)人工抗原的合成采用碳二亞胺偶合法分別制備免疫所用的氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白人工抗原，固相篩選所用的氨基甲酸乙酯-卵清蛋白人工抗原，制備方法如下；將干燥后的2.5mg氨基甲酸乙酯半抗原振蕩溶解于0.1mL的ddH2O，調節(jié)pH4.7-7.2，振蕩混合0.2mL10mg/mL牛血清蛋白或卵清蛋白，加入10mg/mL碳二亞胺溶液0.1mL，偶聯(lián)2h；Superdex G-25凝膠柱，以生理鹽水為流動相分離，收集在280nm處有吸收峰的組分，即氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白或氨基甲酸乙酯-卵清蛋白，凍干保藏；氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白用作免疫抗原，氨基甲酸乙酯-卵清蛋白用作包被抗原；(9)微孔板的包被將氨基甲酸乙酯-卵清蛋白用pH9.6100mmol/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液稀釋至5μg/mL的包被液，96孔微孔板各孔加100μL，4℃過夜，棄去包被液，用ddH2O沖洗兩次，加200μL封閉液封閉，靜置2h，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20℃冷凍保存；(10)檢測步驟間接競爭氨基甲酸乙酯的時間分辨熒光免疫檢測步驟取氨基甲酸乙酯-卵清蛋白板條，加入50μl/孔的氨基甲酸乙酯標準或處理好的樣品到各自的微孔中，加用分析緩沖液以1∶5000稀釋的抗氨基甲酸乙酯多抗50μl/孔，37℃振蕩1小時，用洗滌液洗三次，再加用分析緩沖液稀釋的10μg/mL Eu3+-羊抗兔抗體100μl/孔，37℃振蕩0.5小時，用洗滌液洗六次，加200μl/孔的增強液振蕩5分鐘后，用時間分辨熒光免疫儀測定CPS值，并繪制出抑制百分率對氨基甲酸乙酯濃度μg/mL的標準曲線，再從標準曲線計算樣品中的氨基甲酸乙酯含量。
全文摘要
酒類中氨基甲酸乙酯的高靈敏時間分辨熒光免疫分析方法，屬于時間分辨熒光免疫分析技術領域。本發(fā)明以氨基甲酸乙酯-牛血清蛋白作為免疫抗原獲得多克隆抗體，以氨基甲酸乙酯-卵清蛋白人工抗原包被96孔板為固相抗原，與氨基甲酸乙酯標準或樣品中的氨基甲酸乙酯共同競爭多抗；用Eu³⁺標記的羊抗兔抗體進行示蹤；本發(fā)明方法的靈敏度為3.26μg/L，批內和批間變異分別為3.3％和6.7％，平均回收率為92.4％，與甲氨、刀豆氨酸等的交叉反應率低于10％。不同時間進行的氨基甲酸乙酯-TRFIA，0濃度點計數(shù)的20％、50％、80％時的效應點對應的濃度(ED20、ED50、ED80)分別為18.6±1.63μg/ml、5.47±0.319μg/ml和1.071±0.083μg/ml。檢測范圍為1μg/ml-20μg/ml。
文檔編號G01N33/543GK101162231SQ200710190350
公開日2008年4月16日 申請日期2007年11月16日 優(yōu)先權日2007年11月16日
發(fā)明者巖 徐, 曄 瞿 申請人:江南大學