專利名稱：5’-核苷酸酶診斷試劑盒及5’-核苷酸酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種5，-核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定5'-核苷酸酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學研究表明，5'-核苷酸酶(5NT)增高主要見于阻塞性黃膽，也可見于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁性肝硬化和慢性肝炎時，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時5NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因為5'-核苷酸酶活性無生理性升高，對于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測定5'-核苷酸酶的活性對于疾病的診斷具有重要意義。
5'-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學強酸測磷法(1925年)。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用同位素底物測試法，方法為5'-核苷酸酶作用于H3-dlMP，終止反應后，通過離子交換層析柱分析結(jié)果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5'-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生無機磷，再用化學強酸法分析無機磷含量得以計算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法復雜還有同位素污染，而且需要同位素測定儀，因此難以切實推廣應用。無機磷測定法是1925年發(fā)明的方法，準確度不好，強酸污染環(huán)境等等，也不適合推廣應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定5'-核苷酸酶活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的5'-核苷酸酶診斷試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行5'-核苷酸酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明5'-核苷酸酶活性濃度測定方法原理如下
核苷單磷酸+水 5核苷酸酶核苷+磷酸根
磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸
+丙酮酸+ —氧化碳二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶異檸檬酸脫氫酶
D-異檸檬酸+輔酶
核苷單磷酸可以是腺苷單磷酸、肌苷單磷酸、尿苷單磷酸等。
這種方法應用5，-核苷酸酶(5'-Nucleotidase; EC3丄3.5)酶(偶)聯(lián)丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)、異檸檬酸脫氫酶(isocitratedehydrogenase; EC 1.1.1.41; EC 1.1丄42)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法。5，-核苷酸酶酶解核苷單磷酸反應產(chǎn)生磷酸根，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸羧化酶、異檸檬酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算5'-核苷酸酶的活性濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明5，-核苷酸酶診斷試劑較為理想
緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000 U/L
異檸檬酸脫氫酶 12000 U/L
核苷單磷酸 8 mmol/L
腺苷二磷酸 6 mmol/L
草酰乙酸 12mmol/L酮戊二酸 12 mmol/L
本發(fā)明的5'-核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、異檸檬酸脫氫酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、異檸檬酸脫氫酶。還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、異檸檬酸脫氫酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶。還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、異檸檬酸脫氫酶、核苷單磷酸、腺苷二磷
酸、草酰乙酸、酮戊二酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定5'-核苷酸酶活性濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一
本實施例的5'-核苷酸酶診斷試劑為單試劑，三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶丙酮酸羧化酶
核苷單磷酸
腺苷二磷酸草酰乙酸
包括
100 mmol/L500 mmol/L0.25 mmol/L6000 U/L10000U/L8 mmol/L6 mmol/L12 mmol/L酮戊二酸 12 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用
前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始吸光
度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測5'-核苷酸酶樣
品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大
約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值一4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析
儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算山5'-核苷酸酶的
活性濃度大小。
實施例二
本實施例的5'-核苷酸酶診斷試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 核苷單磷酸 腺苷二磷酸
草酰乙酸 酮戊二酸 試齊U 2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸羧化酶
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 8 mmol/L 6 mmol/L 12 mmol/L 12 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測5'-核苷酸酶樣 品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)， 延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5'-核苷酸酶的 活性濃度大小。 實施例三
本實施例的5，-核苷酸酶診斷試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 核苷單磷酸 腺苷二磷酸 草酰乙酸 酮戊二酸
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 8 mmol/L 6 mmol/L 12 mmol/L 12 mmol/L
穩(wěn)定劑
異檸檬酸脫氫酶 試劑3
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
100mmol/L
穩(wěn)定劑
500 mmol/L
丙酮酸羧化酶
6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定5，-核苷酸酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:， 反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長 405nm，被測5，-核苷酸酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢 測時間2分鐘左右，理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5'-核苷酸酶的
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能 達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析 儀器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0010; 吸光度時間反應曲線應呈直線下降；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可 達300U/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±7%;試劑測試的 精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV)《2 %;試劑的靈敏度可達0.0003 ±0.0001 AA/min/U/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足 以便于推廣應用。
權(quán)利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的5’-核苷酸酶活性濃度測定方法，其方法原理如下核苷單磷酸+水 <u>5核苷酸酶</u> 核苷+磷酸根磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸 <u>丙酮酸羧化酶</u> 腺苷三磷酸 +丙酮酸+二氧化碳二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶 <u>異檸檬酸脫氫酶</u> D-異檸檬酸+輔酶核苷單磷酸可以是腺苷單磷酸、肌苷單磷酸、尿苷單磷酸等。將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5’-核苷酸酶的活性濃度大小結(jié)果。
2. -核苷酸酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液20——500 mmol/L穩(wěn)定劑1———4000 mmol/L還原型輔酶0.1———0.35 mmol/L丙酮酸羧化酶1000———訓OO U/L異檸檬酸脫氫酶1000—~"80000 U/L核苷單磷酸l一50 mmol/L腺苷二磷酸l一50 mmol/L草酰乙酸1—50 mmol/L酮戊二酸1—50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在 此范圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、異檸檬酸脫氫酶、核苷單磷酸、腺苷一.磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、異檸檬酸脫氫酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、異檸檬酸脫氫酶組成。還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、異檸檬酸脫氫酶、核苷單磷酸、腺苷—磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、異檸檬酸脫氫酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶組成。還原型輔酶、丙酮酸羧化酶、異檸檬酸脫氫酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)'定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100°/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種,
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的5’-核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定5’-核苷酸酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、核苷單磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸、丙酮酸羧化酶、異檸檬酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出5’-核苷酸酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464294SQ20071019149
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司