專利名稱：：對有機磷農藥抗性野桑蠶種群的檢驗方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種野桑蠶的研究方法，具體涉及一種野桑蠶抗藥性的研究方法。
背景技術：
：野桑蠶(50附6戸mflrfflWflM.)屬于鱗翅目昆蟲，和家蠶具有共同的起源，棲息在桑樹上，取食桑樹的葉片，是危害桑樹的主要害蟲之一。由于長期的自然選擇，現(xiàn)有的野桑蠶對農藥的抗性遠高于家蠶。由于其發(fā)生規(guī)律和家蠶的蠶期具有同步性，蠶期使用農藥防治野桑蠶，桑葉殘留的農藥會造成家蠶的農藥中毒，給野桑蠶的防治帶來一定的困難。目前有機磷類農藥是防治野桑蠶的主要農藥之一，伴隨著有機磷農藥的大量使用，野桑蠶在有機磷農藥的壓力選擇下，其對有機磷農藥有抗性有來斷增強的趨勢，我國的主要蠶區(qū)都報道過有對有機磷農藥抗性野桑蠶種群的出現(xiàn)，嚴重影響蠶桑的正常生產。對野桑蠶種群的有機磷農藥抗性進行檢驗，鑒定其為敏感種群和抗性種群，對于科學防治方法的確立，具有重要意義。敏感種群可采用常規(guī)濃度的防治方法，避免過量使用農藥，以減少農藥對環(huán)境的危害；抗性種群可采用農藥品種替換和暫停詞養(yǎng)家蠶集中防治相結合的方法，以提高防治效果。目前，我國對野桑蠶種群的有機磷農藥抗性研究開展的較少，通常使用的方法是把野桑蠶采集后，集中添毒進行試驗。由于采用家蠶的飼養(yǎng)方法很難飼養(yǎng)野桑蠶，另外，室內長期飼養(yǎng)的野桑蠶的生理機能較野外的差，不具有客觀的代表性，研究發(fā)明針對野外生存的野桑蠶種群的有機磷抗性檢驗方法，對于解決野桑蠶的防治難題具有重要的現(xiàn)實意義。
發(fā)明內容本發(fā)明目的是提供一種快速、經濟、方便、靈敏度高的對有機磷農藥抗性野桑蠶種群的檢驗方法。為達到上述目的，本發(fā)明通過野桑蠶血液里的酯酶和底物的反應，利用濾紙的顯色來檢驗野桑蠶種群對有機磷農藥的敏感性。本發(fā)明采用的技術方案是一種對有機磷農藥抗性野桑蠶種群的檢驗方法，包括下列步驟(1)材料的準備，包括，將e-乙酸萘酯溶解在丙酮中，濃度為2-3mg/mL，然后加入25倍體積的pH7.0的磷酸鹽緩沖液，再用蒸餾水稀釋至2倍，配制成底物溶液；在桑田隨機收集野桑蠶5齡幼蟲至少100頭，保存在38r培養(yǎng)冰箱中備用；(2)試驗取1頭上述野桑蠶5齡幼蟲，用剪刀剪去幼蟲的腹足，取其血液滴于準備好的濾紙上；吸有血液的濾紙浸入37'C的底物溶液中至少15秒，然后放于玻璃板上，在濾紙上放0.2-0.3mL0.4%的固蘭B鹽，1分鐘后，力H0.2-0.3mL的三氯乙酸；(3)顯色分析濾紙吸收酶液的部分及四周，反應顏色略帶紫色的個體為對有機磷抗性個體，反應顏色不明顯的個體為敏感個體；(4)重復步驟(2)、(3),記錄抗性個體和敏感個體的數(shù)量。上述步驟(4)中，根據(jù)所記錄的抗性個體和敏感個體的數(shù)量，得出對有機磷農藥抗性的比率為對有機磷農藥抗性的比率(％)=M八^^tyi楊且x腿抗性個體數(shù)量+敏感個體數(shù)量上述技術方案中，所述的濾紙選用色譜分析濾紙，應符合下列要求質地均勻平整，具有一定機械強度，必須不含會影響色譜效果的雜質，也不應與所用顯色劑起作用，以免影響分離和鑒別效果。上述技術方案中，所述底物溶液為隨配隨用，不適合于長時間保存。上述技術方案中，試驗材料的取樣要隨機分布，以保證實驗結果具有代表性。上述技術方案中，滴有血液的濾紙應盡快浸入底物溶液里，以免酚氧化酶的氧化作用，影響顯色的觀察效果。本發(fā)明的技術方案的工作原理為野桑蠶的血液中含有一定量的酯酶(包括羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶)，抗性個體的酯酶活性相對較強，敏感個體的酯酶活性較弱。酯酶可以和底物e-乙酸萘酯反應，其產物可以和固蘭B鹽發(fā)生顯色反應，在酸性條件下帶紫色的為抗性個體，不明顯的為敏感個體。由于上述技術方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有下列優(yōu)點1.本發(fā)明檢驗方法的對象為野外害蟲，具有客觀的代表性；2.本發(fā)明檢驗方法采用幼蟲血液與底物溶液反應，并用顯色劑進行顯色來判斷野桑蠶對農藥的抗性，操作方便，檢驗成本低，特別適合于現(xiàn)場檢驗。3.本檢驗方法的靈敏度高，檢驗快速。具體實施方式下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述實施例一一種對有機磷農藥抗性野桑蠶種群的檢驗方法，通過野桑蠶血液里的酯酶和底物的反應，利用濾紙的顯色來檢驗野桑蠶種群對有機磷農藥的敏感性。其中，所述的選用色譜分析濾紙應質地均勻平整，具有一定機械強度，必須不含會影響色譜效果的雜質，也不應與所用顯色劑起作用，以免影響分離和鑒別效果，使用前剪成2cmX2cm的正方形備用。試驗樣本的采集時應注意隨機選取樣本，樣本個數(shù)在100頭以上，以提高檢驗結果的代表性；要注意不選取生病的野桑蠶，以免影響檢驗結果。檢驗程序包括(1)底物溶液的配制e-乙酸萘酯溶解在丙酮中，濃度為2.5mg/mL，取2mL然后加入50mLpH7.0的磷酸鹽緩沖液，再用蒸餾水稀釋至104mL，配制成底物溶液；(2)試驗材料的收集在桑田隨機收集野桑蠶5齡幼蟲IOO頭以上保存在5。C培養(yǎng)箱中。(3)試驗用剪刀剪去幼蟲的腹足，取其血液lOOixL滴于準備好的濾紙上，吸有酶液的濾紙浸入37t:的底物溶液中15秒，然后放于玻璃板上，在濾紙上放0.3mL0.4。/。的固蘭B鹽，l分鐘后，加0.2mL的三氯乙酸。(4)顯色分析濾紙吸收酶液的部分及四周，反應顏色略帶紫色的個體為對有機磷抗性個體，反應顏色不明顯的個體為敏感個體。分別取不同種群的野桑蠶進行上述檢測，測試對農藥抗性的比率，結果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>采用本檢驗方法，可實現(xiàn)經濟、快速、準確檢驗一個地區(qū)野桑蠶對有機磷農藥的抗性情況，對于有針對性地選擇防治方法，提高野桑蠶的防治效果，具有重要意義。權利要求1.一種對有機磷農藥抗性野桑蠶種群的檢驗方法，其特征在于，包括下列步驟(1)材料的準備，包括，將β-乙酸萘酯溶解在丙酮中，濃度為2-3mg/mL，然后加入25倍體積的pH7.0的磷酸鹽緩沖液，再用蒸餾水稀釋至2倍，配制成底物溶液；在桑田隨機收集野桑蠶5齡幼蟲至少100頭，保存在3～8℃培養(yǎng)冰箱中備用；(2)試驗取1頭上述野桑蠶5齡幼蟲，用剪刀剪去幼蟲的腹足，取其血液滴于準備好的濾紙上；吸有血液的濾紙浸入37℃的底物溶液中至少15秒，然后放于玻璃板上，在濾紙上放0.2-0.3mL0.4％的固蘭B鹽，1分鐘后，加0.2-0.3mL的三氯乙酸；(3)顯色分析濾紙吸收酶液的部分及四周，反應顏色略帶紫色的個體為對有機磷抗性個體，反應顏色不明顯的個體為敏感個體；(4)重復步驟(2)、(3)，記錄抗性個體和敏感個體的數(shù)量。2.根據(jù)權利要求1所述的有機磷農藥抗性野桑蠶種群的檢驗方法，其特征在于上述步驟(4)中，根據(jù)所記錄的抗性個體和敏感個體的數(shù)量，得出對有機磷農藥抗性的比率為全文摘要本發(fā)明公開了一種對有機磷農藥抗性野桑蠶種群的檢驗方法，其特征在于首先提取待檢野桑蠶的血液，使血液與含有β-乙酸萘酯的底物溶液反應，再用固蘭B鹽進行顯色分析，當反應顏色略帶紫色時，判定該野桑蠶個體對有機磷農藥有抗性。本發(fā)明用于對野外害蟲的抗性進行檢驗，具有客觀的代表性；其操作方便，檢驗成本低，靈敏度高，檢驗快速，特別適合于現(xiàn)場檢驗。文檔編號G01N33/50GK101178400SQ200710190620公開日2008年5月14日申請日期2007年11月20日優(yōu)先權日2007年11月20日發(fā)明者衛(wèi)正國,兵李,沈衛(wèi)德,東王,許雅香,貢成良,趙華強,陳玉華申請人:蘇州大學