專利名稱：鉀(離子)診斷/測定試劑盒及鉀(離子)的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鉀(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鉀 (離子)濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腎小球疾病、腎功能衰弱、糖尿病酮癥中毒、腎上腺皮質(zhì)功能減退等。當
血鉀高達7.5 mmol/L或以上時病人將出現(xiàn)心律失常，應(yīng)考慮確定適當?shù)闹委?方案。血清鉀超過10 mmol/L時，即可發(fā)生心室纖顫，心臟停搏而死亡。高 鉀使心臟停跳于舒張期。
目前鉀測定常用的方法有同位素稀釋質(zhì)譜法、中子活化法、火焰光度計 法、化學測定法、離子選擇電極法、原子分光光度法、酶動力學法。
火焰光度法1950年開始使用并一直沿用至今的火焰光度法檢測血清、尿 液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，是一種發(fā)射光譜分析法。測定方法分為內(nèi)標 準法和外標準法兩種。外標準法操作誤差較大， 一般不采用?，F(xiàn)在主要使用 內(nèi)部標準法，即標本及標準液采用加進相同濃度的內(nèi)部標準元素鋰或銫進行 測定。操作時，將含鋰的溶液作為稀釋液，同時測定K、 Na和Li的濃度，以 標本與標準液的Na/Li與K/Li比值，計算Na、 K濃度。由于血清稀釋倍數(shù)大， 血清蛋白質(zhì)粘性的影響幾乎可忽略不計。
化學測定法主要利用復環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱為冠醚， 均為離子載體進行測定，由于大環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)有空穴，分子內(nèi)部氧原子有未共用 電子對可與金屬離子結(jié)合，根據(jù)空穴大小，可選擇性結(jié)合不同直徑的金屬離子，從而可達到測出離子濃度的目的。測定血清K, 一般采用普通冠醚陰離子
染料進行比色定量。
離子選擇電極法ISE法是采用靈敏的特定專用電極，在專用儀器上進行 血清和尿等體液的K+、 Na+的測定，因標本用量少，快速準確，幾乎有取代其 他方法的趨勢。其儀器測定原理是離子選擇電極與參比電極組合浸泡在待測 標本溶液中，進行檢測。目前已有的電極種類為①玻璃膜電極，感應(yīng)材料 為玻璃薄膜的有pH電極、K+電極和Na+電極；②固相膜電極，由難溶性金屬物
質(zhì)加壓成型，以固體膜或單日膜作為感應(yīng)膜的電極有cr電極和F—電極；③液
態(tài)膜電極，將環(huán)氧樹脂或內(nèi)裝聚氯乙稀為感應(yīng)膜的Ca"電極；④用纈氨霉素膜 制成的K+電極。上述電極均有一定的壽命，因為電極使用一段時間就會自動 老化，有效期長短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于檢測血清K+、 Na+，操作繁雜，誤 差較大，不及火焰光度法簡便。
鉀測定的決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法及中子活化法。WHO推薦的方法 是火焰光度計法。目前離子選擇電極法應(yīng)用較為普遍，但是電極成本昂貴。
酶測定法和火焰光度計法或離子選擇電極法均有較好的一致性，且抗干擾 性強，穩(wěn)定性好，彌補了生化分析儀不能同時測定鉀鈉的不足。有較好的分 析性能，易于自動化，在臨床化學分析中必定取代火焰光度計法成為常規(guī)分 析項目。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型 煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定鉀(離子)濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的鉀(離子)診斷/ 測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分 析儀上進行鉀(離子)濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得 到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明鉀(離子)濃度測定方法原理如下-
色氨酸+水 色氨酸酶^+ 丙酮酸+氨離子+ n引哚 丙酮酸+輔酶八+氧丙酮酸氧化酶過氧化氫+ 二氧化碳+
乙酰輔酶A
過氧化氫+還原型輔酶 NADH過氧化物酶輔酶+ 2水 這種方法應(yīng)用需要鉀離子激活的色氨酸酶(tryptophanase; EC4丄99.1)酶 (偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、 NADH過氧化物酶(NADH Peroxidase; EC l.ll丄l; EC 1.1L1.2)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測/速率比色法。在鉀 (離子)的激活下，色氨酸酶酶解色氨酸反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸，再通過(偶)聯(lián) 合丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處 有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔 酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可 以測算鉀(離子)的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明鉀(離子)診斷/測定試劑 盒較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L色氨酸酶 6000 U/L丙酮酸氧化酶 8000 U/L
NADH過氧化物酶 10000 U/L
色氨酸 10mmol/L
輔酶A 4 mmol/L
本發(fā)明的鉀(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶、色氨酸、輔酶A。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸、輔酶A。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶。還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶、色氨酸、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸、輔酶A。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶。試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶。
還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶、色氨酸、輔酶A在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定鉀(離子)濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一
本實施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
色氨酸酶 6000 U/L
丙酮酸氧化酶 8000 U/L
NADH過氧化物酶 10000 U/L
色氨酸 10mmol/L輔酶A 3 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm,測試副波長405nm，被測鉀(離子)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大
小,
;施例.
本實施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 10Ommol/L穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶
輔酶A
0.25 mmol/L
10 mmol/L
3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L
一' 6000 U/L
,0 U/L
丙酮酸氧化酶NADH過氧化物酶
10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鉀(離子)樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大
/ 、,
實施例三
本實施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶
輔酶A
0.25 mmol/L10 mmol/L3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L
丙酮酸氧化酶
NADH過氧化物酶
8000 U/L10000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
100 mmol/L500 mmol/L6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定鉀(離子)濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鉀(離子)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.026;吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(R^O.99)線形范圍可達10mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過士5 %;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達0.015 ± 0.008AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應(yīng)用。
ii
權(quán)利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鉀(離子)濃度測定方法，其方法原理如下色氨酸+水 <u>色氨酸酶/K</u><u>+</u> 丙酮酸+氨離子+吲哚丙酮酸+輔酶A+氧 <u>丙酮酸氧化酶</u> 過氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A過氧化氫+還原型輔酶 <u>NADH過氧化物酶</u> 輔酶+2水將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出鉀(離子)的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種鉀(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20——500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-4000 mmol/L還原型輔酶0.1——0.35 mmol/L色氨酸酶1000———80000 U/L丙酮酸氧化酶1000———80000 U/LNADH過氧化物酶1000-——80000 U/L色氨酸1—50 mmol/L輔酶A1_50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶、色氨酸、輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶、色氨酸、輔酶A組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸、輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶組成。還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶、色氨酸、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶、色氨酸、輔酶A組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸、輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶組成。還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶、色氨酸、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑14000 mmol/L或0.1°/。-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate )、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鉀(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鉀(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、色氨酸、輔酶A、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、NADH過氧化物酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464398SQ20071019219
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司