專利名稱：鉀(離子)診斷/測(cè)定試劑盒及鉀(離子)的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鉀(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定鉀 (離子)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腎小球疾病、腎功能衰弱、糖尿病酮癥中毒、腎上腺皮質(zhì)功能減退等。當(dāng)
血鉀高達(dá)7.5 mmol/L或以上時(shí)病人將出現(xiàn)心律失常，應(yīng)考慮確定適當(dāng)?shù)闹委?方案。血清鉀超過10 mmol/L時(shí)，即可發(fā)生心室纖顫，心臟停搏而死亡。高 鉀使心臟停跳于舒張期。
目前鉀測(cè)定常用的方法有同位素稀釋質(zhì)譜法、中子活化法、火焰光度計(jì) 法、化學(xué)測(cè)定法、離子選擇電極法、原子分光光度法、酶動(dòng)力學(xué)法。
火焰光度法1950年開始使用并一直沿用至今的火焰光度法檢測(cè)血清、尿 液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，是一種發(fā)射光譜分析法。測(cè)定方法分為內(nèi)標(biāo) 準(zhǔn)法和外標(biāo)準(zhǔn)法兩種。外標(biāo)準(zhǔn)法操作誤差較大， 一般不采用。現(xiàn)在主要使用 內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)法，即標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)液采用加進(jìn)相同濃度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)元素鋰或銫進(jìn)行 測(cè)定。操作時(shí)，將含鋰的溶液作為稀釋液，同時(shí)測(cè)定K、 Na和Li的濃度，以 標(biāo)本與標(biāo)準(zhǔn)液的Na/Li與K/Li比值，計(jì)算Na、 K濃度。由于血清稀釋倍數(shù)大， 血清蛋白質(zhì)粘性的影響幾乎可忽略不計(jì)。
化學(xué)測(cè)定法主要利用復(fù)環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱為冠醚， 均為離子載體進(jìn)行測(cè)定，由于大環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)有空穴，分子內(nèi)部氧原子有未共用 電子對(duì)可與金屬離子結(jié)合，根據(jù)空穴大小，可選擇性結(jié)合不同直徑的金屬離 子，從而可達(dá)到測(cè)出離子濃度的目的。測(cè)定血清K， 一般采用普通冠醚陰離子染料進(jìn)行比色定量。
離子選擇電極法ISE法是采用靈敏的特定專用電極，在專用儀器上進(jìn)行
血清和尿等體液的K+、 Na+的測(cè)定，因標(biāo)本用量少，快速準(zhǔn)確，幾乎有取代其 他方法的趨勢(shì)。其儀器測(cè)定原理是離子選擇電極與參比電極組合浸泡在待測(cè)
標(biāo)本溶液中，進(jìn)行檢測(cè)。目前已有的電極種類為①玻璃膜電極，感應(yīng)材料
為玻璃薄膜的有pH電極、K+電極和Na+電極；②固相膜電極，由難溶性金屬物 質(zhì)加壓成型，以固體膜或單日膜作為感應(yīng)膜的電極有C1—電極和F—電極；③液 態(tài)膜電極，將環(huán)氧樹脂或內(nèi)裝聚氯乙稀為感應(yīng)膜的Ca"電極；④用纈氨霉素膜 制成的K+電極。上述電極均有一定的壽命，因?yàn)殡姌O使用一段時(shí)間就會(huì)自動(dòng)
老化，有效期長短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于檢測(cè)血清K+、 Na+，操作繁雜，誤 差較大，不及火焰光度法簡(jiǎn)便。
鉀測(cè)定的決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法及中子活化法。WHO推薦的方法 是火焰光度計(jì)法。目前離子選擇電極法應(yīng)用較為普遍，但是電極成本昂貴。
酶測(cè)定法和火焰光度計(jì)法或離子選擇電極法均有較好的一致性，且抗干擾 性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，彌補(bǔ)了生化分析儀不能同時(shí)測(cè)定鉀鈉的不足。有較好的分 析性能，易于自動(dòng)化，在臨床化學(xué)分析中必定取代火焰光度計(jì)法成為常規(guī)分 析項(xiàng)目。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原型 煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測(cè)定鉀(離 子)濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的鉀(離子)診斷/ 測(cè)定試劑盒，釆用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行鉀(離子)濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得 到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明鉀(離子)濃度測(cè)定方法原理如下
腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶/&+ 腺苷三磷酸+
丙酮酸
丙酮酸+輔酶八+氧丙酮酸氧化酶過氧化氫+ 二氧化碳+
乙酰輔酶A
過氧化氫+還原型輔酶 NADH過氧化物酶 輔酶+ 2水 這種方法應(yīng)用需要鉀離子激活的丙酮酸激酶(pyruvic kinase; EC 2.7丄40) 酶(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、 NADH過氧化物酶 (NADH peroxidase; EC 1.11.1.1; EC Lll丄2)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)/速率比色 法。在鉀(離子)的激活下，丙酮酸激酶酶解磷酸烯醇式丙酮酸反應(yīng)產(chǎn)生丙 酮酸，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶的作用，最終將 還原型輔酶(在340nrn處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)， 從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測(cè)量340nm處 吸光度下降的速度，可以測(cè)算鉀(離子)的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明鉀(離子)診斷/測(cè)定試劑 盒較為理想
緩沖液 100 mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸激酶 6000 U/L
丙酮酸氧化酶 8000 U/LNADH過氧化物酶 10000 U/L
腺苷二磷酸 3 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸 3 mmol/L
輔酶A 4 mmol/L
本發(fā)明的鉀(離子)診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH過 氧化物酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 輔酶A。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶。 還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可 以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 輔酶A。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶。 還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定鉀(離子)濃度的方法，其還原 型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一
本實(shí)施例的鉀(離子)診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸激酶 6000 U/L
丙酮酸氧化酶 8000 U/L
NADH過氧化物酶 10000 U/L
腺苷二磷酸 3 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸 3 mmol/L
輔酶A 4 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度
1.8±0.7，測(cè)試主波長340nm，測(cè)試副波長405nm，被測(cè)鉀(離子)樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約2分鐘 左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測(cè)主波長340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出鉀(離子)的濃度大
實(shí)施例二
本實(shí)施例的鉀(離子)診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 腺苷二磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸
輔酶A 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 丙酮酸激酶 丙酮酸氧化酶 NADH過氧化物酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度
10Ommol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 3 mmol/L
3 mmol/L
4 mmol/L
100 mmol/L 500畫ol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000 U/L1.8±0.7，測(cè)試主波長340nm，測(cè)試副波長405nm，被測(cè)鉀(離子)樣品與試 劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí) 間大約2分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測(cè)主波長340rnn吸光度下降的速度，從而測(cè)算出鉀(離子)的濃度大 小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的鉀(離子)診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 腺苷二磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸
輔酶A 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸氧化酶 NADH過氧化物酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 丙酮酸激酶
100mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L
簡(jiǎn)mmol/L 50 mmol/L 0,25 mmol/L 3 mmol/L
3 mmol/L
4 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測(cè)定鉀(離子)濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)
間10分鐘，起始吸光度1，8±0.7，測(cè)試主波長340nm，測(cè)試副波長405nm，被測(cè)鉀(離子)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約2分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出鉀(離子)的濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.016;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下降曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R》0.99)線形范圍可達(dá)10mmol/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過土 7%;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.016 ± 0.008△A/mmol/L—本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應(yīng)用。
ii
權(quán)利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鉀(離子)濃度測(cè)定方法，其方法原理如下腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸 <u>丙酮酸激酶/K</u><u>+</u> 腺苷三磷酸+ 丙酮酸丙酮酸+輔酶A+氧 <u>丙酮酸氧化酶</u> 過氧化氫+二氧化碳+ 乙酰輔酶A過氧化氫+還原型輔酶 <u>NADH過氧化物酶</u> 輔酶+2水將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出鉀(離子)的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種鉀(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液20-500 mmol/L穩(wěn)定劑1-4000 mmol/L還原型輔酶0.1-0.35mmol/L丙酮酸激酶1000——80000 U/L丙酮酸氧化酶1000——80000 U/LNADH過氧化物酶1000——80000 U/L腺苷二磷酸1-50 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸1-50 mmol/L 輔酶A1-50 mmol/L 試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧 化物酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧 化物酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A組成雙劑試劑；試劑l， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶 A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH 過氧化物酶組成。還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化 物酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧 化物酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A組成多劑試劑；試劑l， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶 A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶組 成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶組成。還原型輔酶、丙酮酸 激酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括 穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鉀(離子)診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定鉀(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、輔酶A、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測(cè)算出鉀(離子)的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101464299SQ20071019180
公開日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
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