專利名稱：鋰診斷/測定試劑盒及鋰濃度測定方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種鋰診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鋰濃度的方法，屬于醫(yī)學/工業(yè)/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
20世紀40年代，Cade首次用鋰鹽治療躁狂癥成功，總有效率約7()0%，鋰鹽對躁狂和抑郁的復發(fā)有預防作用，也用于治療分裂情感性精神病。另外，鋰鹽可使雙相障礙維持治療階段的自殺行為減少86%，而當停用鋰鹽后，自殺危險性會增加7.5倍。當血鋰濃度達到或超過1.5mmol/L,會出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀，血鋰濃度3.0mmo1 / L以上可危及生命。
近幾年，臨床實驗室多數(shù)方法學都有了新的發(fā)展，但鋰的測定方法基本維持火焰原子發(fā)射法、火焰原子吸收法及離子選擇電極法。原子吸收的方法是將稀釋的標本吸入乙炔火焰中，利用空心陰極元素燈光源發(fā)出被測元素的特征輻射光，為火焰原子化器產(chǎn)生的樣品蒸汽中的待測元素基態(tài)原子所吸ifc鋰在波長670.8 nm處的被吸光的特征輻射光的大小與標本中的鋰濃度成正比。但目前國內(nèi)的臨床實驗室沒有統(tǒng)一的實驗方法和實驗操作規(guī)程，也很難在精神病醫(yī)院的實驗室中查找到其使用情況。
自然界中無游離鋰，因此實際指鋰離子或鋰鹽，而碳酸鋰是最重要的鋰化物。碳酸鋰被用于陶瓷釉料的生產(chǎn)、特種玻璃、鋁的熔煉和鋼鐵鑄造粉末。氫氧化鋰和氯化鋰應用在潤滑劑、空調(diào)和干燥系統(tǒng)中。丁基鋰、鋰金屬、特種無機物和特種有機物，被用于制藥、合成橡膠等領域。鋰是一種稀有金屬，鋰電池就以它為主要原料，航空航天工業(yè)也離不開鋰。金屬鋰與鋰合金在核能發(fā)電、輕質(zhì)高比強合金、輕金屬焊接等諸多領域都有著廣闊的開發(fā)利用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定鋰濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的鋰診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行鋰濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。本發(fā)明鋰濃度測定方法原理如下
肌醇-l-磷酸+水肌醇-1-磷酸酶/1^2+/0+肌醇+磷酸根磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶二氧化碳+
磷酸烯醇式丙酮酸+水二氧化碳+還原型輔酶 甲酸脫氫酶 甲酸+輔酶這種方法應用能被鋰抑制活性的肌醇-l-磷酸酶(inositol-l-phosphase; EC3丄3.25)酶(偶)聯(lián)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase; EC 4.1.1.31)、甲酸脫氫酶(Formate dehydrogenase; EC 1.2.1.2;EC 1.2丄43)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法/速率比色法。肌醇-l-磷酸酶(需要鎂離子激活其活性，鋰離子能抑制鎂離子的激活作用)酶解肌醇-l-磷酸反應產(chǎn)生磷酸根，再通過(偶)聯(lián)合磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度，比較對照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，可以測算鋰的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明鋰診斷/測定試劑盒較為
緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
肌醇-l-磷酸酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
甲酸脫氫酶
氯化鎂
肌醇-l-磷酸
草酰乙酸
氯化鎂可以用其它鎂鹽取代；如硫酸鎂等,
100 mmol/L500 mmol/L0.25 mmol/L10000U/L10000U/L10000U/L0.6 mmol/L8 mmol/L12 mmol/L
本發(fā)明的鋰診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸。
試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶。
還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶。試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌醇-l-磷酸酶。還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定鋰濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一
本實施例的鋰診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
100 mmol/L
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
肌醇-l-磷酸酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
甲酸脫氫酶
氯化鎂
肌醇-l-磷酸
500 mmol/L0.25 mmol/L10000U/L10000 U/L10000U/L0.6 mmol/L8 mmol/L
草酰乙酸 12mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用
前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度
1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測對照及鋰樣品與試
劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分
鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
分別加入對照及樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置
于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，比較對照及
鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測算出鋰的濃度大小。
實施例二
本實施例的鋰診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
100mmol/L
穩(wěn)定劑
50 mmol/L還原型輔酶
氯化鎂 肌醇-l-磷酸
草酰乙酸
0.25 mmol/L
0.6 mmol/L
8 mmol/L
12 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
肌醇-l-磷酸酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 甲酸脫氫酶
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 10000U/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度 1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測對照及鋰樣品與試 劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時 間大約l分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
分別加入對照及樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置 于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，比較對照及 鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測算出鋰的濃度大小。 實施例三
本實施例的鋰診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
100 mmol/L
50 mmol/L還原型輔酶 氯化鎂 肌醇-l-磷酸 草酰乙酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 甲酸脫氫酶
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
肌醇-l-磷酸酶 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體:
0.25 mmol/L 0,6 mmol/L 8 mmol/L 12 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 10000U/L
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L
:試劑，可以直接使用。
測定鋰濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間10 分鐘，起始吸光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測 對照及鋰樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為 負反應(下降反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
分別加入對照及樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置 于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，比較對照及 鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測算出鋰的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的測定方法均能達到本 發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
ii總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀
器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.032;吸光 度時間反應曲線應呈直線上升；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達0.55
U/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±7%;試劑測試的精密度(重
復性)的變異系數(shù)(CV) 《4 %;試劑的靈敏度可達0.012 ± 0.006 △A/min/U/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣 應用。
權(quán)利要求
1. 一種利用能被鋰抑制活性的酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鋰濃度測定方法，其方法原理如下肌醇-1-磷酸+水 <u>肌醇-1-磷酸酶/Mg</u><u>2+</u><u>/Li</u><u>+</u> 肌醇+磷酸根磷酸根+草酰乙酸 <u>磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶</u> 二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水二氧化碳+還原型輔酶 <u>甲酸脫氫酶</u> 甲酸+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，比較對照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，測算出鋰的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種鋰診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20———500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-4000 mmol/L還原型輔酶0.1———0.35 mmol/L肌醇-l-磷酸酶1000-——80000 U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶iooo-——畫00 U/L甲酸脫氫酶1000-——80000 U/L氯化鎂0.1——50 mmol/L肌醇-l-磷酸1—50 mmol/L草酰乙酸1一50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此 范圍外，試劑仍會反應作用；其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。氯化鎂可以用其它鎂鹽取代。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鋰診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鋰診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸組成雙劑試劑；試 劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸、草酰乙 酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶、甲酸脫氫酶組成。還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷 酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸在試劑1 或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鋰診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸組成多劑試劑；試 劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸、草酰乙 酸組成；試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫 氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌醇-l-磷酸酶組成。還原型輔 酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、 肌醇-l-磷酸、草酰乙酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鋰診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 14000 mmol/L或0.1°/。-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate )、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種,
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用能被鋰抑制活性的酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鋰診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鋰濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/工業(yè)/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-1-磷酸、草酰乙酸、肌醇-1-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過分別將對照及鋰樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，比較對照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測算出鋰的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464313SQ20071019210
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司