專利名稱：異檸檬酸測定試劑盒及異檸檬酸的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異檸檬酸測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定異檸檬 酸濃度的方法，屬于食品檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
異檸檬酸isocitricacid是檸檬酸的異構(gòu)體，雖然量少，但廣泛存在于生 物界。在落地生根屬(Bryophyllum)等多汁植物的葉、或懸鉤子類中特別 多，生物能夠利用的是D型。是三羧酸循環(huán)中的一個成分。檸檬酸在鳥頭 酸酶的作用下可逆地生成異檸檬酸和順鳥頭酸。在異檸檬酸脫氫酶(EC 1丄1.41; EC 1丄1.42)的作用下變成a-酮戊二酸，在異檸檬酸裂合酶 (isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下變成琥珀酸與乙醛酸。
中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，GBT16771-1997，規(guī)定了橙、柑、桔汁及其 飲料中D-異檸檬酸的測定方法一紫外分光光度法。該方法適用于判定橙、 柑、桔濃縮汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5%的橙、柑、桔汁飲料的總 D-異檸檬酸的測定。其測定原理異檸檬酸脫氫酶isocitrate dehydrogenase 有兩種類型以NAD為輔酶的酶(EC1. 1. 1. 41)和要NADP為輔酶 的酶(EC1. 1.1. 42)，兩者催化同一反應(yīng)。
異檸檬酸+NAD(P)+^^ oc-酮戊二酸十C02+NAP(P)H + H^ 在異檸檬酸脫氫酶催化下，樣品中的D-異檸檬酸鹽與NAD或NADP作用， 生成NADH或NADPH的含量，相當(dāng)于D-異檸檬酸鹽的量。在波長340nm 處測定吸光度，確定樣品中總D-異檸檬酸的含量。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶) 聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型 輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定異檸檬酸濃度的方法，同 時，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的異檸檬酸測定試劑盒，釆用該試劑 不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn)行異檸檬酸濃 度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明異檸檬酸濃度測定方法原理如下
D-異檸檬酸+輔酶異檸檬酸脫氫酶二氧化碳+
酮戊二酸+還原型輔酶 酮戊二酸+氨離子+過氧化氫谷氨酸氧化酶L-谷氨酸+
氧+水
L-谷氨酸+水+輔酶谷氨酸脫氫酶氨離子+酮戊二酸+
還原型輔酶
這種方法應(yīng)用異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase; EC 1.1.1.41; EC 1.1.1.42)酶(偶)聯(lián)谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11)、谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase; EC 1.4.1.2; EC 1.4.1.3)
酶促反應(yīng)速率比色法。異檸檬酸脫氫酶，作為作用酶，酶解異檸檬酸反應(yīng) 產(chǎn)生酮戊二酸，同時也是顯色酶，將輔酶還原成為還原型輔酶；再通過(偶) 聯(lián)合谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶的作用，谷氨酸氧化酶也作為作用酶， 利用酮戊二酸產(chǎn)生谷氨酸；谷氨酸脫氫酶即作為循環(huán)酶又是顯色酶， 一面 將谷氨酸變回酮戊二酸，使之不斷循環(huán)利用； 一面又將輔酶(在340nm處 沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測 定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算異檸檬酸的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明異檸檬酸測定試劑盒 較為理想
緩沖液100 mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
異檸檬酸脫氫酶10000U/L
谷氨酸氧化酶12000 U/L
谷氨酸脫氫酶12000U/L
過氧化氫10 mmol/L
氨離子10 mmol/L
本發(fā)明的異檸檬酸測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸
脫氫酶、過氧化氫、氨離子。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體
試劑，直接使用。氨離子可以是任何氨鹽，如氯化氨。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、氨離子。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶。
輔酶、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、過氧化氫、氨離子在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、氨離子。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶。 試齊U 3
緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶。
輔酶、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、過氧化氫、氨 離子在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀 態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定異檸檬酸濃度的方法，其輔酶 可以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的異檸檬酸測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
異檸檬酸脫氫酶 10000 U/L
谷氨酸氧化酶 12000 U/L
谷氨酸脫氫酶 12000 U/L過氧化氫 10mmol/L 氨離子 10mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光 度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與 試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約2 分鐘左右，檢測時間3分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出異檸檬酸的濃度 大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的異檸檬酸測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
輔酶
過氧化氫 氨離子
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
異檸檬酸脫氫酶 谷氨酸氧化酶
10Ommol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 10 mmol/L 10 mmol/L
100 mmol/L 500醒ol/L 10000U/L 12000 U/L谷氨酸脫氫酶
12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光
度《0.1,測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與
試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延
遲時間大約2分鐘左右，檢測時間3分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析
儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的異檸檬酸測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
過氧化氫 10mmol/L 氨離子 10mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
100mmol/L
穩(wěn)定劑
500 mmol/L
谷氨酸氧化酶
12000 U/L
谷氨酸脫氫酶
12000 U/L
試劑3
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
100 mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L
異檸檬酸脫氫酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定異檸檬酸濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng) 時間IO分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測異檸檬酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間3分鐘左 右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出異檸檬酸的濃度 大小。
申請人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的測定方法均能達(dá)到 本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析 儀器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0012; 吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測有效(RX).99)線 形范圍可達(dá)9.6mmol/L;試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過士5%; 試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《3.5%;試劑的靈敏度 可達(dá)0.1022 ± 0.051 AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形 范圍寬廣，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法的異檸檬酸的濃度測定方法，其方法原理如下D-異檸檬酸+輔酶 <u>異檸檬酸脫氫酶</u> 二氧化碳+ 酮戊二酸+還原型輔酶酮戊二酸+氨離子+過氧化氫 <u>谷氨酸氧化酶</u> L-谷氨酸+ 氧+水L-谷氨酸+水+輔酶 <u>谷氨酸脫氫酶</u> 氨離子+酮戊二酸+ 還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出異檸檬酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種異檸檬酸測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20———500 mmol/L穩(wěn)定劑1——4000 mmol/L輔酶1——6 mmol/L異檸檬酸脫氫酶1000-——80000 U/L谷氨酸氧化酶1000-——80000 U/L谷氨酸脫氫酶1000-——80000 U/L過氧化氫1—50 mmol/L氨離子1——50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在 此范圍外，試劑仍會反應(yīng)作用；其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。氨離子可以是任何氨鹽，如氯化氨。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫 氫酶、過氧化氫、氨離子組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫 氫酶、過氧化氫、氨離子組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 輔酶、過氧化氫、氨離子組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸 脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、 谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、過氧化氫、氨離子在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異擰檬酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫 氫酶、過氧化氫、氨離子組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 輔酶、過氧化氫、氨離子組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧 化酶、谷氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫 酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、過氧 化氫、氨離子在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定 齊IJ 1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的異檸檬酸測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定異檸檬酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、過氧化氫、氨離子、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464308SQ20071019210
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司